生物制药复习

1、中国几大药源是什么？三大药源：化学药、中药、生物药:生化药物、微生物药物、生物制品

2、生物药物、生物制药定义

生物药物：泛指包括生物制品在内的生物体的初级和次极代谢产物或生物体的某一组成部分，甚至整个生物体用作诊断和治疗疾病的医药品。生物技术制药：采用现代生物技术,借助某些微生物、植物、动物生产医药品。

3、生物药物分类：（1）重组DNA药物：应用重组DNA技术（包括基因工程技术和蛋白质工程技术）制造的基因重组多肽、蛋白质类治疗剂。（2）基因药物：以遗传物质DNA、RNA为物质基础制造的药物基因治疗、基因疫苗、反义药物、核酶等（3）天然生物药物（4）合成或半合成生物药物

4、几类抗生素的主要特性及生产菌种,了解提取工艺。

5、基因工程制药的主要程序？获得目的基因-组建重组质粒-构建基因工程菌-培养工程菌-产物分离纯化-除菌过滤-半成品检定-成品检定-包装

6、常用基因工程制药载体类型和特点？类型:PBV220①cIts857抑制子基因PL启动子同在一个载体上，可以转化任何菌株，以便选用蛋白酶活性较低的宿主细胞，使表达产物不易降解。②SD序列紧跟多克隆位点，便于插入带起始ATG的外源基因，可表达非融合蛋白；③强的转录终止信号可防止出现“通读”现象，有利于质粒-宿主系统的稳定；④整个质粒仅为3.66kb，有利于增加其拷贝数及容量，可以插入大片段外源基因；⑤PR 和PL启动子串联，可以增强启动作用、pET系列载体1、T7启动子专一性被T7 RNA聚合酶识别，而不被大肠杆菌RNA聚合酶识别。2、 T7 RNA聚合酶具专一性及高的合成进行性。3、表达宿主菌：大肠杆菌BL21 含有λ溶源的T7 RNA聚合酶基因。

7、质粒不稳定的类型或表现形式?原因⑴含质粒菌产生不含质粒子代菌的频率；质粒丢失率与宿主菌、质粒特性和培养条件有关。⑵两种菌比生长速率差异的大小。分类：（1）分裂不稳定：指工程菌分裂时出现一定比例不含质粒子代菌的现象（常见）。（2）结构不稳定：指外源基因从质粒上丢失或碱基重排、缺失所致工程菌性能的改变。

8、质粒稳定性的分析方法：样品-不含抗性标记抗生素、平板培养基--条件10-12h和100个菌落--含抗性标记抗生素、平板培养基--条件10-12h--统计生长菌落数。重复三次,计算比值(稳定性stability)

9、为了提高质粒稳定性，工程菌培养采用什么方法? 选择合适的宿主菌、选择合适的载体拷贝数、选择压力只能消除分裂不稳定性。、两阶段培养法菌体生长--诱导表达、调控环境参数- 温度、pH、培养基组分和溶解氧浓度、固定化

10、基因表达的宿主细胞分类？1、原核细胞：大肠杆菌、、枯草芽孢杆菌、链霉菌 2、真核细胞：酵母、丝状真菌、哺乳动物细胞

11、克隆真核基因的常用方法？逆转录法和化学合成法。一、逆转录法：逆转录法就是先分离纯化目的基因的 mRNA，再反转录成 cDNA，然后进行 cDNA 的克隆表达。⒈mRNA的纯化⒉ cDNA第一链的合成⒊ cDNA第二链的合成⒋ cDNA的克隆⒌将重组体导入宿主细胞：⒍ cDNA文库的鉴定：抗性基因失活法、噬菌斑颜色改变法⒎目的cDNA克隆的分离和鉴定：核酸探针杂交法、免疫反应鉴定法。二、化学合成法：较小的蛋白质或多肽的编码基因可以用化学合成法合成。必须知道目的基因的核苷酸顺序或目的蛋白质的氨基酸顺序。再按相应的密码子推导出DNA的核甘酸序列。用化学法合成目的基因DNA不同部位的两条链的寡核苷酸短片段，再退火成为两端形成粘性末端的DNA双链片段，然后将这些双链片段按正确的次序进行退火使连接成较长的DNA 片段，再用连接酶连接成完整的基因。

12、对基因工程菌发酵影响较大的几个因素？1、培养基的影响2、接种量的影响3、温度的影响：如重组人生长激素：30℃培养，产物可溶37℃培养，形成包涵体。4、溶解氧的影响5、诱导时机的影响6、pH的影响13、基因工程药物、肽图分析1、基因工程药物：A、胰岛素B、干扰素C、人白细胞介素-2 2、肽图分析：是用酶法或化学法降解目的蛋白质，对生成的肽段进行分离分析，它是检测蛋白质一级结构最有效的方法，该

技术灵敏高效是对基因工程药物的分子结构和遗传稳定性进行评价和验证的首先方法。常用HPLC和毛细管电泳

14、单克隆抗体、多克隆抗体、抗体、免疫佐剂、双功能抗体

单克隆抗体定义：由单一克隆B细胞杂交瘤产生的，只识别抗原分子某一特定抗原决定簇的特异性抗体。

多克隆抗体定义：指由不同B细胞克隆产生的针对抗原物质中多种抗原决定簇的多种抗体混合物。

抗体：机体受抗原刺激后产生的，并且能与该抗原发生特异性结合的免疫球蛋白。

免疫佐剂：由于不同个体对同一抗原的反应性不同，而且不同抗原产生免疫反应的能力也有强有弱，因此常常在注射抗原的同时，加入能增强抗原的抗原性物质，以刺激机体产生较强的免疫反应，这种物质称为

双功能抗体:也称双特性抗体，一种非天然性抗体。其结合抗原的两个臂具有不同的特异性。（VLA-VHB）

15、抗体是如何产生的？机体受抗原刺激后产生的，并且能与该抗原发生特异性结合的免疫球蛋白

16、目前常用的骨髓瘤细胞系来源？两种BALB/c小鼠和Lou大鼠 Y3 是Lou和YB2是Lou 其余是BALB

17、什么是福氏佐剂和不完全佐剂？佐剂的作用？常用佐剂：福氏完全佐剂、福氏不完全佐剂不完全福氏佐剂(常用):羊毛脂1份、石腊油5份，羊毛脂与石腊油的比例，视需要可调整为1：2～9（V/V）完全佐剂:在每毫升不完全佐剂加入1～20mg卡介苗佐剂的作用：免疫原性较弱、一般要加佐剂、半抗原应先制备免疫原，再加佐剂

18、细胞融合中，采用的融合剂是什么？规格和浓度如何？聚乙二醇是1、PEG: 分子量4000 的PEG是最常用的细胞融合剂 2、二甲基亚砜增加融合率 3、1ml 50%的PEG（无菌，预温37℃）在1min内滴完,静置90秒,时间一到,将事先准备的培养液一滴一滴加入,停止PEG作用

19、为什么融合细胞的选择培养采用HAT培养基？1、B淋巴细胞：HGPRT+， TK+==不能长期存活2、骨髓瘤细胞：HGPRT-， TK-==死亡3、杂交瘤细胞： HGPRT+， TK+==长期存活

20、单克隆抗体的制备原理和单克隆抗体的制备过程？原理：1、动物细胞融合2、动物细胞培养骨髓瘤细胞在体外培养能大量无限增殖，但不能分泌特异性抗体，而抗原免疫的B淋巴细胞能产生特异性抗体，但在体外不能无限增殖。将免疫脾细胞与骨髓瘤细胞融合后形成的杂交瘤细胞，继承了两个亲代细胞的特性，既具有骨髓瘤细胞能无限增殖的特性，又具有免疫B细胞合成和分泌特异性抗体的能力制备过程：1、细胞准备：1、将抗原射入小鼠体内，从小鼠脾脏中获得能产生抗体的B淋巴细胞2、实验室培养小鼠骨髓瘤细胞2、细胞融合：1、促溶剂：电激、聚乙二醇或灭活的仙台病毒2、融合细胞的种类：三类3、细胞培养：利用动物细胞培养技术培养融合后的细胞4、第一次筛选：筛选出杂交瘤细胞5、第二次筛选：筛选出能产生特异性抗体的杂交瘤细胞6、扩大培养：1.体外培养：从细胞培养液中提取单克隆抗体2、体内培养：从小鼠腹水中提取单克隆抗体

21、杂交瘤细胞的克隆化方法？克隆化:是指单个细胞通过无性繁殖而获得细胞集团的整个培养过程。常用克隆化方法：有限稀释法和软琼脂平板法有限稀释法：把杂交瘤细胞悬液稀释后，加入到96孔板，使每孔中在理论上只含有一个细胞。第一次克隆化时也要应用HT培养液，以后的克隆化可用不含HT的RPMI 1640培养液。软琼脂法：在培养液中加入0.5%的琼脂糖凝胶，细胞分裂后形成小球样团块，由于培养基是半固体状态，可用吸管吸出，移入96孔板培养。

22、鼠源单克隆抗体改造的目的和类型？目的：降低免疫源性，降低相对分子量类型：人-鼠嵌合抗体、改性抗体、小分子抗体、双功能抗体

23、噬菌体抗体库的生产过程和特点？定义：将体外克隆的抗体基因片段插入噬菌体载体，转染工程细菌进行表达，然后用抗原筛选即可获得特异的单克隆噬菌体抗体。生产过程：⒈获取目的基因⒉克隆⒊淘筛⒋表达与鉴定特点:⒈模拟天然全套抗体库⒉避开了人工免疫和杂交瘤技术⒊可获得高亲和力的人源化抗体

24、常用生产用动物细胞种类?三种1原代细胞2二倍体细胞系3转化细胞系4工程细胞系（融合或重组）

25、真核细胞基因在动物中表达的载体类型？1、PBV220系统国内使用最多的载体2、PBG-2是PBV-220系统衍生的便于产物纯化的融合表达载体3、PET系列（真核基因在大肠杆菌中的表达形式1、以融合蛋白的形式表达药物基因2、以非融合蛋白的形式表达药物基因3、分泌型表达药物基因）

26、DHFR-MTX高效表达系统的原理。通过强化基因扩增高效表达外源基因

27、生产用的工程细胞必须建立哪两个细胞库？⒈原始细胞库贮存时须有该细胞的详细挡案，包括：①该细胞系的历史②该细胞系的特性③对各种有害因子的检查结果⒉生产用细胞从原始细胞库来的，或从单一安瓶来，或从多个安瓶来即刻混合，经培养扩增再分装储存形成细胞库。需建挡案，进行无菌性无细胞交叉污染的检查。需确定最高使用的传代数。

28、动物细胞大规模培养的方法有哪些？各自的特点是什么？1.悬浮培养：悬浮培养即让细胞自由地悬浮于培养基内生长增殖.它适用于一切种类的非贴壁依赖性细胞(悬浮细胞),也适用于兼性贴壁细胞.该培养方法的优点是操作简便,培养条件比较均一,传质和传氧较好,容易扩大培养规模,在培养设备的设计和实际操作中可借鉴许多有关细菌发酵的经验.不足之处是由于细胞体积较小,较难采用灌流培养(perfusion culture ),因此细胞密度一般较低.2.贴壁培养：贴壁培养是必须让细胞贴附在某种基质上生长繁殖的培养方法.它适用于一切贴附依赖性细胞(贴壁细胞),也适用于兼性贴壁细胞.该方法的优缺点与悬浮培养正好相反,优点是适用的细胞种类广(因为生产中所使用的细胞绝大多数是贴壁细胞),较容易采用灌流培养的方式使细胞达到高密度;不足之处是操作比较麻烦,需要合适的贴附材料和足够的面积,培养条件不易均一,传质和传氧较差.3.贴壁—悬浮培养：微载体培养既可创造相当大的贴附面积供细胞贴附生长增殖,满足了绝大多数细胞的基本要求,又由于载体的体积很小,比重较轻,在轻度搅拌下即可携带细胞自由地悬浮在培养基内,充分发挥了悬浮培养的一切优点.

29、培养动物细胞常用的几种生物反应器及适用于哪些种类细胞的培养。1.搅拌式生物反应器适用悬浮细胞培养、微载体培养、微囊培养及结团培养。

2.气升式生物反应器主要用于悬浮细胞的分批培养

3.中空纤维式生物反应器既适用贴壁细胞培养，也适用悬浮细胞培养。细胞的密度最高可达109/ml数量级。

4.透析袋或膜式生物反应器既可培养贴壁细胞，也可培养悬浮细胞。

优点：使细胞达到很高密度；操作可随意组合；分离提纯。

5.固定床或流化床式生物反应器通气搅拌与固定床结合既可培养贴壁细胞又可培养悬浮细胞。

30、连续式培养和灌流培养有什么不同？灌流式培养与连续式操作的不同之处在于取出部分条件培养基时，绝大部分细胞均保留在反应器内，而连续培养在取培养物时同时也取出了部分细胞。

31、疫苗的类型有哪些？A、按疫苗的材料可分为：1、细菌性疫苗：霍乱疫苗、伤寒疫苗、卡介苗2、病毒性疫苗：狂犬疫苗、脊髓灰质炎疫苗3、类毒素：白喉内毒素、破伤风内毒素B、按疫苗的性质可以划分为：灭火病毒、减毒活疫苗

32、动物细胞制药的前景有哪些？1、改进表达载体，提高表达水平和产量 2、利用代谢工程，改进培养工艺，降低生产成本 3、抑制细胞凋亡，延长培养周期 4、采用糖基化工程，提高产品质量 5 转基因动物的研究 6、组织工程的研究

33、植物细胞培养的方式有哪些?植物细胞培养，按培养对象来说，可分为原生质体培养和单倍体细胞培养；按照培养基类型可分为固体培养和液体培养；按培养方式可分为悬浮细胞培养和固定化细胞培养。

34、植物细胞的生理活性物质和后含物个有哪些？1、生理活性物质:生理活性物质是一类对细胞内的生化反应和生理活动起调节作用的物质的总称。包括酶、维生素、植物激素和抗生素等。酶类催化剂、维生素、参与酶的形成（3）植物激素、抗生素和植物杀菌素

2、细胞后含物生物碱、糖苷类、挥发油、有机酸

35、影响植物次级代谢产物产生和累积的因素主要有哪些？1.生物条件：外植体，季节，休眠，分化2.物理条件：温度，光（光照时间，光强，光质），通气（O2），pH和渗透压3.化学条件：无机盐（N,P,K），碳源，植物生长调节剂，维生素，氨基酸，核酸，抗生素，天然物质，前体 4.工业培养条件：培养罐类型，通气，搅拌和培养方法

36、提高植物细胞次级代谢产物产量的方法有哪些？培养条件的影响1.温度:25℃左右2.pH： pH 5-6，采用磷酸盐调节 3.培养基的组成、磷，低磷会导致次级代谢产物的累积，缺乏磷会导致生物量的大幅度降低。蔗糖含量可以增加细胞培养物的次生代谢产物。采用两步培养法:第一步使用适合细胞生长的培养基，营养丰富；第二步使用适于次级代谢产物合成的培养基，较低含量的硝酸盐和磷酸盐，并含有较低的糖分或少量的碳源。

4.光的影响：光照时间的长短、光质、光强对次级代谢产物的累积有一定的作用。

5.氧气悬浮细胞供氧采用通气和搅拌，控制转速固定化细胞供氧采用通气方式。

6.植物生长调节剂

37、固定化酶和固定化细胞的方法。⒈固定化酶的定义：固定化酶是指限制或固定于特定空间位置的酶，具体来说，是指经物理或化学方法处理，使酶变成不易随水流失即运动受到限制，而又能发挥催化作用的酶制剂。固定化酶的制备技术1）吸附法制备技术：将酶的水熔液与具有高度吸附能力的载体混合，然后洗去杂质和未吸附的酶即得固定化酶。2）包埋法制备技术：凝胶包埋：先将凝胶材料与水混合，加热使之溶解，再降至其凝固点以下的温度，然后假如预保稳的酶液，混合均匀，最后冷却凝固成型和破碎即成固定化酶。微囊化包埋：将酶定位于具有半透膜的微小囊内。半透膜厚约20nm，膜孔径40 nm .其表面积与体积比很大，包埋酶量也多。（3）交联法制备技术：向酶液中加入多功能试剂，在一定的条件下使酶分子内或酶分子间彼此连接成网格人结构而形成固定化酶。反应速度与酶的浓度、试剂的浓度、pH、离子强度、温度和反应时间有关。如：0.2%的木瓜蛋白酶和0.3%的戊二醛在pH5.2~7.2，0°C，24h即完成反应。⒈固定化细胞的定义：将细胞限制或定位于特定空间位置的方法称为细胞固定化技术被限制或定位于特定空间位置的细胞称为固定化细胞。⒊固定化细胞的制备技术⑴载体结合法：是将细胞悬液直接与水不溶性的载体相结合的固定化方法。载体主要为阴离子交换树脂、阴离子交换纤维素、聚氯乙烯。优点：操作简单，符合细胞的生理条件，不影响细胞的生长活性缺点：吸附容量小结合强度低⑵包埋法：将细胞定位于凝胶网格内的技术。⑶交联法：用多功能试剂对细胞进行交联的固定化方法。由于所用交联剂戊二醛等对细胞有毒性，一般很少用。⑷无载体法：靠细胞自身的絮凝作用制备固定化细胞的技术。

38、固定化酶和固定化细胞的特点（和游离酶和细胞相比）。固定化酶的特点具有生物催化剂的功能，又有固相催化剂的功能。①可多次使用②反应后，酶底物产物易分开，产物中无残留酶，易纯化，产品质量高。

③反应条件易控制。④酶的利用效率高。⑤比水溶性酶更适合于多酶反应。⒉固定化细胞的特点有细胞特性，生物催化剂功能，固相催化剂特点。优点：①无须进行酶的分离纯化②保持酶的原始状态，酶回收率高③比固定化酶稳定性高④细胞内酶附助因子可再生⑤细胞本身含多酶体系⑥抗污染能力强

39、酶工程在医药工业中的应用有哪些方面？应用举例1、在疾病诊断方面的应用（1）根据体内原有酶活力的变化来诊断某种疾病利用谷丙转氨酶活力升高来诊断肝炎（2）用酶测定体液中某些物质的量诊断疾病利用葡萄糖氧化酶测定血糖含量，诊断糖尿病2、在疾病治疗方面的应用1）蛋白酶：治疗消化不良和食欲不振2）溶菌酶：抗菌、消炎、镇痛等作用3）超氧化物歧化酶：抗辐射4）L-天冬酰胺酶：治疗白血病5）α淀粉酶：消化药。6）乳糖酶：治疗乳糖缺乏症（7）脂肪酶：消化剂。预防和治疗高血脂病8）右旋糖苷酶：预防龋齿（9）链激酶、尿激酶：溶血栓3、在药物生产方面的应用利用蛋白酶和羧肽酶将猪胰岛素转化为人胰岛素4、在分析检测方面的应用