(1,3)-β-D葡聚糖的检测方法学研究

摘要

ABSTRACT

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第一章绪论 (1)

1.1引言 (1)

1.2归纳检测(1,3)-β-D葡聚糖的方法 (2)

1.3美洲鲎属G因子α亚基片段a特异性蛋白 (4)

1.4课题研究的目的和意义 (6)

第二章DH5α-pET-15b-Gαa工程菌的构建 (8)

2.1实验材料 (8)

2.2实验内容 (10)

2.3实验结果 (15)

2.4结果讨论 (18)

第三章重组菌BL21-pET-15b-Gαa的原核表达和纯化 (21)

3.1实验材料 (21)

3.2实验内容 (23)

3.3实验结果 (27)

3.4结果讨论 (30)

第四章 (1,3)-β-D葡聚糖的酶联免疫检测方法学的建立 (32)

4.1实验材料 (32)

4.2实验内容 (33)

4.3实验结果 (34)

4.4结果讨论 (36)

第五章 (1,3)-β-D葡聚糖的比浊检测方法学的建立 (37)

5.1实验材料 (37)

5.2实验内容 (38)

5.3实验结果 (39)

5.4结果讨论 (41)

第六章 (1,3)-β-D葡聚糖的碳量子点荧光生物检测方法学的建立 (43)

6.1实验材料 (43)

6.2实验内容 (43)

6.3实验结果 (44)

6.4结果讨论 (49)

结论 (51)

致谢 (52)

参考文献 (53)

第一章绪论

1.1引言

真菌病是由真菌引起的疾病。真菌病包括皮肤中发生的浅部真菌感染和内脏、血液系统、淋巴系统中发生的深部真菌感染。白色假丝酵母是侵袭性真菌感染最主要的的病原，新型隐球菌是免疫低下人群最易感染的病原，烟曲霉是侵袭性真菌感染最重要的丝状真菌[1]。

近三十年来，侵袭性真菌感染（IFI）的发病率和病死率显著上升。深部真菌感染是抵抗力弱的患者更有机会感染的一种病，会发展成为更严重的病[2]。2006年Chamilos G等人调查念珠菌/曲霉混合感染在尸检检出率逐年上升，同时，新出现的不少真菌，例如足放射菌和镰刀菌在尸检检出率也逐年上升，给临床正确诊断和治疗带来很大困难。不同基础疾患中骨髓移植和肝移植侵袭性曲霉病的死亡率较高。在美国49家医院血液分离病原菌及死亡率中，念珠菌的菌株数为934只占其它病原菌的7.6%，但是死亡率高达40%，因此已经成为血液感染的主要治病菌[3]。早期正确治疗与菌血症患者的生存概率直接相关，1999-2003年对三级肿瘤监护中心血液肿瘤患者的尸检结果显示IFI生前诊断仅为尸检诊断的1/6。在IFI的高危患者中，预先应用抗真菌药物以防IFI 的发生，更多的学者认为抢先治疗更能体现疗效[4]。

作为深部真菌感染的病原体的代表，可列举假丝酵母属、曲酶属，任意一个的细胞壁中都存在(1,3)-β-D葡聚糖（βG），它是真菌细胞壁上的特有成分，能被免疫细胞识别[5]。因此在临床上，血浆或血清中的βG的测定被用于真菌感染症的早期临床诊断、治疗效果和康复的判断[6-7]。在临床上，正常血液中的(1,3)-β-D葡聚糖含量小于10pg/mL，其含量若大于20pg/mL，可诊断此病人患有侵袭性真菌感染，若含量在10pg/mL与20pg/mL之间，则表明该检验品有(1,3)-β-D葡聚糖存在，此人有侵袭性真菌感染的危险[8]。

扩大了POCT应用范围和概念，快速导向性的病原检测其中就有G试验。侵袭性真菌感染的诊断标准与治疗中国血液病/恶性肿瘤患者，均将G试验作为临床诊断的指标[9]。因此对βG进行测定，实现真菌感染的早期诊断并对检测结果为阳性的患者进行早期治疗，是提高患者生存质量的关键[10-11]。

新鲜的食品啤酒酵母、燕麦、食用菌类等物质中均含有βG，其活性结构是由葡萄糖单位组成的多聚糖，它能够活化巨噬细胞、嗜中性白血球[12-16]。因此广泛应用于医药、食品、化妆品等行业。βG含量的测定能够满足现代生物检测各领域日益增长的需求。

裂褶菌多糖（SPG）是β-葡聚糖的一种，它是由(1→3)-β-D-葡聚糖为主链和