免疫胶体金标记手册

浙江大学电子显微镜室浙江大学生物技术研究所胶体金免疫标记技术培训班

技术资料

胡东维洪健徐颖

浙江大学

2０0１年1０月

一、胶体金的制备

根据不同的制备方法,可以制备出直径1-500nｍ的胶体金粒子，但做为免疫标记探针,其直径应在３－３0nm范围内。

在氯化金（HＡuＣl4）水溶液中加入还原剂使之还原并聚积形成胶体金粒子。使用不同种类、不同剂量的还原剂，可以控制所产生的粒子大小。即粒子大小取决于反应溶液中最初还原试剂和还原核的数量。还原剂浓度越高,核浓度也越高，氯化金的还原也就从更多的还原中心开始,因此产生的胶体金粒子数量越多,但体积也越小。粒子直径每增加一倍,数量减少为原来的1/8。

以柠檬酸钠和单宁酸做还原剂，能够制备大小相对一致、直径３~16nm的胶体金。因此一般胶体金探针均使用该方法进行。但该方法制备的胶体金粒子直径范围较窄，而且残留的多聚单宁酸残基往往干扰某些蛋白与金粒子的结合。此时在溶液中添加0．1～0.２％的H2O2能够去除这些残基。双标记或制备5－10 nｍ的胶体金时建议使用该方法。

利用柠檬酸为还原剂，可以制备１2～150 ｎm直径的胶体金。但制备大体积的胶体金时，胶体金粒子的误差也同时增加。因此做单标记时,建议使用该方法制备1２-16 nm直径的胶体金。

除了上述方法外,也可以用磷作为还原剂来制备５ nm的胶体金，它避免了单宁酸残基的问题，但所形成的金粒子体积变化较大。磷易燃且有毒,制备的残液需进一步处理，故该方法已经很少使用。

氯化金极易吸湿,故一般均以小剂量密封保存（０.5ｇ或1ｇ)，因此在配制氯化金溶液时一次配完,暂时不用的可以用1.5 ｍl试管分装为1 ｍl保存(－2０℃)。注意各种玻璃器皿一定要洗净并用双蒸水多次冲洗,有条件时可硅化处理（1%双氯硅烷／氯仿浸泡1小时,烘干)。配制各种试剂时均使用双蒸水，随后再用0.22 m微孔滤膜过滤后使用。三角瓶可反复多次使用，不用时应密封保存,以防污染。

制备好的胶体金保存寿命较长，可4℃保存6个月以上或室温下保存１-2个月。当出现明显悬浮物或沉淀后表示已不可再用。但无论无何，在保存较长时间后应进行镜检，如出现大量胶体金粒子凝集，说明已经过期。

1、单宁酸/柠檬酸钠法制备3~16 nm胶体金

(1)取一25０ ml三角瓶，加入79 ｍl双蒸水和１ ml 1％氯化金,预热至60～7０℃。

(2)取一50 ml烧杯，加入4 ml 1%柠檬酸钠,然后根据所制备金粒子体积大小加

入不同用量的单宁酸及等量的２5 mＭ K2ＣＯ3。预热至６0～70℃。Ｋ2CO3的作用

是保持溶液的中性pH。因此如果单宁酸的量少于0.5 ml时,对ｐH的影响不大，K

２ＣO3可以省略。

(3)将上两种溶液迅速混合并充分混匀，加热至沸并保温１0分钟。自然冷却。

柠檬酸钠(ml）单宁酸(l）胶体金（nm）

4５0003

420０04

4500６

41２08

47010

410１6

2、白磷还原法制备5 nm胶体金

(1)取2５0 ｍl三角瓶一个,加79 ｍl双蒸水，1 ml 1%氯化金,并用0.25 ＭＫ

２CO3将溶液调至中性（ｐH7.0）。

(2)取0.2 ｍl饱和磷/乙醚溶液加到1.5 ml试管中，再加0．8 ml乙醚，混匀。取

0.7 ml加入溶液(1)中(磷有毒且易燃，操作请带手套,多余的磷溶液用CuＳＯ４

进行中和)。

(3)室温下轻轻摇匀１5 min，然后加热沸腾并保持5 mｉn，自然冷却。

3、柠檬酸三钠法制备１２-3０nｍ胶体金(Ｆreｎs，１97３)

(1)取25０ｍｌ三角瓶一个,加10０ mｌ双蒸水及1 ml 1%氯化金,加热沸腾;

(2)取不同量的1%柠檬酸钠加入上述溶液中。混匀,再保持沸腾30 mｉn,溶液颜色首

先变黑,再逐渐变红,粒子体积较小时,溶液呈桔红色，而粒子体积较大时,则颜色偏向紫色。

注意:柠檬酸钠(ml) 胶体金(nm)

5 12

4 16

3 24

2.8 30

(1)由于使用试剂质量及其它方面可能存在的误差，以及制备过程中的其它问题,胶体金粒子的大小

及一致性与理论值可能有偏差,因此,在制备完成后必须进行镜检。如出现粒子体积偏差太大，

粒子凝聚,粒子边缘不清晰等问题,须重新制备。

(2)胶体金溶液最好保存在4℃冰箱中;也可保存在室温下，一般可保存1-2个月。但决不可保存在

0℃以下,否则金粒子发生凝聚。

二、蛋白-金复合体的制备

一般认为胶体金粒子表面为一层AuCl2，因此，粒子表面带有负电荷，这种负电荷粒子之间相互排斥,形成稳定悬浮的胶体金溶液。

金颗粒表面可以包被一层生物大分子（如蛋白）来稳定和保护这些粒子，以免受外来电解质的影响而相互凝聚在一起。胶体金粒子对蛋白的吸附作用取决于pH值,这是因蛋白的净电荷取决于溶液的pH值，在pH=pI时为中性。由于在pH=pI时蛋白溶解度最小,因此这时它水化程度最小,最溶液吸附到疏水的金粒子表面。但在实际的胶体金探针制备中,一般胶体金调整为pH=PI＋0.5，这样蛋白带正电,有利于结合更稳定。

胶体金探针所用蛋白必须要经过前处理，其目的在于(１)去除高浓度的盐分,高浓度的盐分往往干扰蛋白与胶体金的吸附结合,或导致胶体金粒子的凝聚,这一步往往采用低

浓度缓冲液中进行。（2）使蛋白分子尽量分散为单体，冻干蛋白或高浓度蛋白溶液中蛋白分子往往凝聚为多聚体大分子,可同时与多个胶体金粒子结合,影响标记的灵敏度和定量

分析。（3）使蛋白具有适当的分子量。蛋白分子量过小（30 kD）,形成的蛋白复合体往往是不稳定，可短时间内失活。而分子量过大时，被认为影响探针的灵敏度，特别是已知蛋白的结构与活性中心的情况下,去除对活性武影响的结构部分是提高标记灵敏度，延长探针寿命(防止凝集)的有效办法。把分子量过小的蛋白与其它蛋白（如BSA，牛血清蛋白等)结合后,能制备出稳定性更佳的探针。

当蛋白前处理完成后，接着要确定胶体金与蛋白结合的最佳pH值。对于理化性质不确定的蛋白这一步尤为重要。过量的蛋白与不同pH值得胶体金结合后，只有某一特定pH 值能够形成结合最稳定的探针。在高浓度电解质（如NａＣｌ）作用下不会凝聚。不同蛋白的适宜pＨ范围的宽窄大不相同。一般选择最小适宜pH值为最佳pH值。但有些探针的实际情况并不完全如此,最稳定发探针并不完全代表活性最好。这要靠实验验证。

在确定最佳pH值后，最后要确定最小蛋白量,即能够形成稳定探针的蛋白的最小量。如果在制备探针时加入太多的蛋白,不仅造成浪费,而且更为严重的是容易造成探针凝聚,并严重影响标记活性。因为探针溶液中的游离蛋白容易抢先与标记位点结合,起到“封闭”（Ｂlｏckinｇ)作用，而胶体金探针标记不上。在标记位点希少、被标记物含量较少的情况下要特别注意。

这里需要特别指出的是，使用不同直径的胶体金与同一蛋白结合时,除了蛋白量完全不同外,往往最佳pＨ也有一定变化。

因此,在探针制备每一环节应随时监测探针对分布情况、负染结合及活性。

1、抗血清的前处理

一般抗血清中IgＧ的含量为10-25%,而绝大部分为其它蛋白。用抗血清直接制备探针其标记活性与特异性均不理想。因此需去除其中多数杂蛋白。但处理环节不宜太繁，在实验室设备与经验缺乏的情况下更是如此,否则会导致IgG活性的大幅降低。如果你的实验室在蛋白纯化方面有很强的技术支持,高度纯化后效果会更好。

大量工作表明,只用硫酸铵沉淀就可以得到足够纯度及高活性的ＩgG蛋白。其基本步骤如下：

(1)取抗血清0.2 ml;

(2)加生理盐水(0．85％ NaＣl）0.3 mｌ，混匀；

(3)逐滴加入饱和(NH4)2SO4０.5 ml,充分振荡混匀,4℃静置1 h;

(4)10000 ｒpm/min离心2０ｍin,弃上清;

(5)加0．5 ｍl生理盐水重悬浮,混匀；

(6)逐滴加0.25 ｍｌ饱和 (NH4）2SO4，充分振荡混匀,4℃静置1 h;

(7)10０00 rpｍ/ｍin离心２0 ｍin，弃上清；

(8)重复5～8步骤一次;

(9)加生理盐水0.5 mｌ重悬浮,混匀；

(10)生理盐水中透析１2～24 h；

(11)在0.2 M pH 9.０硼酸缓冲液透析1２~2４ h;

(12)分装,即将使用时４℃保存，备用-20℃保存。

为最大限度保持抗体活性，整个过程应在４℃下进行。对于冻干抗血清或长时间保存的血清，将生理盐水透析改为3 M ＫCNＳ透析,促使聚合的多聚体解聚。如果抗血清效价较低时，不宜准备胶体金探针。

2、亲和纯化抗体的处理

亲和纯化抗体多是一些商品化的通用抗体,即二抗。一般为羊抗兔、羊抗鼠或羊抗人的抗体。这些抗体一般有两个问题，一是ＩgG分子往往聚集为多聚体分子,二是往往含有较多的盐分。因此前处理的目的在于脱盐和解聚。

其基本步骤如下：

(1)将亲和纯化抗体用生理盐水稀释为0．5-１ mg／ｍｌ浓度

(2)在3 M KＣＮS(硫氰酸钾)溶液中透析1２h

(3)在2 mMol ｐH 9.０的硼酸缓冲液中透析1２ h(更换透析液数次）

(4)分装备用

其它蛋白可参考此方法进行。但注意后一种透析液的pH值应与交联时pH值一致。在实际运用中,一般省略去3M KCNS透析这一步,特别是当蛋白分子量较小,且为非糖蛋白时。我们建议在制备通用探针（如二抗ＩgＧ,PｒoteiｎＡ,Ｐrotein G，Streptａｖidin)等时,严格使用该方法,而制备直接标记探针时，也可以忽略处理步骤。

3、IgG Ｆab片段的制备

一般来说体积较小的探针具有相对较高的标记活性。主要原因在于胶体金颗粒较小时有利于在标记溶液中的扩散运动;在胶体金直径一定时，蛋白分子量越小,金表面吸附的蛋白分子越多,活性位点也越密集，也容易于靶位点结合。

IgG分子量为150 kD左右,由4个亚基组成，即两条重链(Ｈ）和两条轻链（L）。用水解酶(木瓜蛋白酶）水解后可得到两种片段,即Fａb和Fc。其中Fab是具有抗原识别活性的部分，回收后制备探针。Fｃ能够与Protein Ａ和Proteｉn G特异性结合。但这种分离只能在有条件的实验室进行。

其基本过程如下:

(1)用PBS(pH ７.０，含10 mM EＤTA，20 mM盐酸半胱氨酸)溶解纯化的IgＧ

(2)加固化木瓜蛋白酶

(3)３7℃处理5h

(4)离心，去除固化木瓜蛋白酶（沉淀)

(5)过Ｐroteｉn G柱

(6)纯化的Fab片段按前文方法做进一步处理

注:Fab与胶体金结合的pH值为6．5

4、蛋白与胶体金结合最佳pH测定

（例纤维素酶，pI未知）

(1)取若干个1．5ml试管，分别加入1 ｍl 10 nｍ胶体金;

(2)用２５ mM K2CO3将ｐH分别调为3，4，5,6，7,8，9，１０；

(3)取一9６孔培养板,按pH从低到高分别将上述胶体金分别取1０0 ｌ加入孔中，

重复三次;

(4)每孔分别加入３ｌ浓度为1 ｍg/ml的纤维素酶,混合，室温下放置1０-1５

miｎ；

(5)每孔分别加入20 l浓度为10％ NaＣl溶液,混合,室温下放置１０ mｉn;

(6)观察胶体金颜色变化，记录保持红色的最低ｐH(Ｘ);

(7)重复（1）-(５)步,ｐH梯度为X-0.6;X-0.3;X；X+0．3；X＋0.６；X+１。

(8)观察胶体金颜色变化直到室温下放置２小时，记录仍保持红色的最低ｐH。

注意:

１.如胶体金粒子直径较小（3～６nm）,加NａCl需放置较长时间（几个甚至十几个小时）后才能观察到颜色变化。必要时可放大反应体积(1 ml胶体金）,并借助离心来判断。

2.有些蛋白最佳pH范围较窄，设置的梯度不能太大。

5、最小蛋白浓度的确定

(1)用０．2２m微孔滤膜过滤或高速离心去除蛋白中残物或多聚体；

(2)取一96孔滴定板,每个重复为若干个孔，分别加入最佳pH的胶体金10０l，

重复3次；

(3)各孔依次加入不同量的蛋白（一般浓度为0.05-0.1 ｍg／ml)1～20 l，混匀，

室温下放置１5ｍｉn;

(4)加入20 l 10% NaCl，室温下放置１０min;

(5)颜色仍保持红色的最小蛋白用量即最小蛋白浓度。

(6)为确保结果准确性，可放大反应体积重复以上步骤。

注：在实际探针制备工作中,蛋白浓度往往为最小浓度的1３0％。

6、ＩｇG-gｏｌｄ的制备

(1)取两个1.5 ｍl试管，分别加入1.2 ml 10 ｎm胶体金;

(2)加入适量25 ｍM Ｋ2CO3把pH调整为9.０；

(3)分别加入10 l浓度为１ mg/mｌ IgＧ,混匀,室温放置10mｉｎ；

(4)分别加入12 ｌ２% ＰＥG２0000，室温放置5 min；

(5)１0000 rpｍ离心20 ｍｉn,轻轻吸除上清;

(6)用20 l ＢL溶液重悬浮松散的胶体金沉淀,并集中到新管中;

(7)分别加２0 l 甘油,充分混匀;

(8)－20℃保存备用。

注意：

1）.不同直径胶体金所需要的蛋白量差别很大;

2).不同直径胶体金所需离心速度完全不同。以绝大部分探针形成松散沉淀为原则。离心力太大，会产生不可逆的探针凝聚;离心力太小，探针无法沉下。最好能够直接用胶体金在不同转速下离心以确定适当的离心力。

3）.在冷离心机中可适当延长离心时间，同时适当减小离心力,探针活性较好。

4).ＩｇG的最佳交联ｐＨ有多种报导，从7.4－9.0。一般认为，７．4时胶体金结合的蛋白最多，9.0时制备的探针最稳定。

三、样品的固定、包埋与标记

1.固定

为了减少对标记底物结构的破坏,细胞化学样品固定的时间相对较短,多为１-３小时。环境温度一般在25C以下。

低温固定剂一般采用2-３%甲醛与１%戊二醛。甲醛分子量小、渗透快,对蛋白质结构影响小,可较好地保存其抗原活性。但对细胞整体的细微结构保存欠佳。戊二醛对细胞的细微结构保存较好，但往往导致蛋白失去抗原活性。因此,在标记低物不是蛋白质或多肽时（如纤维素、多酚类化合物、－1,３-葡聚糖、几丁质等），可用常规方法进行4%戊二醛和1%锇酸的双固定。

2．包埋

根据标记低物的不同，可以选择常规(常温)包埋剂或低温包埋剂包埋样品。如果标记物为蛋白质,特别是性质不稳定或不清楚时,建议使用低温包埋剂包埋，以最大程度保存抗原活性。大量实验表明，K4M是目前使用最为普遍的低温包埋剂。当选择常温包埋剂时,建议使用Ｓpｕrr包埋剂。Spurr包埋剂粘性小,易渗透,易操作;包埋块不吸潮,保存时间长。

3．标记

根据标记程序的不同，标记分直接与间接标记。直接标记指胶体金探针直接与被标记底物结合；而间接标记指胶体金探针通过一或多个中间标记物后与底物结合。

直接标记间接标记

直接标记需要制备胶体金探针,其好处是标记特异性好,背景小,能够做阴性对照。间接标记无需制备胶体金探针，可以直接购买通用二抗探针,缺点是标记特异性较难把握，背景较高,不能够做阴性对照。

在做病毒粒子标记时,直接标记法可用抗体直接富集低浓度或稀有病毒而不会增加任何背景。

影响标记的因素主要包括以下方面：

(1)pH

pH变化会对探针蛋白的结构与活性中心产生影响,继而影响到标记强度与特异性。在很多情况下探针作用的最佳pH值往往与该蛋白作用的最佳pＨ值有一定差别。例如有一种来自真菌的纤维素酶本来在pH 4.8时活性最强,但结合到胶体金上后,pH在6.０左右时最强,当pH到７.2时仍有较强的标记活性。

(２）离子环境

有些蛋白只有在一定离子环境中才有生物活性,其中很多涉及Ca2+,Ｍg2+,Ｍn2+，Cu2＋等阳离子。有时溶液中Ca2+、Cu2+等容易形成不溶性沉淀而导致标记失败；因此,在配制标记溶液时要注意各种阴阳离子的配伍,添加顺序及溶液pH。

(3)温度

标记温度对标记活性及特异性影响最大，也最容易出问题。以水解酶类做成的胶体金探针对温度变化也更为敏感,不同温度、不同时间标记出的切片其视觉效果完全不一样。在此特别指出一点,在用内切的水解酶探针时,切忌温度过低，时间过长,否则会出现标记的扩散现象。建议在可能时尽量使用外切酶探针。

在使用ＩｇG或Ｐｒoｔeｉn Ａ,Prｏｔein G探针时,有人认为在４℃下长时间标记特异性最好。但我们研究发现事实并非如此，在25℃以上的室温下标记2０-６0 mｉn其特异性更好。

一般来说，如果用来自植物或微生物的蛋白做探针，标记温度最好在25℃左右;用来自动物的蛋白做探针时，标记温度最好在30℃左右。

(4)封闭液组成

封闭液对封闭有关非特异性活性基团,特别是醛基至关重要。在多数情况下封闭液与探针重悬浮液、标记溶液是一样的。目前最常用的封闭液组分有BSA、卵清蛋白、脱脂奶粉、PEＧ2０000等。在用IgG、Ｐrotｅｉn A、Pｒotｅｉn G等标记时,应优先选用ＢSA(组分五);在植物凝集素类探针标记时,应优先选用PEG20000。也有人发现ＩgG探针标记时脱脂奶粉最佳。

如果是用交联蛋白做成的探针，那么封闭液中最好有载体蛋白的成分。

４.样品的低温包埋的基本程序

(1)将新鲜样品切成1×１×3 mｍ3的小块，立即放入3％甲醛和１％戊二醛的磷酸

缓冲液(10０ mM, pＨ 7.2)中４Ｃ下固定2 h;

(2)在４C依次用３0%、５0％乙醇溶液脱水,每步30 min；

(3)在-２０C冰箱中依次用50%、70%、90％、100%、1０0%、１０0%乙醇溶液脱水,

每步６0 min；(注意乙醇溶液首先在冰箱中预冷!)

(4)在-2０C冰箱中依次用３0％、７0%、100%的K4Ｍ渗透，每步1２0 miｎ;注意

不断轻轻摇动样品使渗透完全。

(5)在4 C K4Ｍ树酯包埋。注意包埋剂应尽量装满,否则气泡中的氧气会抑制包埋

剂的聚合。

(6)在-20C冰箱中长紫外线照射聚合72 h。室温下聚合４８ h。注意每天翻动2次

样品使紫外光照射均匀。

(7)聚合后的样品应及时切片,长时间放置会导致样品与包埋剂之间分离而无法切片。

(8)超薄切片应收集在镍网、金网或铍网上做胶体金标记。

与其它标记用包埋剂相比,K4M可在－35C低温下仍保持较低的黏度;K4Ｍ有极性,亲水，易脱水,易标记;聚合后交联度高，易切片。

K4Ｍ的配方根据材料的性质确定。植物或坚硬的材料包埋剂的硬度要高；动物或幼嫩材料包埋剂的硬度要低。具体参见包埋剂说明。

注意:

(1)K4M有毒,须带ＰVC或ＰＶDV手套谨慎操作。溅入眼睛或皮肤时请立刻用清水冲

洗。

(2)所有脱水乙醇须提前预冷。

(3)脱水过程中防止样品结霜吸潮。

5．样品常温包埋（常规）的基本程序

（1）将新鲜样品切成1×1×3mm３的小块,立即放入4%戊二醛的磷酸缓冲液(10０ｍＭ, pH 7．２)中4C下固定6－１２ h；

（2）样品用磷酸缓冲液冲洗３次每次5 min;然后在２%锇酸溶液中固定１ｈ；冲洗3次，每次5分钟。(通风橱中戴手套进行，含锇酸废液倒入食用油中!)

（3）在4C或室温下依次用3０%、50％、7０%、90%、100%、1００％、100％乙醇溶液脱水,每步15 ｍin;

（4）依次用30%、7０％、１00％的Spurr包埋剂渗透，每步120 min;然后在1０0%的Spuｒr包埋剂中过夜。

（5）Sｐurr包埋剂包埋。可包埋在0．５mｌ的离心管中,每管加0.3 ml包埋剂即可。加入纸标签。

（6）在70C温箱中聚合12－1６ h。

（7）聚合后的样品可长时间保存。超薄切片应收集在镍网、金网或铍网上做胶体金标记。

6.胶体金直接标记基本程序

(1)在培养皿中铺上石蜡膜(ｐaｒaｆｉlｍ);四周加吸水纸和水以保湿；

(2)加一滴dd H２O，镍网切片向下漂浮2 min;

(3)另滴５0 ｌ封闭液（BL),将镍网切片向下漂浮30 min;

(4)另滴５0 ｌ封闭液（ＢL),加入2-3l胶体金探针，充分混匀;将镍网切片向

下漂浮30 ｍiｎ；

(5)标记后镍网的在dd H2O上漂洗除去未标记的胶体金探针，共漂洗3次,每次5-10

min；晾干;

(6)常规染色,观察。

7.胶体金间接标记基本程序

(1)镍网切片向下在dd H２O上漂浮２ mｉn;

(2)在封闭液（BL)上漂浮30 min;

(3)把一抗用BL稀释10０-50０倍，将镍网切片向下漂浮３０－60 min；

(4)dｄH２Ｏ漂洗两次各５ mｉn，除去多余一抗;

(5)在封闭液(BL)上漂浮30 min；

(6)用胶体金探针标记30 miｎ;

(7)dd H2O上漂洗除去未标记的胶体金探针，共漂洗3次，每次５－10 ｍiｎ；晾干;

(8)常规染色，观察。

8.利用胶体金间接标记法进行双标记的基本程序

(1)镍网切片向下在dd Ｈ2O上漂浮2 min；

(2)在封闭液(ＢL)上漂浮30 min；

(3)把一抗Ａ用ＢL稀释１00-5００倍，将镍网切片向下漂浮３0-60 miｎ;

(4)ｄd Ｈ2O漂洗两次各５ mｉｎ，除去多余一抗A;

(5)在封闭液（BL）上漂浮３0 mｉｎ；

(6)用小颗粒胶体金探针A标记30 min;

(7)dｄ H2O漂洗两次各5 min,除去多余胶体金探针A；