实验二：目的基因的PCR扩增(含结果)

实验二热休克蛋白HSP90的PCR扩增技术

一、实验目的与原理简介

聚合酶链式反应（polymerase chain reaction）是体外克隆基因的重要方法，它可在几个小时内使模板分子扩增百万倍以上。因此能用于从微量样品中获得目的基因，同时完成了基因在体外的克隆，是分子生物学及基因工程中极为有用的研究手段。

常规PCR用于已知DNA序列的扩增，具体可分为三个主要过程：

一、变性。通过升高温度使DNA双链模板分子中氢断裂，形成单链DNA分子，温度为94℃，时间1min。

二、复性。降低温度使DNA单链分子同引物结合。温度为55℃，时间1min。

三、延伸。升高温度，在DNA聚合酶最佳活性的条件下在引物3端加入dNTP，

实现模板的扩增，温度为72℃，时间2min。同时第一步变性前要在94℃下预变性5分钟，使DNA双链完全解开。经过 25-35个循环之后，在72℃下继续延伸10分钟。

PCR反应包含的七种基本成分：

1）热稳定性DNA聚合酶：Taq DNA聚合酶是最常适用的酶，商品化Taq DNA 酶的特异性活性约为80000单位/mg.

2）寡核苷酸引物：寡核苷酸引物的设计是影响PCR扩增反应的效率与特异性的关键因素。

3）脱氧核苷三磷酸（dNTP）：标准的PCR反应体系应包括4种等摩尔浓度的脱氧核苷三磷酸，即dATP、dTTP、dCTP和dGTP。每种dNTP的浓度一般在200-250μl之间，高浓度的dNTP对扩增反应会起抑制作用，可能是dNTP 与Mg2+螯合有关。

4）二价阳离子：一般需要Mg2+来激活热稳定的DNA聚合酶，由于dNTP与寡聚核酸结Mg2+合，因而反应体系中阳离子的浓度一般要超过dNTP和引物来源的磷酸盐基团的摩尔浓度。Mg2+的最佳浓度为1.5mmol/L。

5）维持PH值的缓冲液：用Tris-Cl在室温将PCR缓冲液的PH值调至8.3-8.8之间，标准PCR缓冲液浓度在10mmol/L。在72℃温育时，反应体系的温度将下降1个多单位，致使缓冲液的PH值接近7.2。

6）模板DNA：含有靶序列的模板DNA可以以单链或双链形式加入到PCR混合液中，闭环DNA的及增效率略低于线性DNA。

实验目的：学习PCR反应的基本原理和基本技术。

二、材料和试剂

10Х扩增缓冲液

4种dNTP贮存液（20mmol/L，PH 8.0）

Tap DNA 聚合酶

5端引物（20μmol/L）及3端引物（20μmol/L）

模板DNA

琼脂糖凝胶

移液枪（0.5-10μL 5-50μL）枪头

实验操作

1）将各成分加到微量离子管内混合：

10Х扩增缓冲液 2.5μl 5端引物 1.5μl

3端引物 1.5μl

D D W15μl

d N T P 2.5μl

T a q酶0.1μl

模板 1 μl 2）按照以下方法进行PCR扩增：

预变性： 96oC 5min

30个循环： 95 oC 45min,60 oC 45min, 72 oC 150min；

延伸： 72 oC 10min

注：聚合反应时间是根据靶基因的长度按每分钟聚合1000bp的速率来计算出来

的。

3）抽取每种扩增样品5-10μl，用琼脂糖电泳来分析扩增结果，用DNA marker

来判断扩增片段的大小。凝胶一般用Goldview染色后观察扩增的量与片段大

小。

从阳性对照样品的相对分子量的目的条带的亮度与粗细可以判断PCR扩增的

效率；阴性对照样品在目的条带附近应该没有相应条带。

问

题

可能原因解决方法

无产物或产量低模板浓度偏低或偏高电泳检测模板浓度，调整模板用量

模板降解重新制备；基因组DNA、cDNA应小量分装后低温保存模板中含有抑制反应的杂质纯化模板

引物浓度不足调整引物浓度，特别是针对长片段PCR

引物存在二级结构重新设计引物，避免二级结构；优化退火温度

引物降解引物应高浓度小量分装，-20℃保存，避免反复冻融

Mg2+浓度偏低

适当提高Mg2+浓度，从1 mM到3 mM以0.5 mM间隔递

增，针对不同模板和引物摸索最佳Mg2+浓度

dNTP降解-20℃保存，小量分装，避免反复冻融

酶纯度低，扩增效率差选用高质量DNA聚合酶

酶量不足适当增加酶量

用酶不当

针对模板、目标片段的特选择适当的酶(详见PCR产品选

择指南)

缓冲液失效更换缓冲液或使用预混PCR反应体系

模板变性不充分

适当延长变性时间；对高GC或复杂结构模板，提高起始

变性温度至98℃

退火温度偏高降低退火温度，应比引物Tm低至少5℃

延伸时间不足增加延伸时间，特别是针对长片段PCR

循环数目不够增加循环数

PCR管污染

质量可靠的PCR管通常不需灭菌，否则应先高温高压灭

菌处理；用过的PCR管不可清洗后重复使用

PCR仪故障检查程序和模块温度

其他使用PCR增强剂

非特异产物过多体系污染设计对照实验寻找污染源，操作时应注意避免交叉污染引物浓度过高适当减少引物浓度

引物序列特异性差重新设计引物

Mg2+浓度过高

降低Mg2+浓度，从1 mM到3 mM以0.5 mM间隔递增，

针对不同模板和引物摸索最佳Mg2+浓度

dNTP浓度过高降低dNTP浓度

酶量过多减少酶量，以0.5 U间隔递减

退火温度过低提高退火温度

延伸时间过短增加延伸时间，以1 min间隔递增

循环次数过多减少循环次数

模板结构过于复杂或目标片

段过长

特选择适当的酶(详见PCR产品选择指南)；使用PCR增

强剂

其他

HotStart PCR

TouchDown PCR

巢式PCR

引物二聚体引物3’末端存在互补序列重新设计引物引物浓度过高降低引物浓度模板浓度过低提高模板浓度退火温度不合适优化退火温度循环次数过多减少循环次数其他HotStart PCR

拖尾严重引物浓度过高调整引物浓度

引物序列特异性差或模板上

存在同源序列

重新设计引物

模板降解重新制备模板

模板浓度过高降低模板浓度

dNTP浓度过高减少dNTP用量

Mg2+浓度过高

降低Mg2+浓度，从1 mM到3 mM以0.5 mM间隔递增，

针对不同模板和引物摸索最佳Mg2+浓度

医疗机构临床基因扩增检验实验室工作导则

附件医疗机构临床基因扩增检验实验室工作导则一、临床基因扩增检验实验室的设计 (一)临床基因扩增检验实验室区域设计原则。原则上临床基因扩增检验实验室应当设臵以下区域:试剂储存和准备区、标本制备区、扩增区、扩增产物分析区。这4个区域在物理空间上必须是完全相互独立的,各区域无论是在空间上还是在使用中,应当始终处于完全的分隔状态,不能有空气的直接相通。根据使用仪器的功能,区域可适当合并。例如使用实时荧光PCR仪,扩增区、扩增产物分析区可合并;采用样本处理、核酸提取及扩增检测为一体的自动化分析仪,则标本制备区、扩增区、扩增产物分析区可合并。各区的功能是: 1.试剂储存和准备区:贮存试剂的制备、试剂的分装和扩增反应混合液的准备,以及离心管、吸头等消耗品的贮存和准备。 2.标本制备区:核酸(RNA、DNA)提取、贮存及其加入至扩增反应管。对于涉及临床样本的操作,应符合生物安全二级实验室防护设备、个人防护和操作规范的要求。 3.扩增区:cDNA合成、DNA扩增及检测。 4.扩增产物分析区:扩增片段的进一步分析测定,如杂交、酶切电泳、变性高效液相分析、测序等。 (二)临床基因扩增检验实验室的空气流向。临床基因扩增检验实验室的空气流向可按照试剂储存和准备区→标本制备区→扩增区→扩增产物分析区进行,防止扩增产物顺空气气流进入扩增前的区域。可按照从试剂储存和准备区→标本制备区

→扩增区→扩增产物分析区方向空气压力递减的方式进行。可通过安装排风扇、负压排风装臵或其他可行的方式实现。 (三)工作区域仪器设备配置标准。 1.试剂储存和准备区。 (1)2~8℃和-20℃以下冰箱。 (2)混匀器。 (3)微量加样器(覆盖0.2-1000μl)。 (4)可移动紫外灯(近工作台面)。 (5)消耗品:一次性手套、耐高压处理的离心管和加样器吸头。 (6)专用工作服和工作鞋(套)。 (7)专用办公用品。 2.标本制备区。 (1)2-8℃冰箱、-20℃或-80℃冰箱。 (2)高速离心机。 (3)混匀器。 (4)水浴箱或加热模块。 (5)微量加样器(覆盖0.2-1000μl)。

PCR-SSP ABO基因分型实验操作规程

PCR-SSP ABO基因分型实验操作规程 SXYJ-GZ-0222 1目的本文件规定了采用PCR－SSP技术、使用ABO基因分型试剂盒，对被检标本ABO血型基因型进行鉴定的操作规程。 2适用范围适用于各类ABO疑难血型标本鉴定。 3职责检测者负责依据此程序进行ABO基因分型实验操作。 4材料与设备ABO分型试剂盒（美国G&T公司）、Taq酶（Promega公司）、注射用水、PCR 扩增仪、微量加样器、涡旋震荡仪、冰箱、灭菌0.5ml离心管、灭菌200μl枪头、灭菌20μl枪头、废物缸、超净工作台、台式离心机、一次性帽子、口罩、手套等。 5操作方法 5.1建立PCR反应体系按此操作规程表1建立PCR反应体系表1 PCR扩增反应体系配制 5.2PCR扩增反应采用热启动方法，先将PCR扩增仪预热到95℃后，再放入PCR板或 PCR试管，进行以下扩增反应：95℃预变性5min;95℃变性30s,60℃退火30s,72℃延伸90s，30个循环；72℃延伸5min，4℃保温。 5.3质量控制标准： 5.3.1PCR反应体系的建立必须在PCR前区的生物安全柜进行操作。 5.3.2实验前应对照DNA模板管编号标记相应PCR管或板。 5.3.3必须设立ABO各基因表型的阳性对照。 5.3.4严格按操作规程中PCR扩增循环程序参数进行扩增，放入PCR板或PCR试管前需调出已存入的程序核对无误后再进行PCR扩增。 5.3.5严格按照要求存放Taq DNA聚合酶，使用时一定要放在冰盒中保持低温，并核对有效期限和浓度，用后立刻放回冰箱，不得反复冻融。 5.4琼脂糖凝胶电泳参见SXYJ-GZ-0305《凝胶电泳操作规程》。 5.5琼脂糖凝胶电泳结果记录与分析参见SXYJ-GZ-0318《凝胶成像系统操作规程》。 6结果分析每个PCR反应都产生强弱不一的207bp内对照产物。由于竞争作用，某些PCR反应中内对照很弱，属正常现象。根据是否产生特异性PCR产物及其大小来指定相应基因型，见此操作规程表2。

临床基因扩增检验实验室基本设置标准

临床基因扩增检验实验室基本设置标准根据《临床检验扩增检验实验室管理暂行办法》，制定本标准一、临床基因扩增检验实验室区域设置原则（一）临床基因扩增检验实验室区域设置原则 1、试剂储存和准备区 2、标本制备区 3、扩增反应混合物配制和扩增区 4、扩增产物分析区如使用全自动分析仪，区域可适当合并。（二）各工作区域必须有明确的标记，避免不同工作区域内的设备、物品混用。（三）进入各工作区域必须严格按照单一方向进行，即试剂储存和准备区—>标本制备区—>扩增反应混合物配制和扩增区—>扩增产物分析区。（四）不同的工作区域使用不同的工作服（例如不同的颜色）。工作人员离开各工作区域时，不得将工作服带出。二、工作区域仪器设备配置标准（一）试剂储存和准备区 1、2-8C和-15C冰箱 2、混匀器 3、微量加样器（覆盖1-1000ul） 4、移动紫外灯（近工作台面）

5、消耗品：一次性手套、一次性吸水纸、耐高压处理的离心管和加样器吸头（带滤心） 6、专用工作服和工作鞋 7、专用办公用品（二）标本制备区 1、2-8C冰箱、-20C或-80C冰箱 2、高速台式冷冻离心机 3、混允器 4、水浴箱或加热模块 5、微量加样器（覆盖1-1000ul） 6、可移动紫外灯（近工作台面） 7、超净工作台 8、消耗品：一次性手套、一次性吸水纸、耐高压处理的离心管和加样器吸头（带滤心） 9、专用工作服和工作鞋 10、专用办公用品如需处理大分子DNA，应具有超声波水浴仪。（三）扩增反应混合物配制和扩增区 1、核酸扩增仪 2、微量加样器（覆盖1-1000ul） 3、可移动紫外灯（近工作台面） 4、消耗品：一次性手套、一次性吸水纸、耐高压处理的离心管

DNA甲基化实验操作原理及方法-Hxg

DNA 甲基化重亚硫酸氢盐修饰法（DNA METHYLATION BISULFITE MODIFICATION）实验操作原理及方法一、实验目的：通过本实验，可以检测特定DNA序列的甲基化状态。二、实验原理： DNA 甲基化是指由S-腺苷甲硫氨酸（SAM）提供甲基基团，在DNA 甲基转移酶（DNA methyltransferases，DNMTs）的作用下，将CpG 二核苷酸的胞嘧啶（C）甲基化为5-甲基化胞嘧啶（5-m C）的一种化学反应。DNA 甲基化是调节基因转录表达的一种重要的表观遗传的修饰方式。 DNA 甲基化主要在转录水平抑制基因的表达。DNA 甲基化引起基因转录抑制的机制可能主要有以下3 种：（1）DNA甲基化直接干扰特异性转录因子与各基因启动子中识别位置的结合。（2）序列特异性的甲基化DNA 结合蛋白与启动子区甲基化CpG 岛结合，募集一些蛋白，形成转录抑制复合物，阻止转录因子与启动子区靶序列的结合，从而影响基因的转录。（3）DNA 甲基化通过改变染色质结构，抑制基因表达。重亚硫酸氢盐修饰法检测DNA甲基化的基本原理是基于DNA变性后用重亚硫酸氢盐处理，可将未甲基化胞嘧啶修饰成尿嘧啶。此反应的步骤是：1、在C-6位点磺化胞嘧啶残基；2、在C-4处水解去氨基来产生尿嘧啶磺酸盐；3、在碱性条件下去硫酸化。在这个过程中，5-甲基胞嘧啶由于甲基化基团干扰了重亚硫酸氢盐进入到C-6位点而保持着未反应的状态。在重亚硫酸氢盐处理后，使用针对每个修饰后DNA链的引物进行PCR反应。在这个PCR产物中，每5-甲基胞嘧啶显示为胞嘧啶，而由未甲基化胞嘧啶转变成的尿嘧啶则在扩增过程中被胸腺嘧啶所取代。 BSP(bisulfate sequencing PCR) ：重亚硫酸盐使DNA中未发生甲基化的胞嘧啶脱氨基转变成尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶保持不变，进行PCR扩增。最后，对PCR产物进行测序，并且与未经处理的序列比较，判断是否CpG位点发生甲基化。

临床基因扩增检验实验室工作规范

为使基因扩增检验技术有效地应用于临床,更好地为疾病的预防、诊断和治疗服务,保证检验质量,特制定本规范。一、临床基因扩增检验实验室的规范化设置及其管理临床基因扩增检验实验室的规范化设置详见《临床基因扩增检验实验室管理暂行办法》(卫医发[2002】10号文)附件《临床基因扩增检验实验室基本设置标准》。为避免污染,必须严格遵循《临床基因扩增检验实验室设置标准》设置临床基因扩增检验实验室。临床基因扩增检验实验室四个隔开的工作区域中每一区域都须有专用的仪器设备。各区域都必须有明确的标记,以避免设备物品如加样器或试剂等从其各自的区域内移出从而造成不同的工作区域间设备物品发生混淆。进入各个工作区域必须严格遵循单一方向顺序,即只能从试剂贮存和准备区、标本制备区、扩增反应混合物配制和扩增区(简称扩增区)至产物分析区,避免发生交叉污染。在不同的工作区域应使用不同颜色或有明显区别标志的工作服,以便于鉴别。此外,当工作者离开工作区时,不得将各区特定的工作服带出。清洁方法不当也是污染发生的一个主要原因,因此实验室的清洁应按试剂贮存和准备区至扩增产物分析区的方向进行。不同的实验区域应有其各自的清洁用具以防止交叉污染。 (一)试剂贮存和准备区下述操作在该区进行:贮存试剂的制备、试剂的分装和主反应混合液的制备。贮存试剂和用于标本制备的材料应直接运送至试剂贮存和准备区,不能经过产物分析区。在打开含有反应混合液的离心管或试管前,应将其快速离心数秒。试剂

原材料必须贮存在本区内,并在本区内制备成所需的贮存试剂。当贮存试剂溶液经检查可用后,应将其分装贮存备用,避免由于经常打开反应管吸液而造成污染。含反应混合液的离心管或试管在冰冻前都应快速离心数秒。大多数用于扩增的试剂都应冰冻贮存。为避免因单次反应取液而频繁的冻融主贮存试剂,应分装冰冻贮存试剂溶液。贮存试剂的分装体积根据通常在实验室内一次测定所需的扩增反应数来决定。主反应混合液的组成成份尤其是聚合酶的适用性和稳定性通过预试验来检查,评价结果必须有书面报告。对于“热启动”技术(在第一个高温变性步骤后加入酶),聚合酶也可不包含在主反应混合液中。在整个本区的实验操作过程中,操作者必须戴手套,并经常更换。此外,操作中使用一次性帽子也是一个有效地防止污染的措施。严禁用嘴吸取液体,加样器和吸头等必须经高压处理。工作结束后必须立即对工作区进行清洁。本工作区的实验台表面应可耐受诸如次氯酸钠的化学物质的消毒清洁作用。实验台表面的紫外照射应方便有效。由于紫外照射的距离和能量对去污染的效果非常关键,因此可使用可移动紫外灯(254nm 波长),在工作完成后调至实验台上60~90em 内照射。由于扩增产物仅几百bp,对紫外线损伤不敏感,因此紫外照射扩增片段必须延长照射时间,最好是照射过夜。实验室及其设备的使用必须有日常记录。 (二)标本制备区下述操作在该区进行:临床标本的保存,核酸(RNA、DNA)提取、贮存及其加入至扩增反应管和测定RNA时eDNA的合成。

PCR扩增实验操作步骤

PCR扩增反应一、实验原理 PCR：是一种选择性扩增DNA或RNA的方法，其基本原理是依据体内细胞分裂中的DNA半保留复制机理，以及在体外dNTP分子于不同温度下双链和单链可以互相转变的性质，人为地控制体外合成系统的温度，以促使双链DNA变成单链DNA；单链DNA与人工合成的引物退火，以及在dNTP存在下，耐高温的DNA聚合酶使引物沿单链模板延伸成为双链DNA。 PCR反应分3步：①变性：通过加热使DNA 双螺旋的氢键断裂，双链解离形成单链DNA；②退火：当温度突然降低时，由于模板分子结构较引物要复杂得多，而且反应体系中引物DNA量大大多于模板DNA，使引物和其互补的模板在局部形成杂交链，而模板DNA 双链之间互补的机会较少。③延伸：在DNA聚合酶和4 种dNTP底物及Mg2+存在的条件下，5'→3'的聚合酶催化以引物为起始点的DNA链延伸反应，以上3步为一个循环，每一循环的产物可以作为下一个循环的模板，数小时之后，介于两个引物之间的特异性DNA片段得到了大量复制，数量可达2×106~7拷贝。变性退火延伸图反应历程

二、实验材料 1·模板：细菌DNA 2·TsgDNA聚合酶3·dNTP混合液 4·10倍浓度PCR缓冲液5·2.5mmol/LMgCl2 6·RAPD引物：S14 S15 S18 S66 S74 S88 S97 S103 S110 S115 7·提取细菌DNA的相关试剂三、操作步骤 1．细菌染色体DNA的提取（见上一组） 3·反应程序：将RAPD反应试剂加入EP管中轻混后用100ul石蜡油覆盖于反应混合液之上，防止样品在反复加热-冷却的过程中蒸发，盖好盖子打开PCR反应仪输入以下反应数据 ●94 摄氏度预变性5min ●94摄氏度变性40s ●40摄氏度退火40s ●72摄氏度延伸1min 将EP管放入仪器开始扩增，循环35次；72摄氏度延伸10min 仪器为Model MyGene 25 Plus 三、注意事项 1、PCR反应体系中DNA样品及各种试剂的用量都极少，必须严格注意吸样量的准确性及全部放入反应体系中。 2、为避免污染凡是用在PCR反应中的Tip尖、离心管、蒸馏水都要灭菌；吸每种试剂时都要换新的灭菌Tip尖。 3、加试剂时先加消毒三蒸水，最后加DNA模板和Taq DNA聚合酶。 4、置PCR仪进行PCR反应前，PCR管要盖紧，否则使液体蒸发影响PCR反应。 5.引物条件首先引物与模板的序列要紧密互补，其次引物与引物之间避免形成稳定二聚体或发夹结构，再次引物不能在模板的非目的位点引发DNA聚合反应（即错配）。

CNAS-GL42 2016《基因扩增领域检测实验室认可指南》

CNAS-GL42 基因扩增领域检测实验室认可指南Guidance on the Accreditation in gene amplification Testing Laboratory 中国合格评定国家认可委员会

前言本文件是对CNAS-CL62:2016《实验室认可准则在基因扩增领域检测实验室的应用说明》的解释和说明，并不增加其他的要求。本文件为首次发布。

基因扩增领域检测实验室认可指南 1 适用范围本指南旨在促进基因扩增领域检测实验室对认可技术的理解与执行。适用于申请认可的基因扩增检测实验室建立质量管理体系，已经认可的基因扩增检测实验室规范其质量和技术活动，也可供CNAS评审员在基因扩增检测实验室认可评审过程中参考使用。 2 引用文件 GB/T 6682 《分析实验室用水规格和试验方法》 GB/T 20001.4 《标准编写规则第4部分：试验方法标准》 4 管理要求 4.1 组织 4.1.2实验室有责任和义务保护本国的物种信息资源和基因资源，包括动物、植物和微生物等物种资源。 4.1.5 c）适用时，实验室应在保护客户的机密信息和所有权的政策和程序中体现医学伦理，在采集、接受样本及结果报告期间均应充分保护客户隐私。 4.4要求、标书和合同的评审 4.4.3 评审的内容应包括被实验室分包出去的任何工作，如基因测序工作等。4.4.5当核酸提取或基因扩增无法完时，应向客户做出说明。注：测试样品过度加工、测试核酸样品含量不足或降解等原因，可能导致基因扩增无法进行。 4.6 服务和供应品的采购 4.6.2 分析过程所有实验仅用不含DNA酶和RNA酶的分析纯或生化试剂，所用的水应符合GB 6682一级水的要求。适用时，自制试剂使用前应高压灭菌，不宜高压灭菌的试剂应使用超滤设备（孔径0.22μm）除菌。 4.13 记录的控制 4.13.2 适用时，基因扩增检测中应包括以下技术记录信息：

整个基因克隆实验流程(完整)

整个基因克隆实验流程(完整) -标准化文件发布号：（9456-EUATWK-MWUB-WUNN-INNUL-DDQTY-KII

一、组织总RNA的提取相关试剂：T rizol；氯仿；苯酚；异丙醇；75%乙醇；RNase-free水相关仪器：制冰机；液氮&研钵/生物样品研磨仪；高速离心机；移液器（1ml、200μl、100μl/50μl）；涡旋振荡仪；恒温金属浴。相关耗材：解剖工具，冰盒，离心管，离心管架，吸头（1ml，200μl/300μl），一次性手套，实验手套。实验步骤 1.取暂养草鱼，冰上放置一段时间，然后解剖，剪取肠道50~100mg，放入研钵中，加入液氮迅速研磨，然后加入1ml 预冷TRIzol试剂，充分研磨至无颗粒物存在。 2.转移到离心管中，室温放置5min，使细胞充分裂解； 3.按1ml Trizol加入200μl氯仿，盖上盖子，迅速充分摇匀15s，然后室温放置 3min； 4.4℃，,12000g 离心15min；此时混合物分为三层，下层红色的苯酚氯仿层，中间层和上层无色水相； RNA存在于无色水相中； 5.小心吸取上清液，千万不要吸取中间界面，否则有DNA污染；转移至一个新的离心管，加入等体积的异丙醇，轻轻混匀； 6.室温放置10min；4℃，,12000g 离心10min； 7.弃上清，加入1ml 75%乙醇洗涤；涡旋，悬浮沉淀；4℃，,12000g 离心 5min； 8.弃上清；可以再次用75%乙醇洗涤沉淀； 9.弃上清；用移液器轻轻吸取管壁或管底的残余乙醇，注意不要吸取沉淀；室温放置5min晾干沉淀；（RNA样品不要过于干燥，否则极难溶解） 10.沉淀中加入30μl RNase-free水，轻弹管壁，使RNA溶解。 RNA质量检测相关试剂：溴酚蓝， TEB/TAE电泳缓冲液，溴乙锭（EB）相关仪器：（超微量分光光度计，移液器（2.5μl 或2μl 规格，10μl规格），电子天平，电泳仪，电泳槽，凝胶成像仪，微波炉，制冰机）相关耗材：（无菌无绒纸，吸头，离心管架，PCR管，PCR管架，锥形瓶，烧杯，一次性手套，实验手套，冰盒）（1）RNA纯度的检测：测定其OD260和OD280的值，根据其OD260/ OD280的比值，当其比值在1.9~2.1之间，说明提取的总RNA纯度比较高，没有蛋白质和基因组的污染。（2）RNA完整性的检测：取2μlRNA，与2μl溴酚蓝混匀，用1%的琼脂糖进行凝胶电泳，20min后，在凝胶成像系统中观察效果。当28S与18S条带清晰，

基因操作总结

质粒重组的注意事项 1质粒重组主要包括质粒提取、限制性酶切、目的片段回收、连接及连接产物的转化这五个基本步骤。现在结合本人在实验室长期从事质粒重组的实际情况总结一下质粒重组实验操作的一些注意事项。 1.1 质粒提取：质粒重组对质粒的质量要求比较高；我们实验室是用碱裂解法提取质粒，一般说来，如果质粒的拷贝数比较高而小量制备的质粒量可以满足实验需要的话，那么对于初学者本人不推荐在质粒提取这一步使用大量制备方法，因为大量制备方法步骤过多对质粒的“伤害”要大于小量提取方法且所需时间相对较长。小量提取质粒过程中建议只用酚－氯仿抽提一次即可，上清少取一些（200ul一般）就不需要用氯仿再抽提一次了，最后在用TER 溶解质粒之前质粒的晾干最好是放在37度培养箱内，若质粒提取起始菌液为1.5ml则晾干时间最好不要超过10分钟（一般5分钟即可）；若质粒提取起始菌液为3ml则晾干时间最好不要超过20分钟，质粒晾干后马上加入TER 于60度水浴锅中助溶20分钟。 1.2 限制性酶切：一般我喜欢用总体积为80ul的酶切体系，加入的酶量为1ul（10个单位）。对于将来要做为载体的DNA模板一般切割量是2－3ug；而对于做为外插片段的质粒则要考虑酶切下来的小片段与质粒的长度比例来确定模板量，比如我们要从10Kb的质粒上切下的外插片段长度为1Kb，那么我们的小片段与质粒的质量比为1：10，这样的话我们为了保证小片段有800ng－1ug而需要酶切的模板量则是8ug－10ug。 1.3 目的片段回收：酶切产物经琼脂糖凝胶电泳后于紫外灯照射下切取所要的目的条带时，一定要谨记两个要求：1、一定要快；2、胶块一定要小。 1.4 连接：载体一般加50－100ng左右，外插片段加的量是保证与载体的mol比为3：1即可。本人做连接反应从来不做梯度，因为我坚信如果回收的目的片段质量好的话，一个反应即可成功。 1.5 连接产物的转化：将连接产物转入大肠杆菌常用的方法有电转化法和热激法。电转化法依靠短暂的高压电脉冲造成细胞膜的不稳定，形成电穿孔有利于DNA进入细菌；电转化法转化大肠杆菌时,电压高,脉冲时间长，转化率高，但细胞的死亡率也高且需要购买电转化仪。热激法转化大肠杆菌不需要电转化仪，操作简便，是我们实验室所选用的转化方法。热激法转化细菌成功的关键步骤是感受态细胞的制备，目前常用的感受态细胞制备方法有CaCl

临床基因扩增检验实验室工作规范

临床基因扩增检验实验室工作规范为使基因扩增检验技术有效地应用于临床，更好地为疾病的预防、诊断和治疗服务，保证检验质量，特制定本规范。一、临床基因扩增检验实验室的规范化设置及其管理临床基因扩增检验实验室的规范化设置详见《临床基因扩增检验实验室管理暂行办法》(卫医发[2002]10号文)附件《临床基因扩增检验实验室基本设置标准》。为避免污染，必须严格遵循《临床基因扩增检验实验室设置标准》设置临床基因扩增检验实验室。临床基因扩增检验实验室四个隔开的工作区域中每一区域都须有专用的仪器设备。各区域都必须有明确的标记，以避免设备物品如加样器或试剂等从其各自的区域内移出从而造成不同的工作区域间设备物品发生混淆。进入各个工作区域必须严格遵循单一方向顺序，即只能从试剂贮存和准备区、标本制备区、扩增反应混合物配制和扩增区(简称扩增区)至产物分析区，避免发生交叉污染。在不同的工作区域应使用不同颜色或有明显区别标志的工作服，以便于鉴别。此外，当工作者离开工作区时，不得将各区特定的工作服带出。清洁方法不当也是污染发生的一个主要原因，因此实验室的清洁应按试剂贮存和准备区至扩增产物分析区的方向进行。不同的实验区域应有其各自的清洁用具以防止交叉污染。(一)试剂贮存和准备区下述操作在该区进行：贮存试剂的制备、试剂的分装和主反应混合液的制备。贮存试剂和用于标本制备的材料应直接运送至试剂贮存和准备区，不能经过产物分析区。在打开含有反应混合液的离心管或试管前，应将其快速离心数秒。试剂原材料必须贮存在本区内，并在本区内制备成所需的贮存试剂。当贮存试剂溶液经检查可用后，应将其分装贮存备用，避免由于经常打开反应管吸液而造成污染。含反应混合液的离心管或试管在冰冻前都应快速离心数秒。大多数用于扩增的试剂都应冰冻贮存。为避免因单次反应取液而频繁的冻融主贮存试剂，应分装冰冻贮存试剂溶液。贮存试剂的分装体积根据通常在实验室内一次测定所需的扩增反应数来决定。主反应混合液的组成成份尤其是聚合酶的适用性和稳定性通过预试验来检查，评价结果必须有书面报告。对于"热启动"技术(在第一个高温变性步骤后加入酶)，聚合酶也可不包含在主反应混合液中。在整个本区的实验操作过程中，操作者必须戴手套，并经常更换。此外，操作中使用一次性帽子也是一个有效地防止污染的措施。严禁用嘴吸取液体，加样器和吸头等必须经高压处理。

天津市临床基因扩增检验实验室验收规程

附件１天津市临床基因扩增检验实验室验收规程一、目的加强全市临床基因扩增检验实验室的管理，确保检验工作质量和医疗安全。二、适用范围全市拟开展临床基因扩增检验项目的实验室。三、准备工作（一）人员要求 1.具有检验或检验相关专业资质的本单位在职人员及多点执业人员，其中，本单位在职人员不得少于该实验室工作人员总数的一半。 2.具有一定的分子生物学知识及实验操作经历，了解防污染和生物安全要点并熟练掌握相关仪器设备的使用操作。 3.必须经天津市临床检验中心或其它具有培训资质的机构培训并考核合格，获得《临床基因扩增检验实验室技术人员上岗证》。 4.实验室人员配备应能满足日常工作需要，至少配备有2名以上的实验技术人员。 1

5.实验室专业主管应为本科以上学历、中级以上职称，具有检验或检验相关专业资质的，并从事本专业工作2年以上者。（二）环境要求 1.按照临床基因扩增检验实验室区域设计原则筹建实验室。设置基本原则为有4个独立且完全隔离的工作区域，包括试剂储存和准备区、标本制备区、扩增区以及产物分析区，如使用全自动分析仪，后二个区域可适当合并；各区有明确标识及专有仪器设备和清洁用具等，人流和物流单向流动。 2.所需的电源、水源和温湿度符合实验工作要求。 3.不得与其他实验室混用，无尘、无磁场干扰及无同位素污染。 4.必须有明示生物危害的标志及禁止无关人员入内的标志。 5.有独立的通风设施、生物安全措施，保障实验人员身体健康。（三）医疗机构要求 1.申请临床基因扩增检验实验室的医疗机构应当具备相应功能和临床需求。 2.经行政审批部门核准登记医学检验诊疗科目的二级以上医疗机构或能够出具临床检验报告的医学检验所（独立实验室），有涉及生物安全的样本采集和处理的相应安全等级的实验室。 2

临床基因扩增实验室标准操作程序

**医院检验科程序文件临床基因扩增检验实验室标准操作程序文件编号：版本：第*版依据ISO15189:2003 《医学实验室—质量和能力的专用要求》编制编制：审核：批准：生效日期：年月日

**医院检验科程序文件版序控制

**医院检验科程序文件临床PCR实验室程序文件编号：版本：第* 版生效日期：目录

冰箱使用、维护保养标准操作程序 1．目的：确保冰箱内温度恒定（冷藏室：4oC，冷冻室：-20 oC）。 2．适用范围：PCR实验室所有冰箱。 3．操作人：PCR实验室工作人员。 4．操作步骤： 4.1冰箱应放置于水平地面并留有一定的散热空间。 4.2外接电源电压必须匹配，并要求有良好的接地线。 4.3冰箱内禁止存放与本实验室无关的物品。 4.4放入冰箱内的所有试剂、样品、质控品等必须密封保存。 4.5保持冰箱出水口通畅；非自动除霜冰箱应定期除霜；定期清洁冰箱，清洁时切断电源，用软布蘸水擦拭冰箱内外，必要时可用中性洗涤剂。 4.6 每天由PCR实验室人员负责观察冰箱内温度并记录于表中（要求冷藏2-8°C，冷冻室-20°C），每月一张，一年装订成册存档。冰箱内温度计必须经过计量校准。 4.7若温度超出规定范围，调节温控使其回到正常范围，并进行记录。 4.8若温控调节无效，报请科主任，由设备科维修，修理后须验收合格并签字后方能正常使用。 5．本制度的变动程序本制度的变动，可由任一使用该文件的工作人员提出，报上级负责人决定。如通过则公布实行。 6．引用文件和表格 6.1 冰箱温度记录表

可移动紫外消毒车使用、维护保养标准操作程序 1．目的：确保可移动紫外消毒车正确使用，保障实验室紫外消毒的有效性。2．适用范围：PCR实验室所有可移动紫外消毒车。 3．操作人：PCR实验室工作人员。 4．操作步骤： 4.1打开移动紫外消毒车上的防尘罩卡门，打开防尘罩。 4.2打开移动紫外消毒车头上的卡门栓，将紫外灯架展开到一定高度（90-160度角）。 4.3将移动紫外消毒车移到需要照射的实验室台面附近，将紫外灯管对准台面，通过卡门调节紫外灯离台面的高度，大约60-90cm。 4.4关闭门窗，接通电源开启紫外灯，照射。 4.5消毒完毕，拔掉电源。开启防尘罩卡门，打开防尘罩。开启卡门栓，将展开的紫外灯收回（0角度）。 4.6记录紫外消毒记录表。 4.7用干布或用75%酒精擦拭干净，放置于规定位置。 4.5记录紫外消毒记录表。 4.6紫外灯累计使用时间达1000小时后，更换。 4.7使用中的紫外灯辐射强度由医院院感科监测。 5．本制度的变动程序本制度的变动，可由任一使用该文件的工作人员提出，报上级负责人决定。如通过则公布实行。 6．引用文件和表格 6.1《荧光定量PCR检测流程表》紫外消毒记录

临床基因扩增实验室建设方案

临床基因扩增实验室建设方案 1、概述临床基因扩增实验又称PCR实验,是专门用来检验新型冠状病毒、艾滋病、乙型肝炎、人乳头状瘤病毒等病毒感染性疾病的一种检测手段。它可以通过将病毒体内所含的基因进行扩增的方法,测出一些病毒含量不高的感染者体内是否含有特定的病毒。由于该检测方法可以测出普通检验难以检测岀的病毒并具有灵敏度高、特异性高、快捷、对样品要求低等优点,因此被临床医生广为认可,已广泛应用于医院的临床诊断和各防疫检测部门的疾病诊断。新型冠状病毒（2019-nCoV）是人类分离的第七类冠状病毒。该病毒属于β属，有包膜，颗粒呈圆形或椭圆形，常为多形性，直径 60-140nm。其基因特征与SARS-CoV 和MERS-CoV 有明显区别。目前研究显示与蝙蝠SARS 样冠状病毒（bat-SL-CoVZC45）同源性达85%以上。病毒对紫外线和热敏感，56 度30分钟、乙醚、75%乙醇、含氯消毒剂、过氧乙酸和氯仿等脂溶剂均可有效灭活病毒。基于目前的流行病学调查和研究结果，新型冠状病毒潜伏期为1-14 天，多为3-7 天；传染源主要是新型冠状病毒感染的患者，无症状感染者也可能成为传染源；主要传播途径为经呼吸道飞沫和接触传播，在相对封闭的环境中长时间暴露于高浓度气溶胶情况下存在经气溶胶传播的可能，其他传播途径待明确；人群普遍易感。 2020 年01 月20 日国家卫健委公告：将新型冠状病毒感染的肺炎纳入《中华人民共和国传染病防治法》规定的乙类传染病，并采取

甲类传染病的预防、控制措施。并纳入《中华人民共和国国境卫生检疫法》规定的检疫传染病管理。实验活动暂按第二类病原微生物进行管理。因此，开展新冠病毒核酸检测需要在法律条规、人员环境、生物安全与防护以及质量控制等方面满足并符合国家相关技术规范要求。

基因工程实验的详细步骤

基因工程实验实验一、质粒DNA的提取、分离和纯化试剂 A.LB液体培养基（L）: 1000ml 蛋白胨（tryptone）10g, 酵母提取物（yeast extract）5g, NaCl 10g, 加去离子水至1000ml 用5MNaOH调至pH7.2-7.5。121o C高压下蒸汽灭菌20分钟。 B.LB固体培养基（L）：每升液体培养基加15g 琼脂粉，高压下蒸汽灭菌20分钟。 C.氨苄青霉素（Amp）母液：配成50mg/ml水溶液，-20 o C下保存备用。 Amp使用时配成100mg/ul,按千分之一加入培养基中。 D.溶液I：50mmol/L葡萄糖、25mmol/L TrisCl (pH8.0), 10mmol/L EDTA(pH8.0). 高压蒸汽灭菌15分钟, 储存于4 o C冰箱。 E.溶液II：0.2mol/L NaOH (临用前用10 mol/L NaOH母液稀释)， 1%SDS. F.溶液III: 5mol/L KAC 60ml, 冰醋酸 11.5ml, 水28.5ml. G.RNase A母液：将RNase A酶粉溶于10mmol/L TrisCl (pH7.5)、15mmol/L NaCl, 终浓度为10mg/ml。100 o C加热15分钟，冷却后分装。 H.饱和酚：市售酚需重蒸。重蒸后加0.1%8-羟基喹啉，并用等体积的 0.5mol/L TrisCl (pH8.0)和0.1mol/L TrisCl (pH8.0)缓冲液反复抽提，使pH达到7.6以上。 I.氯仿：按氯仿/异戊醇=24：1混合。 J.酚/氯仿：将上述饱和酚和氯仿按1：1混合。 K.TE缓冲液：10mol/L TrisCl (pH8.0)， 1mmol/L EDTA(pH8.0). 高压蒸气灭菌15分钟, 储存于4 o C冰箱。三、操作步骤 1．细菌的培养和收集：将含有质粒pBS的DH5α菌株接种在LB固体培养基（含50μg/ml Amp）中，37o C培养12-24小时。用无菌牙签挑取单菌落接种到5ml LB液体培养基（含 50μg/ml Amp）中，37 o C培养约12小时至对数生长后期。 2．质粒DNA的少量快速提取---碱裂解法 A.取1.5ml培养液倒入1.5ml ependorf 管中，4o C下12000g离心3min。 B.弃上清，将管倒置于卫生纸上数秒钟，使液体流尽。 C.菌体沉淀重悬浮于100μl预冷的溶液I中（激烈震荡，充分混匀）。 D.加入新配制的溶液II 200μl，快速盖紧管口，并倒置离心管，温和颠倒ependorf管6-8次，以混匀内容物（千万不要震荡）,放置5分钟。 E.加入150μl预冷的溶液III，盖紧管口，并倒置离心管，温和颠倒

STR实验操作

实验二十三复合扩增STR基因座的激光荧光自动检测分型一原理：将多个STR基因座的引物同时加入一个扩增管，优化引物设计和扩增条件，可实现对多个STR基因座的同步扩增。当不同基因座的扩增产物片段大小不同时，可通过电泳分离并区分不同基因座的等位基因片段。对基因片段大小相近和重叠的基因座引物标记不同的荧光物质，可获得荧光标记的扩增产物，通过识别标记的不同荧光物质，可识别电泳分离时片段大小重叠的不同基因座产物。荧光物质含有共轭双键，能够吸收激光并被激发至高能量激发态，处于不稳定激发态的荧光物质跃迁回到基态时，多余的能量以光子的形式释放，可用荧光信号识别记录设备记录下荧光染料发出的光信号。不同的荧光染料具有不同的激发波长和吸收波长，可被光信号检测设备准确识别和记录。310基因分析仪整合了毛细管电用技术和激光激发荧光检测技术，样品电泳进样采用计算机控制的自动电进样，当荧光标记的复合扩增等位基因片断通过毛细管电泳通过检测窗时，电泳时间和荧光种类与强度被自动收集和记录。每个样品电泳中加入已知片段大小的分子量内标，测算每个等位基因片段的相对大小，与基因座等位基因分型标准物比较，确定每个基因座的各个等位基因，对样本的各基因座自动分型。二设备器材与试剂： 310基因分析仪，PCR扩增仪，台式高速离心机，恒温水箱，水浴锅；0.5～2.5μl、0.5～10μl、10～100μl、100～1000μl连续可调移液器，0.5～10μl、10～100μl、100～1000μl高温灭菌塑料吸头，离心管水浴支架，离心管架，0.5ml、1.5ml离心管，0.2ml薄壁PCR扩增管；Chelex，含0.11mmol/L EDTA-Na2的pH8.0、0.005mol/L Tris-HCl缓冲液，荧光标记和非标记的多个基因座混合引物，混合PCR反应液，热启动Taq酶，ROX标记分子量内标，超纯去离子甲酰胺，高温灭菌蒸馏水。三实验操作： 1.血样DNA制备（Chelex法）：剪下约1cm×1cm的纱布血样，剪碎，置1.5 ml离心管，加1 ml高温灭菌蒸馏水，室温浸泡30min，浸泡过程中可不时轻轻震动；血液取30ul EDTA抗凝全血，加入含1 ml 0.1mmol/L EDTA-Na2的0.005mol/L Tris-HCl-（pH8.0）缓冲液的1.5 ml离心管，轻轻混匀，室温30min；15000 rpm离心4 min，尽量弃净上清。加200 uL 10% （w/v） Chelex，56℃水浴30min，

基因操作实验讲义

硕士研究生基因操作实验技术实验讲义实验简介：本实验的目的是将嗜热脂肪芽孢杆菌AS 1411的淀粉酶结构基因（全长1.4kb）采用PCR方法扩增后接入大肠杆菌表达载体pLac18，构建成重组载体pLac18-amy，重组载体再转化大肠杆菌JM109，重组大肠杆菌可以在IPTG 的诱导下表达出耐热α-淀粉酶活性。通过本实验的训练使学生在DNA重组，基因高表达方面得到全面的训练并加深对lac操纵子的理解。实验一质粒DNA的提取、酶切、电泳鉴定 1.1 实验材料 LB培养基：NaCl 10 g/L, Trypton 10g/L, Yeast Extract 5 g/L LB培养基II ：NaCl 10 g/L, Trypton 10g/L, Yeast Extract 5 g/L，Glucose 5 g/L 质粒小量快速提取试剂盒（由北京博大泰克公司赞助）含质粒pLac18的大肠杆菌JM109 台式高速离心机‘水浴锅 1.2 用硅胶膜分离法小量提取质粒这一方法的基本原理是在含强阴离子洗涤剂的碱性溶液中细胞破裂而染色体和蛋白质变性，并和破裂的细胞壁互相缠绕成大型复合物，分子量较小的质粒DNA和RNA释放到上清液中，前者被被十二烷基硫酸盐包盖。当用钾离子取代钠离子时，这些复合物会从溶液中有效的沉淀下来。用SDS和强碱处理细胞是使质粒和染色体分离的关键步骤，这时染色体和其他成分形成的复合物是比较脆弱的，如动作过于剧烈或处理时间过长则会有较多的染色体释放到清夜中在随后用溶液III处理时这部分染色体依然和质粒混在一起，由于质粒和染色体均属于

DNA因此两者很难再被分开。硅胶具有一特殊的性质，即在高离子强度的溶液中可以与核酸专一性的结合，而在离子强度降低后又能与所结合的核酸分离。质粒提取试剂盒就是根据这一原理实现质粒的快速纯化。

临床基因扩增检验实验室工作规范

行。不同的实验区域应有其各自的清洁用具以防止交叉污染。 (一)试剂贮存和准备区下述操作在该区进行：贮存试剂的制备、试剂的分装和主反应混合液的制备。贮存试剂和用于标本制备的材料应直接运送至试剂贮存和准备区，不能经过产物分析区。在打开含有反应混合液的离心管或试管前，应将其快速离心数秒。试剂原材料必须贮存在本区内，并在本区内制备成所需的贮存试剂。当贮存试剂溶液经检查可用后，应将其分装贮存备用，避免由于经常打开反应管吸液而造成污染。含反应混合液的离心管或试管在冰冻前都应快速离心数秒。大多数用于扩增的试剂都应冰冻贮存。为避免因单次反应取液而频繁的冻融主贮存试剂，应分装冰冻贮存试剂溶液。贮存试剂的分装体积根据通常在实验室内一次测定所需的扩增反应数来决定。主反应混合液的组成成份尤其是聚合酶的适用性和稳定性通过预试验来检查，评价结果必须有书面报告。对于"热启动"技术(在第一个高温变性步骤后加入酶)，聚合酶也可不包含在主反应混合液中。在整个本区的实验操作过程中，操作者必须戴手套，并经常更换。此外，操作中使用一次性帽子也是一个有效地防止污染的措施。严禁用嘴吸取液体，加样器和吸头等必须经

临床基因扩增检验实验室管理暂行办法

临床基因扩增检验实验室管理暂行办法第一章总则第一条为规范临床基因扩增检验实验室管理，保证临床基因扩增检验质量，使临床诊断和治疗更为科学、合理，特制定本办法。第二条临床基因扩增检验技术指以临床诊断治疗为目的，以扩增检测DNA或RNA为方法的检测技术，如聚合酶链反应（PCR）、连接酶链反应（LCR）、转录依赖的放大系统（TAS）自主序列复制系统（3SR）和链替代扩增（SDA）等。第三条本办法适用于开展临床基因扩增检验的实验室。临床基因扩增检验实验室设立在二级以上医院。第四条临床基因扩增检验实验室必须使用经国家药品监督管理局批准的临床检验试剂开展临床基因扩增检验项目。第五条卫生部临床检验中心（以下简称卫生部临检中心）和省、自治区、直辖市临床检验中心（以下简称省临检中心）负责对所辖行政区域内临床基因扩增检验实验室的质量监督管理工作。第二章实验室设置和验收第六条拟设置临床基因扩增检验实验室的医疗机构按照《临床基因扩增检验实验室基本设置标准》（见附件）筹建实验室；筹建完成后，由法定代表人向卫生部临检中心提出技术验收申请。申请时需提交以下材料：（一）《医疗机构执业许可证》复印件；（二）可行性研究报告； 1、拟设临床基因扩增检验实验室机构的所在地医疗卫生资源状况、本机构的基本情况、对临床基因扩增检验的需求以及临床基因扩增实验室运行的预测分析；

2、拟设临床基因扩增检验实验室的设置平面图； 3、拟设临床基因扩增检验实验室将开展的检验项目、实验设备条件和有关技术人员资料第七条卫生部临检中心和省临检中心共同组织相关专业的专家组（以下简称专家组），按照《临床基因扩增检验实验室基本设置标准》对提出申请的临床基因扩增检验实验室进行技术验收。验收完成后，在20日内将验收报告寄送至申请机构。第八条经专家组技术验收合格的医疗机构将本办法第六条规定的材料及专家组验收报告送至省级行政部备案。在将符合规定的全部材料送达省级卫生行政部门后15日内未收到省级卫生行政部门不同意的意见，方可开展专家组技术验收合格的临床基因扩增检验项目。第九条未经专家组验收合格并报省级卫生行政部门备案的医疗机构不得擅自开展临床基因扩增检验项目。第三章实验室监督管理第十条临床基因检验实验室必须按照《临床基因扩增检验实验室工作规范》（另发）开展临床基因扩增检验工作。第十一条临床基因扩增检验实验室技术人员必须进行上岗培训。经培训合格者，由培训单位发给合格证书，并将培训合格人员名单报卫生部临检中心备案。获得培训合格证书者方可从事临床基因扩增检验工作。培训单位为卫生部临检中心，或由省级卫生行政部门指定并经卫生部临检中心认定的机构。培训时使用规定的统一教材。第十二条以科研为目的的基因扩增检验项目。不得向临床出具检验报告，不得向病人收取任何费用。第十三条临床基因扩增检验实验室必须按照《临床基因扩增实验室工作规范》开展室内质量控制，并参加卫生部临检中心组织的室内质量评价。

基因工程实验操作

基因工程综合实验操作大肠杆菌常规培养大肠杆菌在LB（Luria–Bertani）液体培养基中，37℃水浴摇床培养12-16小时。在LB固体培养基中，置于37℃培养箱培养12-16小时。如果培养用于提取具有氨苄青霉素（Amp）抗性基因质粒（如pUC18）的菌体，则需在培养基中加入100 mg/ml的氨苄青霉素。在重组子克隆的鉴定培养中，LB固体培养基中还要加入特定的生色底物5-溴-4-氯-3-吲哚-b-D-半乳糖苷（X-gal），浓度为40 mg/ml，以及诱导物异基硫代-b-D-半乳糖苷（IPTG），浓度为50 mg/ml。大肠杆菌染色体DNA的抽提 1. 大肠杆菌传一代后30ml液体LB培养基以10%接种量培养6小时，6000rpm，4℃，离心10分钟收获菌体沉淀。 2. 沉淀中加入 3.6 ml Buffer A（含溶菌酶5 mg/ml），旋涡振荡混匀，37℃保温30分钟。 3. 加入400 ml 10% SDS使最终浓度为1%，混匀，37℃保温30分钟或澄清即可。 4. 加入10 ml 20 mg/ml的ProK至最终浓度为1 mg/ml，60℃保温60分钟。 5. 加入1 ml预先冷冻的5 mol/L NaCl至最终浓度为1 mol/L，充分混匀后冰浴30分钟。 6. 4℃，15 000 rpm，离心30min。 7. 取上清加入等体积（5 ml）的苯酚饱和溶液，充分混匀后4℃，15000 rpm，离心30分钟。 8. 取上清加入等体积的氯仿充分混匀后13000 rpm，4℃，离心10分钟。 9. 取上清加入0.8 V（4 ml）异丙醇充分混匀后-20℃放置30分钟以上，4℃，15000 rpm，离心30分钟。 10. 弃上清，沉淀用3ml 70%的冰乙醇洗涤，4℃，15000 rpm，离心5分钟。 11. 弃上清，沉淀于37℃凉干后，用1 ml ddH2O 溶解并移入Eppendorf管中。 12. 取5 ml电泳。 Buffer A Tris-HCl (pH8.0) 10 mM EDTA (pH8.0) 20 mM DNA酶切在Eppendorf管中建立如下酶切反应体系：置于37℃保温1.5小时，然后电泳检查质粒DNA 5 ml 限制性内切酶 1 ml 10×酶切缓冲液 1.5 ml 无菌重蒸水8.5 ml 总体积15 ml DNA琼脂糖凝胶电泳 1. 用1×TAE–buffer配制0.7%的琼脂糖凝胶，在微波炉中加热至琼脂糖溶解。 2. 待溶液冷却至60℃左右，加入溴化乙锭（用水配1 mg/ml贮存液）至最终浓度为0.5 mg/ml，充分混匀。