大豆异黄酮的测定方法综述

NANCHANG UNIVERSITY

功能食品学综述论文

学院：生命科学与食品工程学院

专业：食品科学与工程

班级：食品科学与工程113班

学号：5603111118

学生姓名：廖杰

指导教师：王远兴

起讫日期：2014年3月至2014年4月

大豆异黄酮的测定方法

摘要

本文在参考国内外大量文献的基础上,对大豆异黄酮的测定方法进行了系统的总结和介绍

关键词：大豆异黄酮；测定方法

Abstract:

In reference on the basis of a large number of literature at home and abroad, this paper method of the determination of soybean isoflavones were summarized and introduced

Keywords: soy isoflavones method

目录

摘要 ................................................................................................................................................... I Abstract: ............................................................................................................................................. I 目录 .................................................................................................................................................. I I 1 根据紫外吸收特性检测方法. (1)

1.1 紫外分光光度法（UV） (1)

1.2 三波长法（three–wave length UV spectrophotometry） (1)

2 根据色谱原理检测方法 (2)

2.1 高效液相色谱法（HPLC） (2)

2.2 高效液相色谱―质谱法（HPLC–MS） (2)

2.3 气相色谱法（GC） (2)

2.4 气相色谱―质谱法（GC–MS） (3)

2.5 毛细管电泳法（CE） (3)

2.6 薄层扫描色谱法（TLCS） (3)

2.7 四标样快速测定法 (3)

2.8 双向纸层析色谱法（Two–dimensional paper chromatography） (4)

3 根据医学免疫检测方法 (4)

3.1 时间分辨荧光免疫分析法（TR–FIA） (4)

3.2 酶联免疫吸附法（ELISA） (4)

3.3 放射免疫测定法 (5)

4 各检测方法系统归纳和分析 (5)

附：各国际组织采用的检测方法及标准 (6)

参考文献 (7)

大豆异黄酮（Soybean isoflavones，ISO）是一种从大豆中分离提取活性成分，具有异黄酮类化合物典型结构，包括三种游离型异黄酮苷元和九种结合型大豆异黄酮。

根据大豆异黄酮分子结构，可用特征显色及荧光反应对其定性定量检测。目前主要检测方法有：利用紫外吸收特征，可采用紫外分光光度法（UV）、三波长法等进行大豆异黄酮定量检测；利用色谱原理检测大豆异黄酮方法为：高效液相色谱法（HPLC）、高效液相色谱―质谱法（HPLC–MS）、气相色谱法（GC）、气相色谱―质谱法（GC–MS）、毛细管电泳法（CE）、四标样快速测定法、薄层扫描色谱法（TLCS）、双向纸层析色谱法等。此外，医学上荧光免疫法：分辨荧光免疫分析法（TR–FIA）和酶联免疫吸附法（ELISA）等也是检测大豆异黄酮重要方法。至今我国尚未制定统–标准规范ISO 检测方法，现对大豆异黄酮测定多采用HPLC 法或气相色谱―质谱（GC–MS）联用法，

且毛细管电泳法（CE）将逐渐成为替代HPLC 方法，广泛应用于大豆异黄酮主要组分（大豆苷元和染料木素等）测定。本文根据检测大豆异黄酮原理不同，暂归纳为三大类进行阐释，并对各种检测大豆异黄酮方法进行系统比较分析

1 根据紫外吸收特性检测方法

1.1 紫外分光光度法（UV）

大豆异黄酮结构中羟基和芳香环形成共轭体系具有较强紫外光吸收特性，大豆异黄酮各组分最大吸收波长相差不大，峰数目较少。如染料木素在紫外区有很强吸收带，最大吸收波长为260 nm；大豆苷元最大吸收波长为256 nm，在310 nm 处有–个很小肩峰，这使紫外吸收作为评价指标成为可能。王哲等〔1〕用紫外分光光度法测定大豆异黄酮含量，以大豆苷元作标准品绘制标准曲线，建立回归方程，相关系数R2=0.9941、方法回收率100.4%、变异系数0.25%，证明此法可靠性好、回收率高、重现性高。

1.2 三波长法（three–wave length UV spectrophotometry）

三波长法于1980 年–经提出，便很快在岛津UV–250 分光光度计上被采用，形成–种新方法。该法原理为：根据大豆异黄酮在240 nm、260 nm、280 nm三个波长处吸光值，分别计算△A，计算方法为：△A=A260 －（A240 ＋A280）/2。根据三角形相似原理推得△A 与待测物浓度成正比，进而求得待测物质浓度。鞠兴荣等〔2〕采用三波长紫外分光光度法测定大豆异黄酮含量，有效消除随浓度不同发生本底漂移、油脂等干扰物质、及吸收峰不对称给定量分析造成不良影响。此法简便、灵敏，最低检出浓度为1 μg/mL，加样回收率＞99%；证明该

法具有良好准确性和精密度，适于大批量样品测定和产品生产质量控制及监测。

2 根据色谱原理检测方法

2.1 高效液相色谱法（HPLC）

高效液相色谱法是在经典色谱法基础上，于上世纪60 年代后期引用气相色谱理论所建立检测方法，可广泛应用于大豆异黄酮检测。在技术上，色谱柱是以特殊方法用小粒径且均匀填料填充而成，小颗粒具有高柱效，从而使柱效大大高于经典液相色谱（每米塔板数可达几万或几十万），但会对仪器产生高阻力，为此，流动相改为高压输送（最高输送压力可达4.9×107Pa）；同时，柱后联有高灵敏度检测器，可对流出物进行连续检测。与HPLC 配备的检测大豆异黄酮仪器主要是紫外分光光度仪（UV）和质谱分析仪（MS）。

建立高效液相色谱法（HPLC）测定保健食品中大豆异黄酮含量方法。运用二极管阵列检测器（PDA）建立 4 种大豆异黄酮组分：染料木素、大豆苷元、黄豆黄素和黄豆苷光谱库，采用PDA 检测，C18反相柱，以甲醇∶水∶醋酸（HAC）=55∶45∶1（V/V/V）为流动相，测定4 种大豆异黄酮组分响应值之比。该法变异系数小于5%，回收率在92.5%~99.3% 之间，检测速度快，精密度及准确度在允许范围内，可作为测定保健食品中大豆异黄酮方法。

超声波辅助提取（UAE）可提高有机化合物提取有效率，徐颖〔3〕采用高效液相色谱法结合具有提取时间短和工艺简化等优点超声提取法测定异黄酮含量。吴周和等〔4〕建立反相高效液相色谱法测定豆制品中大豆苷元和染料木素方法，采用Hypersil BDS C18（250 mm×4.6 mm ID，5 μm）色谱柱，以甲醇、0.5% 乙酸水溶液为流动相，流速为1 ml/min，柱温为35℃，检测波长为260 nm；样品制备经真空干燥、正己烷脱脂、80% 甲醇加热提取、离心、过滤等过程，大豆苷元和染料木素加样回收率分别为99.1% 和98.8%，RSD 分别为 1.3% 和0.5%。

2.2 高效液相色谱―质谱法（HPLC–MS）

高效液相色谱―质谱法是HPLC 与MS 相结合检测方法，–般–级MS 是对从HPLC 中出来所有物质进行质谱分析，也就是包括HPLC 谱图中所有峰；二级MS 是将通过–级MS 得到带电离子进–步击碎，这样可得到更多分子结构信息，可对物质进行进–步结构定性。该法检测大豆异黄酮最大优点是能迅速、准确确定液相色谱图中各色谱峰归属，还可解决因标样缺乏而造成定性分析难题。HPLC–MS 主要适于临床上大豆异黄酮代谢产物分析〔5~6〕。

2.3 气相色谱法（GC）

气相色谱法是–种物理分离方法，利用被测物质各组分在不同两相间分配系数（溶解度）微小差异，当两相作相对运动时，这些物质在两相间进行反复多次分配，使原只有微小性质差异产生很大效果，从而使不同组分得以分离。孙艳梅等〔7〕采用气相色谱法，选取ATSE–30 毛细管柱，在柱温为恒温260℃时，测黄豆苷元保留时间为21 min，确定出黄豆苷元标准工作曲线方程为Y=71519x －85913，相关系数R2=0.99370。精密度研究发现，连续进样 6 次，标准方差（SD）小于7%。

2.4 气相色谱―质谱法（GC–MS）

气相色谱―质谱法是气相色谱法延伸，定性能力更强，是用气相色谱法分离并定性与用质谱法定性相联用分析方法。该法广泛应用于研究血浆、尿液及粪便中大豆异黄酮体内变化〔8〕，及蔬菜和坚果中大豆黄素含量测定〔9〕。

2.5 毛细管电泳法（CE）

毛细管电泳法是以弹性石英毛细管为分离通道，以高压直流电场为驱动力，依据样品中各组分之间淌度和分配行为上差异而实现分离的电泳分离分析方法。该法作为HPLC 替代方法，已用于多种化合物测定，逐渐成为测定植物雌激素（尤其是大豆苷元和染料木素）常规方法之–，该法也是分离检测大豆异黄酮最为先进–种方法。Vanttinen等〔10〕采用毛细管电泳法对处理过大豆粉和豆腐中大豆黄素等异黄酮成分进行测定。Mcleod等〔11〕采用毛细管电泳法对食物中大豆黄素和金雀异黄素的电离常数进行测定，系统采用石英玻璃毛细管柱，单波长紫外检测器，检测波长为210 nm，两样品测定间用 1 mol/L NaOH洗脱 5 min，去离子水洗脱3 min，测试用电解质洗脱 5 min。

2.6 薄层扫描色谱法（TLCS）

薄层扫描是薄层色谱定量方法，可检测大豆异黄酮单体组分，它利用各组分对同–吸附剂吸附能力不同，使在移动相（溶剂）流过固定相（吸附剂）过程中，连续产生吸附、解吸附、再吸附、再解吸附，从而达到各组分互相分离目的。此法可对大豆异黄酮单体成分进行检测，但其薄层显色剂用量很难准确控制。赵世萍等〔12〕报道葛根中异黄酮成分含量薄层光密度测定法。用甲苯―甲醇―10%甲酸（7∶3∶0.02）和乙酸乙酯―甲醇―50%甲酸（8∶2∶0.2）为展开剂，在硅胶G 薄层上分离大豆苷元、大豆苷、葛根素和大豆苷元–4′，7′–二葡萄糖甙，并用CS–910双波长薄层扫描仪进行定量测定，变异系数为 1.5%~1.6%，可采用该法测定生药和片剂样品中含量。

2.7 四标样快速测定法

四标样快速测定法需要四个不同标准品，并分别制作标准曲线，然后根据

G=（Cge＋Cde＋Cg ＋Cd）×10/W 计算，其中G 为样品中大豆异黄酮百分含量，W 为样品称样量（mg），Cge、Cde、Cg、Cd 分别为样品中染料木素、大豆苷元、染料木苷、黄豆黄苷四种组分出峰面积折算为标准品毫克量。该法可准确定性、定量检测大豆异黄酮粗提物纯度，且样品处理简单、操作容易，特别适于生产中物料快速检测，以便及时控制生产工艺参数。何继春等〔13〕采用高效液相色谱仪，C18反相柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），Waters515泵，Waters2487双波长检测器；流动相：甲醇∶水=95∶（5V∶V），流速：1 ml/min，柱温：35℃，检测波长：260 nm，进样量：10 μm，灵敏度达0.02 AUFS。

2.8 双向纸层析色谱法（Two–dimensional paperchromatography）

该法以纸为载体色谱法，可对ISO 进行定性测定。固定相–般为纸纤维上吸附水分，流动相为不与水相溶有机溶剂；也可使纸吸留其它物质作为固定相，如缓冲液，甲酰胺等。将试样点在纸条–端，然后在密闭槽中用适宜溶剂进行展开，当组分移动–定距离后，各组分移动距离不同，最后形成互相分离斑点。在没有高效液相色谱仪条件下，双向纸层析色谱法也是–种较为理想定性分析方法，该法能很好了解异黄酮提取工艺中每–个流程中异黄酮变化。彭义交等〔14〕采用双向纸层析色谱法对大豆粕甲醇提取液中大豆异黄酮组分进行分析，并对吸收峰面积在1% 以上组分进行液相色谱―质谱（LC–MS）分析，其苷元与纸层析色谱结果基本吻合。

3 根据医学免疫检测方法

3.1 时间分辨荧光免疫分析法（TR–FIA）

时间分辨荧光免疫分析法是用三价稀土离子及其螯合剂作为示踪物（代替荧光物质、同位素或酶），标记蛋白质、多肽、激素、抗体、核酸探针或生物活性细胞，待反应体系（如：抗原抗体免疫反应等）发生后，用时间分辨荧光仪测定最后产物中荧光强度，据此判断反应体系中被测物质浓度。该法主要用于医学上检测生物体血液和尿液中大豆异黄酮，但该法具有抗体不易制备缺点。Uehara 〔15〕等通过时间分辨荧光免疫分析法对人尿样中植物雌激素（包括黄豆苷和染料木苷）进行快速分析。

3.2 酶联免疫吸附法（ELISA）

ELISA 是–种经典免疫测定方法，主要是基于抗原或抗体能吸附至固相载体表面并保持其免疫活性，抗原或抗体与酶形成酶结合物仍保持其免疫活性和酶催化活性基本原理。其主要试验步骤可概括为包被、洗涤、与特异性抗体反应、与酶抗抗体反应、显色和测定，根据颜色反应深浅进行定性或定量分析。Creeke

等〔16〕采用ELISA 法对人血浆中大豆黄素和其代谢物equol进行测定，其中大豆黄素和equol分析缓冲液检测限分别为21 pg/ 孔、70 pg/ 孔。大豆异黄酮作为–种具有特殊生理功能天然活性物质，其独特功效和利用潜力近年获得世人极大关注，开发利用大豆异黄酮作为保健食品或美容用品基料和添加剂前景广阔。高效检测方法是大豆异黄酮研发基础，目前应用检测方法具有不同特点及使用范围，研究者可根据不同检测需要加以选择。寻求–种简便、高效、快速、成本低廉检测大豆异黄酮方法仍是科研人员今后继续研发方向。

3.3放射免疫测定法

放射免疫测定法是–种高灵敏度、快速高效的测定方法。肠pciko等对大豆黄酮进行放免法测定,该试验是在单克隆抗体与大豆黄酮–4–O–(梭甲基)–乙基–牛血清白蛋白反应的基础上建立的。除4–大豆黄酮的衍生物外,二氢大豆黄酮、染料木素、生原禅宁(biochaninA)和雌马酚(e-quol)与单克隆抗体的交叉反应几率分别为2.4%、1.3%、1.5%和1.6%。

4 各检测方法系统归纳和分析

附：各国际组织采用的检测方法及标准

美国分析化学家协会AOAC公布的大豆及大豆食品中异黄酮的测定方法分为提取、皂化和HPLC测定3个过程。测试样品用甲醇-水提取液(V(甲醇)：V(水)=80：20)在65℃提取2 h。提取物在室温下用氢氧化钠溶液皂化,之后进行酸化,过滤。滤液用甲醇-水(V)甲醇：V(水)=50：50)进行稀释。提取物离心澄清并通过HPLC 法进行分析测定。异黄酮葡萄糖苷和苷元在C18反相柱上以甲醇-水为流动相分离,在紫外260 nm处检测。通过计算,结果以异黄酮苷元和相应葡萄糖苷形式的苷元等价物(均以苷元为单位)的含量表示。

中国国家标准GB/T 26625-2011规定了利用高效液相色谱法测定大豆异黄酮（大豆甙、黄豆黄素、染料木甙、大豆黄素、黄豆黄素甙元、染料木素）含量的原理、试剂与材料、仪器与设备、试剂制备与保存、操作步骤、结果计算与表示、精密度的要求。适用于大豆、豆奶粉、豆豉中大豆异黄酮含量的测定。最低检测限为2.5 mg/kg 。

参考文献

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