宏基因组测序讲解
研究与特定环境与相关的代谢通路，以及
微生物与环境，与宿主的关系。
基因组 ( Metagenome)(也称微生物环境基因组 Microbial
Genome, 或元基因组) 。是由 Handelsman 等 1998 年提出的新
其定义为"the genomes of the total microbiota found in nature" ,
它包含了可培养的和未可培养的微生物
目前主要指环境样品中的细菌和真菌的基因组总和。而所谓宏基因组
(或元基因组学， metagenomics) 就是一种以环境样品中的微生物群体基因
以功能基因筛选和/或测序分析为研究手段， 以微生物多样性、
进化关系、 功能活性、 相互协作关系及与环境之间的关系为研究
一般包括从环境样品中提取基因组 DNA, 进行高通
或克隆DNA到合适的载体，导入宿主菌体，筛选目的转化子等工作。
基因组 ( Metagenome)(也称微生物环境基因组 Microbial
Genome, 或元基因组) 。是由 Handelsman 等 1998 年提出的新
其定义为"the genomes of the total microbiota found in nature" ,
它包含了可培养的和未可培养的微生物
目前主要指环境样品中的细菌和真菌的基因组总和。而所谓宏基因组
(或元基因组学， metagenomics) 就是一种以环境样品中的微生物群体基因
以功能基因筛选和/或测序分析为研究手段， 以微生物多样性、
进化关系、 功能活性、 相互协作关系及与环境之间的关系为研究
一般包括从环境样品中提取基因组 DNA, 进行高通
或克隆DNA到合适的载体，导入宿主菌体，筛选目的转化子等工作。
宏基因组研究将使人们摆脱物种界限，揭示更高更复杂层次上的生命运动
在目前的基因结构功能认识和基因操作技术背景下，细菌宏基因组成为研
细菌宏基因组细菌人工染色体文库筛选和基因系统学分析
更深入地洞察细菌多样性。如宏基因组
是一种整体性的研究策略，它建立在微生物基因组学的迅速
是一种不依赖于人工培养的微生物
涵盖了生物信息统计分析和基因组两方面的意义和技术，其策
DNA，将大片段的DNA克隆到受体菌中表
然后根据某些生物活性筛选有应用价值的克隆。包括两个方面[920]：①
宏基因组文库的构建沿用了分子克隆的基本原理和技术方
并根据具体环境样品的特点和建库目的采用了一些特殊的步骤和对策。一般
DNA 的提取、与载体连接和在宿主细胞建立中克隆[17]。②宏基
根据其研究目的，宏基因组文库筛选通常有功能筛选
和序列筛选(sequence based screening)两种方法。
宏基因组学的研究步骤
一般包括从环境样品中提取基因组DNA，克隆DNA 到
4个步骤。特别要指出的是，在基
其研究目标通常是测定单一物种的基因组序列；而在宏基因
(community)的混合基因组序
这种差别的关键就是，绝
大多数细菌是不可培养的，因此没有足够的研究材
分离特定环境生物DNA
DNA的做法，而是首先直接收集能
然后利用各种理化方法破碎微生物，使
DNA，再利用密度梯度离心等方法进行分离纯化。
纯化的大分子量DNA进行克隆
DNA 酶切或者超声打断处理，并与合适的载体DNA 进行连接，构建重
将带有宏基因组DNA的载体通过转化方式转入模式微生物建立各自的
DNA 在
DNA 载体的
对宏基因组文库的DNA 进行分析
有很多分析方法，主要分为两类：一类为表型功能筛
即利用模式微生物表型的变化筛选某些目的基因。例如从文库中筛选能表达
功能分析法根据重组克隆产生的新活性进行筛选，可用于检测
DNA 进行测序分析，以应用于生态学研究。例如
16SrRNA序列，对所研究生态环境的多样性进行评估。一个典型的宏
以确保从生态环境标本中分离到目的基因，及尽可能
DNA序列所编码的信息。
宏基因组学的技术方法
以功能基
相互协作关系及与环境之间的关系为研究目的的新的微生物研究方法。宏基
现按照宏基因组学研究的基本过程和策略对
样品总DNA的提取及基因或基因组DNA的富集
DNA必须可以代表特定环境中微生物的种类，尽可能代表自然状
DNA是宏基因组文库构建的关键之
DNA，又要保持
[45]。所以总的提取总是在最大
DNA 片段的
已有许多商品化宏基因组DNA提取试剂盒可用，同时很多实验室仍
DNA提取方法的改进[68]。
(细胞提取法)。直接裂解法是将
继而抽提纯化，包括物理法(如冻融法、
)和化学法、酶法等。不同直接裂解法的
此法操作容易、成本低、DNA提取率高、
但由于强烈的机械剪切作用，所提取的DNA片段较小(1-50kb)，难以
DNA，如先采用密度梯度离心分离微生物细胞，
DNA。此法可获得大片段
且纯度高，但操作繁琐，成本高，有些微生物在分离过程中可能
DNA也不容易抽提出来。
需要在克
[911]，一个比
[12]。
[13]是抑制性与消减杂交技术相结合的更简单、更快速
该方法不仅利用了消减杂交技术的消减富集，同时也利
宏基因组文库的建立
偏重于低拷贝、低丰度基
高丰度基因要取决于研究的目的是单个基因或基因产物还是整个
基因文库的建立过程中需要选择合适的克
传统的方法是直接利用表达载体构建宏基因文库，但是表达
10kb。克隆中宿主菌株的选择主要考虑到转
宏基因的表达、重组载体在宿主细胞中的稳定性以及目标性状的筛选等。
[14]，此外，链霉菌和假单胞菌也可以作为构建
不同微生物种类所产生的活性物质有明显差异，不同的研究目标应
宏基因组文库的筛选
需要通过高通量和高灵敏度的方法来筛选和
:①基于核酸序
列差异分析；
③基于底物诱导基因的表达；④基于包括
基于序列的筛选方法
PCR引物，通过杂交或
扩增筛选阳性克隆。用这种方法有可能筛选到某一类与已知序列相近的新基
这一策略可以分离已知基因家族的新成员和含有高度保守区的酶基因[15
。另一种方法是对含有16S rRNA等系统进化锚定基因的克隆进行测序或对文
[17]。优点是不必依赖宿主菌株来表达克隆基因，缺点是必须对相关
文库中那些和现有基因序列完全不一样的基因无法被筛
故难以发现全新的活性物质，对鉴定新的基因成员有一定的局限性，也很难
(sequencedriven screening method)是对所构建宏基因
[1820]。也可用
但需要进行大量的测序和分析工作，需大量人
DNA序列分析技术不断发展，但与个体微生物基因相比，
但对这些序列片段进行后续的分析则极为
(基因芯片)进行初步筛选，可以很大程度上减少测序量和后续
但微阵列技术在用于宏基因组文库筛选时，除了其本身由
灵敏度较差等缺点外，同样不能用于对未知功能
[2122]。
基于功能的筛选方法
通过建立和优化合适的方法从基因组文
然后通过序列和生化分析研究这些克隆。由于基
故能较快地找到可用于工农业和医药的蛋
功能性筛选的方法有两种，一种是对具有特殊功能的克隆子进
(如含有化学染料和不可溶的或发光的
)的表型特征进行筛选[23]。这种方法具有较高的灵敏度，可检测到
另一种方法是基于异源基因的宿主菌株与其突变体在选择性条
[24]。
快速，只要基因能表达，就可以
不需要复杂的实验过程。不足之处是这种筛选方法
但使用模式微生物并不能把所有的宏基因组
表达出来，而且要求克隆到基因或基因簇的全长，一旦克隆过程中破坏基因
也就不能根据功能进行筛选，故检出的概率很低，
底物诱导基因表达筛选(substrateinduced geneexpression
是用于能利用各种底物诱导的分解代谢型基因的检出，并结合生物发
[25]。由于编码相关代谢基因或酶基因通常呈
通常与该物质诱导的启动子和同源转录调控序列毗邻，往往在有底物诱
(GFP)的表
这个载体可将宏基因组DNA克隆到GFP基因上游，使该基因的表达受到
DNA片段中的启动子调控。当外加目标底物时，可以影响GFP的表达，
(fluorescence activated cell sorting, FACS)，
就能够得到对该底物具有代谢活性
在宏基因组研究中具有很多优势，它提供了一个有效的和经济的检测
勿需担心因修改底物而产生毒
且可以从底物来推断得出未知的酶，继而推断基因的功能。而SIGEX法的不
同时，无法用于分析不能进入细胞
FACS对进样设备的要求也比较高；代谢特定底物的调控子和操
同时有些基因
的表达除了受底物诱导外，还可能受
而有些基因并不需要诱导，是本底水平表达的，有些可诱导基
但是考虑到宏基因组文库中含有大量的
其中必然有一部分是可诱导的，是可以被该技术检测到的。所以只要对这
SIGEX法仍然是一种宏基因组文库筛选
[26]。
基于稳定性同位素技术筛选方法
。环境中的许多物质都可以用SIP来标记，鉴
[27]。
荧光原位杂交技术
(fluorescent in situ hybridization, FISH)是利用荧光标
DNA分子或RNA分子杂交，通过在荧光显微
FISH技术已经用于不同生态系统的研究中，应用稳定同位素技术可以对环
进而构建宏基因组文库，更有利于寻找未
[28]。
其他筛选策略
PCR、分子杂交、抗原抗体反应等技术也可以用于筛选，也有公司开
蛋白等的试剂盒，在食品工业、医药等领域有较好的应
此外，在构建文库之前对样品有目的进行富集，然后提取样品DNA构建
模式微生物并不能把所
DNA表达出来，降低了表型筛选的效率。宏基因组表型筛选的效率
从上万个克隆中一般只能筛选到几个有用的克隆。这表明宏基因组学的提
但受限于技术瓶颈，还未在实际工作中产生理论
但有理由相信，随着分子生物学技术的发展，宏基因组