抗噬菌体菌株筛选

噬菌体的分离

取疑似噬菌体感染的生产菌株斜面或平板，用无菌蒸馏水将菌苔洗下，无菌过滤或离心，收集滤液或上清液。

在摇瓶培养基中接种1%生产菌株的孢子或细胞悬浮液，适温下培养24 h，加入1%的上述滤液或56离心上清液，继续培养24 h，无菌离心或过滤，收集上清液或滤液。

取上述上清液或滤液和生产菌株的孢子或细胞悬浮液各0.25ml，混匀后加在生产菌株的平板培养基上，用刮棒涂布均匀，适温下培养48~96h，确认是否生成噬菌斑。

噬菌体的纯化与增殖

将上述平板上长出的噬菌斑用接种针移入生产菌株培养12~24 h的摇瓶培养液中，继续培养24 h左右，无菌过滤或离心收集滤液或上清液。

取上述滤液或上清液和生产菌株的孢子或细胞悬浮液各0.25 ml，混匀后加在生产菌株的平57板培养基上，用刮棒涂布均匀，适温下培养48~96h，确认是否生成噬菌斑。

重复以上两个步骤，使噬菌体达到纯化和增殖的目的。最终所得滤液或上清液作为纯化噬菌体原液置冰箱保存。

噬菌体效价的测定

取6支灭菌并烘干的小试管，分别标注10-1、10-2、10-3、10-4、10-5和10-6，各加入0.9 ml无菌蒸馏水。

在10-1小试管中加入纯化噬菌体原液0.1ml，混匀后取出0.1ml移入10-2小试管中，如此类推，分别获得6个稀释度的噬菌体稀释液。

在5支灭菌并烘干且分别标注10-3、10-4、10-5、10-6和10-7的小试管中，分别加入0.1 ml上述10-2、10-3、10-4、10-5和10-6的噬菌体稀释液和0.9 ml生产菌株的孢子或细胞悬浮液，摇匀后再加入50℃的生产菌株琼脂培养基，迅速摇匀后分别倾入标注10-3、10-4、10-5、10-6和10-7的灭菌培养皿中，凝固后置适温下培养48~96 h，对所形成的噬菌斑计数。

抗噬菌体菌株选育步骤

噬菌体抗性的检测

将上述经过诱变和加热处理的生产菌株孢子或细胞悬浮液0.5 ml涂布到生产菌株的平板培养基上，表面干燥后加入0.1 ml保存的噬菌体原液，涂布均匀后置适温下培养48~72 h，观察噬菌斑的形成并计数(如无噬菌体原液，也可用噬菌斑制成悬浮液)。

将未经诱变但经加热处理的生产菌株孢子或细胞悬浮液按上述步骤操作，观察噬菌斑的形成并计数。

将未经诱变和加热处理的生产菌株孢子或细胞悬浮液按上述步骤操作，观察噬菌斑的形成并计数。

比较三者计数结果，确定噬菌体的加热死亡率和诱变后的抗性率。

盐酸羟胺的后续处理

盐酸羟胺有促进溶原性噬菌体释放的作用，因此可在以上育种步骤中增加盐酸羟胺后续处理一步。

将以上噬菌体抗性检测活性最高的抗性悬浮液分离到含盐酸羟胺0.5%~5%的生产菌株平板分离培养基上，在适温下培养48~96 h至生成单菌落。

将分离的单菌落制成细胞悬浮液，60~80℃下处理5~15min，在不含盐酸羟胺的生产菌株平板分离培养基上进行二次分离。

将二次分离得到的单菌落接种斜面，进行生产能力和抗性检测。

高产抗噬菌体菌株的的筛选

按常规方法对抗性菌株进行摇瓶发酵试验或其他方法生产能力检测，筛选高产菌株。

对所得高产菌株再进行噬菌体抗性检测，合格者保留，不合格者销毁。

筛选应优先选取显性(如形态、色素等)突变明显的菌落，这种菌落对噬菌体的抗性几率较高。

筛选所得高产抗性菌株，应制成冷冻真空干燥管进行保存，这种保存方法在保存过程中不会感染噬菌体。

标准菌株的鉴定及其特点

埃希菌属（Escherichia） 1、形态与染色：为革兰阴性短杆菌，多数有周鞭毛，能运动。有菌毛、荚膜及微荚膜。 2、培养特性：兼性厌氧菌，营养要求不高，在普通营养肉汤中呈浑浊生长。普通营养琼脂上呈灰白色的光滑型菌落。血琼脂平板上，少数菌株产生溶血环。麦康凯和SS琼脂中的胆盐对其有抑制作用，耐受菌株能生长并形成粉红色菌落。 3、生化反应：吲哚、甲基红、V-P、枸橼酸盐（柠檬酸盐）试验（IMViC试验）为++--（肠杆菌属多为--++）。克氏双糖铁琼脂（KIA）上斜面和底层均产酸产气，H2S阴性。动力、吲哚、尿素（MIU）培养基的生化反应为++-. 4、致病性大肠埃希菌有下列五个病原群。（1）肠产毒型大肠埃希菌（ETEC）：引起儿童腹泻和旅行者腹泻（水样泻）。（2）肠致病型大肠埃希菌（EPEC）：主要引起婴幼儿腹泻。（3）肠侵袭型大肠埃希菌（EIEC）：可侵入结肠黏膜上皮，引起志贺样腹泻（能产生粘液脓血便）。（4）肠出血型大肠埃希菌（EHEC）：又称产志贺样毒素（VT）大肠埃希菌（SLTEC或UTEC），其中O157：H7可引起出血性大肠炎和溶血性尿毒综合征（HUS）。严重者可发展为急性肾衰竭。（5）肠粘附（集聚）型大肠埃希菌（EAggEC）：与世界各地慢性腹泻有关。 5、CDC将大肠埃希氏菌O157：H7列为常规检测项目沙门菌属（salmonella）

1.形态与染色：为革兰阴性直杆菌，无芽胞，无荚膜。除鸡沙门菌外都有周身鞭毛，能运动，多数有菌毛。？ 2.培养特性：营养要求不高，在普通琼脂培养上即能生长，在液体培养基中呈均匀混浊。在SS琼脂和麦康凯琼脂培养基上35℃～37℃24h可形成直径约2～4mm的透明或半透明菌落，对胆盐耐受。产H2S者在SS琼脂上形成黑色中心。？ 3.生化反应：除亚利桑那菌外均不能发酵乳糖，大多数IMViC试验为-+-+，KIA：K／A、产气+／-、H2S+／-，MIU：动力+、吲哚-、尿素酶-。 4.致病因素有侵袭力、内毒素和肠毒素3种。临床上可引起胃肠炎、肠热症、菌血症或败血症等。其中肠热症属法定传染病。？（1）肠热症：即伤寒与副伤寒病。由伤寒与副伤寒沙门菌所引起的慢性发热症状。为法定传染病之一。？（2）食物中毒：引起食物中毒的沙门菌以鼠伤寒、肠炎、汤卜逊、猪霍乱、乙型及丙型副伤寒沙门菌为常见。？（3）慢性肠炎：沙门菌可引起老人和儿童的慢性肠炎。？（4）败血症：多由猪霍乱沙门菌引起。？（5）沙门菌的局部感染如颈部、腰部等。血清学诊断：肥达试验：用已知的伤寒沙门菌0、H抗原，甲乙丙副伤寒沙门菌H抗原稀释后与被检血清作定量凝集试验，以检测患者血清中抗体的含量，来判断机体是否受沙门菌感染而导致肠热症并判别沙门菌的种类。志贺菌属（shigella） 1.形态与染色：革兰染色阴性，杆菌，无鞭毛,有菌毛.？ 2.培养特性：在肠道鉴别培养基上形成无色,半透明的菌落.均能分解葡萄糖只产酸不产气,

菌种筛选方法 (2)

菌种筛选方法在实际工作中，为了提高筛选效率，往往将筛选工作分为初筛和复筛两步进行。初筛的目的是删去明确不符合要求的大部分菌株，把生产性状类似的菌株尽量保留下来，使优良菌种不致于漏网。因此，初筛工作以量为主，测定的精确性还在其次。初筛的手段应尽可能快速、简单。复筛的目的是确认符合生产要求的菌株，所以，复筛步骤以质为主，应精确测定每个菌株的生产指标,测得的数据要能够反映将来的生产水平。 1 从菌体形态变异分析有时，有些菌体的形态变异与产量的变异存在着一定的相关性，这就能很容易地将变异菌株筛选出来。尽管相当多的突变菌株并不存在这种相关性，但是在筛选工作中应尽可能捕捉、利用这些直接的形态特征性变化。当然，这种鉴别方法只能用于初筛。有人曾统计过3,484个产维生素B2的阿舒假囊酵母(Eremoth ecium ashbyii)的变异菌落，发现高产菌株的菌落形态有以下特点：菌落直径呈中等大小（8-10毫米），凡过大或过小者均为低产菌株；色泽深黄色，凡浅黄或白色者皆属低产菌株。又如，在灰黄霉素产生菌荨麻青霉(Penicillium urticae)的育种中，曾发现菌落的棕红色变深者往往产量有所提高，而在赤霉素生产菌藤仓赤霉（Gibberell a fujikuroi）中，却发现菌落的紫色加深者产量反而下降。 2 平皿快速检测法平皿快速检测法是利用菌体在特定固体培养基平板上的生理生化反应，将肉眼观察不到的产量性状转化成可见的

"形态"变化。具体的有纸片培养显色法、变色圈法、透明圈法、生长圈法和抑制圈法等，见图。这些方法较粗放，一般只能定性或半定量用，常只用于初筛，但它们可以大大提高筛选的效率。它的缺点是由于培养平皿上种种条件与摇瓶培养，尤其是发酵罐深层液体培养时的条件有很大的差别，有时会造成两者的结果不一致。图平皿快速检测法示意图平皿快速检测法操作时应将培养的菌体充分分散，形成单菌落，以避免多菌落混杂一起，引起"形态"大小测定的偏差。 1) 纸片培养显色法将饱浸含某种指示剂的固体培养基的滤纸片搁于培养皿中，用牛津杯架空，下放小团浸有3%甘油的脱脂棉以保湿，将待筛选的菌悬液稀释后接种到滤纸上，保温培养形成分散的单菌落，菌落周围将会产生对应的颜色变化。从指示剂变色圈与菌落直径之比可以了解菌株的相对产量性状。指示剂可以是酸碱指示剂也可以是能与特定产物反应产生颜色的化合物。 2) 变色圈法将指示剂直接掺入固体培养基中，进行待筛选菌悬液的单菌落培养，或喷洒在已培养成分散单菌落的固体培养基表面，在菌落周围形成变色圈。如在含淀粉的平皿中涂布一定浓度的产淀粉酶菌株的菌悬液，使其呈单菌落，然后喷上稀碘液，发生显色反应。变色圈越大，说明菌落产酶的能力越强。而从变色圈的颜色又可粗略判断水解产物的情况。 3) 透明圈法在固体培养基中渗入溶解性差、可被特定菌利用的营养成分，造成浑浊、不透明的培养基背景。将待筛选在菌落周围就

细菌营养缺陷型的诱变和筛选

微生物大实验细菌营养缺陷型菌株的诱变和筛选

细菌营养缺陷型菌株的诱变和筛选摘要用某些物理因素或是化学因素，使基因发生突变，丧失合成某一物质的能力，因而它们在基本培养基上不能生长，必须补充某些物质才能生长，这样从野生菌经诱变筛选到的菌株，称为营养缺陷型。紫外线可以诱导细菌发生突变，产生营养缺陷型菌株。筛选营养缺陷型菌株必须经过如下几个步骤：诱变处理、营养缺陷型的检出、划线复证、生长谱鉴定、缺陷型菌株纯化。又因处理的细菌所得到的突变菌仍然是很少的部分，因此必须采用有效的筛选方法，才能分离到突变型。关键词紫外诱变营养缺陷型营养缺陷型的检出划线复证生长谱鉴定引言营养缺陷型：需要在基本培养基中补加某种营养成分（如氨基酸、维生素、核苷酸等）才能生长的微生物突变体，通过基因突变产生。微生物细胞本身能吸收周围环境中的简单营养物，经过自身代谢合成生长所需的各类营养物质。如果发生基因突变，则细胞失去合成与这些基因有关营养物质的能力，只有在培养基中补加这类营养物质后，突变细胞才能生长，故又名营养缺陷型突变体。此类突变体在理论研究和生产实践中都有重要意义，是研究代谢途径和遗传规律必不可少的标记菌种，亦可直接用于生产氨基酸、核苷酸等代谢产物。为了获得营养缺陷型菌株，需从诱变处理后的菌液中认真筛选，以便检出突变体，常用的方法有：影印接种法、夹层培养法和青霉素浓缩法等。影印接种法：将待测的浓缩菌悬液涂在完全培养基平板上，待其长好后作为母平板。用一小块灭菌的丝绒固定在直径较平板略小的圆柱形木块上，作为接种工具。用它在母平板上轻轻印一下，再在基本培养基平板上印一下，经培养后，影印平板上长出的菌落与母平板上的菌落位置对应，比较二个平板上菌落的生长状况，即可从相应位置的母平板上选出待测的营养缺陷型菌株。夹层培养法：先在培养皿中倒一层不含菌的基本培养基，待冷凝后，加一层含菌的基本培养基，冷凝后，再加一层不含菌的基本培养基，经培养出现菌落后，在培养皿底的相应位置做上标记，然后再加一层完全培养基。再经培养后出现的菌落，多数是只能在完全培养基上生长的营养缺陷型。青霉素浓缩法：利用青霉素特异性的杀死野生型细胞，保留营养缺陷型细胞的方法。青霉素能抑制细菌细胞壁的合成，所以只能杀死生长繁殖中的细菌，而不能杀死停止繁殖的细菌。在基本培养基中添加青霉素，野生型细菌能够生长繁殖，会被杀死，而营养缺陷型不被

大肠杆菌营养缺陷型菌株的诱变与筛选山大微生物大实验

山东大学实验名称：大肠杆菌营养缺陷型菌株的诱变和筛选作者：姚健(201000140136) 同组者：刘新强指导老师：林建群(教授) 实验日期：2013年5月22日-6月1日

微生物大实验报告大肠杆菌营养缺陷型菌株的诱变和筛选山东大学生命基地班姚健 201000140136 摘要：营养缺陷型菌株或称异养型（auxotroph）菌株是许多微生物生理生化以及遗传研究的重要菌株材料。此类菌株不仅在生物研究方面有着很重要的作用，而且在生物工程和生物技术上都有很重要的作用。营养缺陷型菌株的筛选也成为了微生物科学工作者必备的基本实验技能之一。实验采用物理诱变非电离辐射紫外线（15W）为诱变剂，来对大肠杆菌诱发突变，并用抗青霉素法淘汰野生型（富集营养缺陷型），采用点植对照法检出营养缺陷型，划线复证后得到两株营养缺陷型菌，进行生长谱法鉴定，两个平板都长满了菌落，即没有预期的营养缺陷型菌株出现。 Abstract:Auxotrophic bacterias are very important materials in the microbial biochemical and genetical research.Auxotrophic bacterias are important to not only bioresearch but also biotechnology.The screening of auxotrophic bacterias has become one of scientists’ primary experimental skills.We use the ultravioley light as the mutagen to induce the mutation of the E.coli,then weed out the wild type by Penicillin resistance method to gather auxotrophic bacterias,next we check out the auxotrophic bacterias by spot planting.We get two auxotrophic bacterias by marking out，finally we test the type of auxotroph by auxanography.Each bacteria grew well everywhere in the plate indicating that t here’s no auxotrophic bacteria. 关键词：大肠杆菌；营养缺陷型菌株；紫外线诱变；划线复证；生长谱测定；筛选 Key words:Escherichia;auxotrophic bacteria；ultravioley mutation;marking out;auxanography;screening 1引言筛选营养缺陷型菌株一般具有四个环节：诱变处理、营养缺陷性的浓缩、检出、鉴定缺陷型。本实验选用紫外线为诱变剂来诱发突变，并用青霉素法淘汰野生型，逐个测定法检出缺陷型，最后经生长谱法鉴定细菌的营养缺陷型。 1.1 营养缺陷型营养缺陷型是指野生型菌株由于某些物理因素或化学因素处理，使编码合成代谢途径中某些酶的基因突变，丧失了合成某些代谢产物(如氨基酸、维生素)的能力，必须在基本培养基中补充该种营养成分，才能正常生长的一类突变株[1]。这类菌株可以通过降低或消除末端产物浓度，在代谢控制中解除反馈抑制或阻遏，而使代谢途径中间产物或分支合成途径中末端产物积累。在氨基酸、核苷酸生产中已广泛使用营养缺陷型菌株；也可用于遗传学分析、微生物代谢途径的研究及细胞和分子水平基因重组研究中作为供体和受体细胞的遗传标记。因此，营养缺陷型在工业上有重要的应用价值。营养缺陷型是由野生型突变产生，营养缺陷型经回复突变恢复野生表型得到原养型。为了获得营养缺陷型菌株，需从诱变处理后的菌液中认真筛选，以便检出突变体，常用的方法有：影印接种法、夹层培养法和青霉素浓缩法等。 1.2 紫外线诱变诱变育种是人为地采用物理、化学的因素，诱导有机体产生遗传变异，并经过人工选择、鉴定、培育新品种的方法。诱变育种的目标是改变或增加一个满意品种的某一特性，而在其他方面保持不变。诱变育种具有以下特点：1）提高突变率，扩大变异谱；2）适于进行个别性状的改良；3）育种程序简单，年限短；4）变异的方向和性质不定。紫外线是一种短波光，波长介于100-400nm之间。它是一种非电离辐射诱变剂，照射物体时可使原

营养缺陷型菌株的筛选和鉴定

营养缺陷型菌株的筛选和鉴定 mutugenesis and isolation of auxotroph 细菌革兰氏染色法 gram stain 酵母菌的形态结构观察 yeast morphology 培养基的配制和灭菌 types of mddia and sterlization 菌种保藏 preservation of cultures 细胞计数法 conting of cell 凝集反应 agglutination reactions 相差显微镜 phase contrast microscope 细胞融合 cell fusion 质粒DNA的提取 isolation of plasmid DNA 植物DNA的提取 isolation of plant DNA 多肽的末端分析 analysis of terminal of polypeptide PCR扩增DNA PCR amplify DNA fragment SDS-聚丙烯凝胶电泳 SDS-polyacrylamide gel electrophoresis 蛋白质的性质 properties of protein 植物组织培养 plant tissue culture BL-410生物机能实验系统简介 the introduction of BL-410 biofunctional experiment system 青蛙坐骨神经-腓肠肌标本的制备 preparation methods for nerve-muscle specimen of frog 人ABO血型的鉴定 Identification of humankind ABO blood group

营养缺陷型菌株的筛选

营养缺陷型菌株的筛选采用辐射，化学试剂等因素处理细菌，以提高其变异几率，关键步骤是进行营养缺陷型微生物的筛选工作，营养缺陷型是指通过诱变产生的，由于发生了丧失某酶合成能力的突变，因而只能在加有该酶合成产物的培养基中才能生长的突变株。营养缺陷型的筛选与鉴定涉及下列几种培养基：基本培养基（MM，符号为[-]）是指仅能满足某微生物的野生型菌株生长所需的最低成分的合成培养基。完全培养基(CM，符号为[+])是指可满足某种微生物的一切营养缺陷型菌株的营养需要的天然或半合成培养基。补充培养基（SM，符号为[A]或[B]等）是指在基本培养基中添加某种营养物质以满足该营养物质缺陷型菌株生长需求的合成或半合成培养基。营养缺陷型菌株不仅在生产中可直接作发酵生产核苷酸、氨基酸等中间产物的生产菌，而且在科学实验中也是研究代谢途径的好材料和研究杂交、转化、转导、原生质融合等遗传规律必不可少的遗传标记菌种。营养缺陷型的筛选一般要经过诱变、淘汰野生型、检出和鉴定营养缺陷型四个环节。现分述如下：第一步，诱变剂处理：与上述一般诱变处理相同。

第二步，淘汰野生型：在诱变后的存活个体中，营养缺陷型的比例一般较低。通过以下的抗生素法或菌丝过滤法就可淘汰为数众多的野生型菌株即浓缩了营养缺陷型。抗生素法有青霉素法和制霉菌素法等数种。青霉素法适用于细菌，青霉素能抑制细菌细胞壁的生物合成，杀死正在繁殖的野生型细菌，但无法杀死正处于休止状态的营养缺陷型细菌。制霉菌素法则适合于真菌，制霉菌素可与真菌细胞膜上的甾醇作用，从而引起膜的损伤，也是只能杀死生长繁殖着的酵母菌或霉菌。在基本培养基中加入抗生素，野生型生长被杀死，营养缺陷型不能在基本培养基中生长而被保留下来。菌丝过滤法适用于进行丝状生长的真菌和放线菌。其原理是：在基本培养基中，野生型菌株的孢子能发芽成菌丝，而营养缺陷型的孢子则不能。通过过滤就可除去大部分野生型，保留下营养缺陷型。第三步，检出缺陷型：具体方法很多。用一个培养皿即可检出的，有夹层培养法和限量补充培养法；在不同培养皿上分别进行对照和检出的，有逐个检出法和影印接种法。可根据实验要求和实验室具体条件加以选用。现分别介绍如下：

大肠杆菌诱变处理与营养缺陷型筛选

大肠杆菌诱变处理与营养缺陷型筛选【实验目的】 1.了解应用物理、化学因素对细菌进行诱变的方法。 2.初步掌握诱变产生营养缺陷型菌株的筛选与鉴定的技术。【实验原理】在以微生物为材料的遗传学研究中，用某些物理因素或化学因素处理细菌，可诱发基因突变。如果突变后丧失合成某一物质(如氨基酸、维生素、核苷酸等)的能力，不能在基本培养基上生长，必须补充某些物质才能生长，称为营养缺陷型。实验室获得营养缺陷型菌株通过经过以下几个步骤：诱变处理、突变型筛选、缺陷型检出，缺陷型鉴定。诱变处理首先要选择诱变剂，诱变剂可分为物理和化学两类。微生物诱变中最常用的物理诱变剂是紫外线。进行诱变处理时为了避免出现不纯的菌落，一般要求微生物呈单核的单细胞或单孢子的悬浮液，分布均匀。试验表明处于对数生长期的细菌对诱变剂的反应最灵敏。诱变处理必须选择合适的剂量，不同微生物的最适处理剂量不同，须经预备实验确定。物理诱变的相对剂量与三个因素有关：诱变源和处理微生物的距离、诱变源(紫外灯)功率、处理时间，往往通过处理时间控制诱变剂量。化学诱变剂的剂量也常以相对剂量表示。相对剂量与三个因素有关：诱变剂浓度、处理温度和处理时间。一般通过处理时间来控制剂量，在处理前对诱变剂和菌液分别预热，当二者混合后即可计算处理时间，可精确控制处理剂量。经处理以后的细菌，缺陷型所占的比例还是相当小，必须设法淘汰野生型细胞，提高营

养缺陷型细胞所占比例，浓缩缺陷型细胞。浓缩缺陷型的方法有青霉素法、菌丝过滤法、差别杀菌法、饥饿法等，这些方法适用于不同的微生物。细菌中常用的浓缩法是青霉素法，青霉素是杀菌剂，只杀死生长细胞，对不生长的细胞没有致死作用。所以在含有青霉素的基本培养基中野生型能长而被杀死，缺陷型不能生长，可被保存得以浓缩。检出缺陷型的方法有逐个测定法、夹层培养法、限量补给法、影印培养法。这里主要以逐个测定法为例进行说明：把经过浓缩的缺陷型菌液接种在完全培养基上，待长出菌落后将每一菌落分别接种在基本培养基和完全培养基上。凡是在基本培养基上不能生长而在完全培养基上能长的菌落就是营养缺陷型。经初步确定为营养缺陷型的菌株用生长谱法鉴定。在同一培养皿上测定一个缺陷型对多种化合物的需要情况。【器材与试剂】一、器材离心机，紫外线照射箱，冰箱，恒温箱，高压灭菌锅；三角烧瓶，试管，离心管，移液管，培养皿，接种针等。二、试剂肉汤液体培养基，ZE肉汤液体培养基，基本固体培养基，基本液体培养基，无N基本液体培养，2N基本液体培养基(成分及配制方法见后)。 20种基本氨基酸，7种微生素(硫胺素，核黄素，吡哆醇，泛酸，对氨基苯甲酸，烟碱酸，生物素)，嘌呤，嘧啶；亚硝酸钠，青霉素钠盐，冰乙酸，乙酸钠，氢氧化钠，硫酸镁，蔗糖；生理盐水，0.1mol/L醋酸缓冲液(pH=4.0)，0.1mol/L NaOH。

标准菌种管理规程

标准菌种管理规程目的：规范药品微生物学检定用菌的管理，最大限度降低变异率，确保菌种的溯源性与稳定性，从而确保微生物学检验结果的准确可靠。职责： QC 主管负责菌种的申购、接受、保存、分发，微生物检验员负责菌种的确认、传代、使用及销毁。范围：本规程适用于检定用菌种的管理，包括菌种的申购、保存、传代、使用及销毁等。内容： 1术语标准菌种是指由中国药品生物制品检定所医学微生物菌种保藏管理中心提供的冷冻干燥菌。传代用菌种是指用标准菌种制备的采用特定保存方法长期固定保存的菌种，用于传代及制备工作用菌种。工作用菌种是指用标准菌种或传代用菌种接种至普通琼脂斜面培养后，作为日常工作使用的菌种。菌种的代是指将其接种至一新鲜培养基上或培养基内，每萌发一次即称为一代，从菌种保藏中心获得的冷冻干燥菌种为第0 代。 2.标准： 2.1 检定菌的申购 QC主管每年根据检定菌种的使用情况（包括临时检验需要），提出购买计划，交由质量管理部部长审批后，向中检所菌种保藏中心或省（市）药检所购买冻干菌种（标准菌种）；也可以直接向省（市）药检所购

买传代用菌种，购买时，需询问与确定菌种的代数，以便传代时控制代数。 2.2 检定菌的接收菌种到达实验室后，由QC主管接收菌种，检查其名称和数量，以及每一支的完整性，同时将菌种的所有信息，填写在《检定菌接收记录》（附表 1）上，内容包括：名称、数量、编号（无编号者按检定菌种的编号原则编号）、代数、来源、接收日期、接收人等，贴好标签并储存于 2-8?C直到需要使用时。储存期最长不超过 5 年。 2.3 检定菌的保存 2.3.1 工作用菌种的保存工作用菌种采用斜面低温保存法。将菌种接种在适宜的固体斜面培养基上，待菌生长充分以后，转移至2～8℃冰箱中保存。此法仅用于工作用菌种的短期保存，并应随时检查其污染杂菌和变异等情况，发现异常情况，经应灭活处理后销毁。保存时间根据菌种种类而不同，细菌： 1 个月；酵母菌： 2 个月；霉菌及芽胞： 3 个月。 2.3.2 传代用菌种的保存采用甘油冷冻管保藏法或液体石蜡保存法。 2.3.2.1．甘油冷冻管保存法用无菌接种环轻轻刮取经冷冻复溶增菌后并接种至平板或琼脂斜面的菌苔，并通过接种环与试管壁之间的轻轻摩擦而使细菌充分扩散到预先装入试管中的无菌纯化水中，调整菌液浓度，使其等同于10 号比浊管，向已制备好的菌悬液中加入等体积的无菌甘油（浓度 20%），

标准菌株

概述：标准菌株是细菌室室内质控工作必不可少的、重要的生物资源，我室的标准菌株主要来自省临检中心的发放和从卫生部临检中心以及国家菌种保存中心购买所得，为了让标准菌株能够得到合理的应用，特制定以下规定。 1.对每批购买的标准菌株要做好登记，包括菌种的菌名、编号、购买时间、保存地点、记录人等 2.每次使用标准品都应作好使用记录，包括标准品的名称、编号、使用时间等。 3.购买的标准品初次使用时，应大量增殖，然后分装在含10-15%甘油的胰蛋白胨肉汤中，-20℃以下保存。 4.新的标准菌株复苏最多不得超过三次，如超过三次将不在视为标准菌株使用。 5.标准菌株保存管一经溶化使用后，不得再次冻存。本篇文章来源于检验在线https://www.360docs.net/doc/7b6938375.html,/ 原文链接：https://www.360docs.net/doc/7b6938375.html,/paper/manual/1OMDAwMDAwMDc1OQ.html 目的: 建立检定菌的管理制度。范围: 检验用菌种的管理。责任者: 化验员、中心化验室主任。程序： 1、菌种接收（1）检定菌由专人保管，此人须受过专业培训，有足够的菌种保存经验。（2）根据检验品种的需要，由检定菌保管员制定购买计划，报中心化验室主任审核、质量部负责人批准。（3）检定菌保管员在接收标准菌种时，须填写接收记录，并在保存菌种容器外加贴标签（内容为名称、编号、接收日期），妥善保管。 2、菌种的移植传代（1）长久保存的菌种在启用时，要经移种至适宜的培养基上进行培养，待生长后再行移种，如此连续2—3次，甚至多次，直至出现典型的形态和生化特征为止。（2）保存的菌种须按规定时间进行传代。（3）在检查或保存菌种过程中，遇有形态构造上有变异或污染菌等情况，需进行菌种移植分离培养以得到纯菌。（4）移植传代时须核对编号、传代次数、传代日期、所用培养基等并记录。每次移植传代后，要与原种的编号、名称核对，检查培养特征无误时方可再继续保存。（5）传代次数必须控制，传代次数越多，突变的机率越大。因此要尽量少传代，必须根据菌种保存情况规定最多传代次数。第2页共2页 3、菌种原种须按标签或所附说明书妥善保存，并上锁，以保证安全，防止意外。移植传代后的菌种于普通冰箱内2—8℃保存，每周检查一次冰箱温度、湿度，菌种管的棉塞是否松动生霉，有无异常，并逐次记录。 4、菌种的使用和销毁（1）每次使用的菌种必须是培养后健康、生命力强、无变异的菌种。每次使用菌种均须作记录。（2）超过传代限度或经鉴定检查不合格的菌种，报中心化验室主任、质量部负责人审核批准后销毁灭活（加

菌种筛选方法

常用的菌种的筛选方法如下：（1）施加选择性压力分离法主要是利用不同种类的微生物其生长繁殖对环境和营养的要求不同，如温度、pH、渗透压、氧气、碳源、氮源等，人为控制这些条件，使之利于某类或某种微生物生长，而不利于其他种类微生物的生存，以达到使目的菌种占优势。而得以快速分离纯化的目的。如可以控制培养时的氧，可将好氧微生物和厌氧微生物分开；通过控制温度，可将嗜热微生物和非嗜热微生物分开；控制pH，可将嗜酸、嗜碱微生物分离等。在分离培养基中也可以加入不同的抗生素或试剂来增加选择性。如在分离放线菌和细菌时，可加入抗真菌抗生素；分离真菌时，可加入抗细菌药物。（2）随机分离方法有些微生物的产物对筛选没有直接的选择性指示作用，因此常采用随机分离方法分离。 A、抗生素产生菌的分离抗生素产生菌的分离常用抑菌圈法。实验必须用工具菌：采用抗生素的敏感菌，传统上常用金黄色葡萄球菌和枯草杆菌。 B、抗肿瘤药物产生菌的分离抗肿瘤药物产生菌的分离常用方法：生化诱导法、SOS生色检测法、DNA修复能力突变株。原理是利用DNA的损伤，微生物发生突变。B1、生化诱导法：将大肠杆菌的lacZ基因连接在λ噬菌体的PL启动子下，当DNA损伤时，诱发λ阻遏物CI分解，PL启动子启动lacZ基因转录，测定表达的?-半乳糖苷酶活性，来检测药物的存在。B2、SOS生色检测法：利用当DNA损伤时，可活化yecA蛋白，进而分解噬菌体的阻遏蛋白，再引起sifA基因启动lacZ基因转录，测定表达的?-半乳糖苷酶活性，来检测药物的存在。 C、生长因子产生菌的分离以氨基酸产生菌为例，介绍筛选方法。首先将待试菌接入加了抗真菌的化合物（如亚胺环己酮）的分离培养基中生长，然后采用影印法，将菌落复印到能支持氨基酸产生菌生长的培养基中，培养2-3天后，用紫外线杀司长好的菌落，再往此平板上面铺一层相应营养缺陷型菌株菌悬液，培养16小时后，被杀死的氨基酸产生菌的菌落周围应有一检测菌的生长圈。（3）目的微生物分离 A、根据形态筛选突变株 B、根据平板菌落生化反应筛选变株透明圈法、呈色圈法、抑菌圈法、浑浊圈法等。①透明圈法：在平板培养基中加入溶解性较差的底物，使培养基混浊。能分解底物的微生物便会在菌落周围产生透明圈，圈的大小初步反应该菌株利用底物的能力。该法在分离水解酶产生菌时采用较多，如脂肪酶、淀粉酶、蛋白酶、核酸酶产生菌都会在含有底物的选择性培养基平板上形成肉眼可见的透明圈。在分离某种产生有机酸的菌株时，也通常采用透明圈法进行初筛。在选择性培养

标准菌株质量控制作业指导书

标准菌株质量控制作业指导书 1、目的：对微生物标准菌株的验收、复活、确认、转代、储存、使用、废弃等进行规定，确保标准菌株符合要求，保证检测结果。 2、职责： 2.1、检测中心主任负责标准菌株资源的配备。 2.2、微生物检测室工作人员负责标准菌株的有效储存和正确的使用。 3、要求： 3.1供应商的选择：选择有资质的标准菌株的合格供应商，每批标准菌株必须有附件的供应商的合格证或检测报告，来证明所采购的标准菌株是合格的。 3.2标准菌株和验收菌株一到实验室，一定要记录好菌株号和标准菌株来源，确保溯源性清楚。同时，还应尽可能多的菌株信息，如：标准菌株名称和数量、生产日期、接收日期和有无破损等。 3.3冻干标准菌株的复活： 3.3.1、开启产品包装：先用70%酒精棉擦拭外包装，从凹口处撕开产品外包装，撕掉标签上的拉片，将其贴于菌株保藏管上。 3.3.2、复活：选择合适的培养基和培养条件（根据生产商说明）进行复活。冻干菌株的传代次数不得超过5代，从标准菌株保藏中心购买的冻干标准菌株为第F0代。捏管帽处安瓿瓶（仅一次）使其释放水合液体。垂直握住安瓿瓶并轻拍之，使液体流入含小球的管底。通过挤捏压碎小球使其与液体混合，立即将拭子浸于水合液体。挤压并旋转拭子，接种于初级培养平板，接种圈的直径约为25mm，用一无菌接种环在先前接种区域划线10-20次，促使分离出单菌落。同时吸出部分菌液接种胰蛋白胨大豆肉汤管，副溶血性弧菌接种3%氯化钠胰蛋白胨大豆肉汤管。将接种好的平板和管立即进行培养。细菌培养温度通常为25℃或37℃。多数冻干菌株会在几天后长出，但是少数菌会表现出延滞期延长的现象，需要将正常培养时间加倍。复活后的菌株为F1代。 3.3.3将TSB生长的浓菌液吸0.5mL于菌株保藏管充分混匀后将液体吸出，将保藏管-18℃保存1-3年为标准储备菌株F2代。将平板上生长的良好菌株接种

葡萄球菌属的常规鉴定标准操作程序

葡萄球菌属的常规鉴定标准操作程序 1 概述葡萄球菌属是一类触媒试验阳性的革兰阳性球菌，包括金黄色葡萄球菌，表面葡萄球菌、腐生葡萄球菌等32个种。是临床最常见的化脓性球菌，广泛分布于自然界中，在人体表面鼻、咽、肠道也经常存在。 2 形态与染色革兰阳性球菌，直径0.4~1.2μm成单、双、短链或不规则状排列。在液体培养基浓汁标本中，往往排列成双或短链状多数有鞭毛。 3 培养特性金黄色葡萄球菌在血琼脂平板上典型菌落为金黄色，周围有明显的透明（β）溶血环，部分菌落呈橙色，在高盐甘露醇平板上呈橙色菌落。表皮葡萄球菌等其他葡萄球菌在血琼脂平板上菌落为白色或柠檬色，不溶血。 4 生化反应触酶试验阳性，多数能分解葡萄糖、麦蚜糖、蔗糖和甘露醇。不分解棉籽糖和水杨苷，液化明胶，血浆凝固酶和DNA酶实验分阳性。 5 鉴别要点 5.1 本菌属特征：触酶实验阳性，革兰阳性球菌，葡萄状排列，菌落中等大小，中等干燥。 5.2 与微球菌属的鉴别：触酶实验都为阳性，但O∕F试验葡萄球菌属为发酵型，而微球菌为氧化型或无反应，而且菌体较葡萄菌属更大，排列呈四联状为主。5.3 与链球菌属的鉴别：葡萄球菌属触酶试验都为阳性，而链球菌为阴性，O∕F试验葡萄球菌属为发酵型而链球菌为氧化型。 5.4 凝固酶阳性葡萄球菌的鉴别见下表。结合型凝游离型凝鸟氨酸脱菌名PYP试验DNA试验VP试验固酶试验固酶试验羧酶实验

金黄色葡萄球菌+ + - + + - 中间型葡萄球菌- + + + - - 施氏葡萄球菌+ - + + + - 路邓葡萄球菌+ - + - + + 注：“+”为90%以上菌株为阳性，“--”为90%以上菌株为阳性。 5.5 凝固酶阳性葡萄球菌的鉴别见下表 + 腐生葡萄球菌——+ V + + — 溶血葡萄球菌+ ——V + — — 人型葡萄球菌——+ —+ — — 华纳葡萄球菌——+ V + —— 模仿葡萄球菌+ —+ + + —— 头状葡萄球菌——V + + ——

大肠杆菌营养缺陷型菌株的诱变和筛选鉴定

大肠杆菌营养缺陷型菌株的诱变和筛选鉴定关于菌株的几个概念：野生型菌株：从自然界分离到的微生物在其发生突变前的原始状态。营养缺陷型：野生型菌株经过人工诱变或自然突变失去合成某种营养的能力，只有在基本培养基中补充所缺乏的营养因子才能生长。原养型：营养缺陷型菌株经回复突变或重组后产生的菌株，其营养要求在表型上和野生型相同关于培养基：基本培养基（minimal medium，MM）：仅能满足微生物野生型菌株生长需要的培养基，用[－]来表示。完全培养基（complete medium，CM）：凡可满足一切营养缺陷型菌株营养需要的天然或半组合培养基。用[＋]来表示。补充培养基（supplemental medium，SM）：凡只能满足相应的营养缺陷型生长需要的组全培养基，它是在基本培养基中加入该菌株不能合成的营养因子而组成。摘要：本实验选用紫外线为诱变剂，来诱发大肠杆菌突变，并用青霉素法淘汰野生型，逐个测定法检出缺陷型，获得100#大肠杆菌菌株，最后经生长谱法鉴定出该菌株为xxx缺陷型。关键词：大肠杆菌紫外线营养缺陷型青霉素逐个测定法生长谱法一、目的

1、了解营养缺陷型突变株选育的原理。 2、学习并掌握细菌氨基酸营养缺陷型的诱变、筛选与鉴定方法。二、原理筛选营养缺陷型菌株一般具有四个环节：诱变处理、营养缺陷性的浓缩、检出、鉴定缺陷型。本实验选用紫外线为诱变剂，来诱发突变，并用青霉素法淘汰野生型，逐个测定法检出缺陷型，最后经生长谱法鉴定细菌的营养缺陷型。三、器材离心机，紫外线照射箱，冰箱，恒温箱，高压灭菌锅；三角烧瓶，试管，离心管，移液管，培养皿，接种针四、材料 (一)菌种E.coli (二)培养基、 1LB培养液(Luria-Bertani 培养基,这个名字来源于英语的lysogeny broth，即溶菌肉汤。是微生物学实验中最常用的培养基，用于培养大肠杆菌等细菌，分为液态培养基和加入琼脂制成的固态培养基。加入抗生素的LB 培养基可用于筛选以大肠杆菌为宿主的克隆。)：酵母膏，0.5g；蛋白胨，1g；NaCl，0.5g；水，100ml，pH7.2 121℃灭菌15min 22×LB培养液：其它不变，水，50ml。 3基本培养基：葡萄糖0.5 g，(NH4)2SO4 0.1 g，柠檬酸钠0.1 g，

芽孢杆菌营养缺陷型的筛选检出与鉴定

实验二、芽孢杆菌氨基酸营养缺陷型菌株的筛选、检出与鉴定一、实验目的掌握各种培养基的配制方法；理解选育营养缺陷突变株的选育原理；掌握细菌氨基酸营养缺陷型的诱变、筛选与鉴定方法；获得芽孢杆菌氨基酸营养缺陷型菌株并对其鉴定。二、实验原理营养缺陷型是指野生型菌株由于基因突变，致使细胞合成途径出现某些缺陷，丧失合成某些物质的能力，必须在基本培养基中外源补加该营养物质,才能正常生长的一类突变菌株。其本质是一种减低或消除末端产物浓度，以解除反馈控制的代谢调控中间产物或分支合成途径中末端产物得以积累。营养缺陷型菌株广泛应用于氨基酸、核苷酸、维生素的生产中。也广泛应用于基因定位、杂交及基因重组等研究中的遗传标记制作。筛选营养缺陷型菌株一般具有四个环节：诱变处理、淘汰野生型、营养缺陷型的检出、鉴定缺陷型[1]。 1.诱变处理基因突变可分为自发突变和诱发突变，许多物理、化学、生物因素对微生物都有诱变作用，这些能使突变率提高到自发突变水平以上的因素称为诱变剂，对于氨基酸营养缺陷型的诱变常选用亚硝基胍。亚硝基胍(NTG，N-甲基-N-硝基-亚硝基胍)为诱变剂，在低致死率的情况下又很强的诱变作用，有超诱变剂之称。在碱性时NTG 能形成重氮甲烷(CH2N)、烷化DNA 而使基因突变：pH5-5.5 时，NTG 形成HNO2，本身也是诱变剂；pH 6.0 时，NTG 本身不变化，可作用于核蛋白而引起诱变效应。它的主要作用是引起DNA链中GA向AT转变。NTG 是—种超诱变剂，杀菌力较弱，诱变作用较强，其作用部位又往往在 DNA的复制叉处，易造成双突变。一般选用NTG 处理时，诱变频率较高，可使百分之几十的细菌发生营养缺陷型突变。NTG也是一种致癌因子，在操作时要特别注意，切勿直接与皮肤接触，凡有亚硝基胍的器皿都的要用1mol/LNaOH溶液浸泡，使残存的亚硝基胍分解破坏，然后清洗[2]。 2.淘汰野生型诱变处理后的个体，营养缺陷型的比例较低，可采用菌丝过滤法、抗生素法、高温杀菌法除去野生菌，从而达到浓缩营养缺陷型菌株的目的。菌丝过滤法：该方法只适用于真菌，在基本培养基中野生型孢子可以发育成菌丝体，而突变型的不可以，这样经诱变后的孢子在基本培养基中培养一段时间后过滤，重复几次后就可达到浓缩突变型菌体的作用。抗生素法：是利用野生型菌株能在基本培养基中生长，而缺陷型不能生长，将诱变处理液在基本培养基中培养让野生型生长一周，而缺陷型无法生长，加入一定量的抗生素，使活化的野生型杀死，保存了缺陷型。在选择抗生素时，细菌可以用青霉素，酵母可用制霉菌素。高温杀菌法：本实验利用芽孢杆菌类的芽孢和营养体对热敏感性的差异，诱变后的细菌形成芽孢后把处在芽孢阶段的细菌移到基本培养液中，振荡培养一定时间，野生型芽孢萌发，而营养缺陷型芽孢不能萌发。此时将培养物加热到80℃，维持一定时间，野生型细胞大部分被杀死，缺陷型则得以保留。 3.营养缺陷型的检出营养缺陷性的检出方法包括影印法、夹层法、限量补充法、逐个检出法。影印法：先将一较平皿直径小1cm的金属圆筒蒙上一层灭菌的丝绒，用金属夹夹住，灭菌。在完全培养基上长出的全部菌落在丝绒上轻轻一压，使之成为印模，标记方位。将基本培养

标准储备菌株纯度确认标准操作规程

1.目的：建立标准菌种确认标准操作规程，以减少菌种污染和生长特性的改变，保证实验结果的可靠性和准确性。 2.范围：微生物限度实验室所用标准储备菌株。。 3.职责：QC主管生测员对本规程的实施负责。 4.依据：中国药典2015年版四部通则。 5.内容： 5.1.实验菌株 5.1.1 标准菌株 5.1.1.1 标准菌株应来自认可的国内或国外菌种收藏机构。 5.1.1.2 标准菌株经过复活并在适宜的培养基中生长后，即为标准储备菌株。 5.1.1.3 标准储备菌株应进行纯度和特性确认。 5.1.2 工作菌株 5.1.2.1 标准储备菌株可用于定期转种（每3个月）或制备工作菌株。 5.1.2.2 工作菌株的传代次数应严格控制，不得超过5代（从菌种收藏机构获得的标准菌株为第0代），以防止过度的传代增加表型变化的风险。因此必要时，应对工作菌株的纯度和特性进行确认。 5.2 菌种确认试验的主要内容 5.2.1 菌种的纯度确认 5.2.1.1 纯度检测：是指通过适当的方法检测菌种是否为纯培养物。 5.2.1.2 实验内容

⑴菌落形态：在特定的培养基上，将待检测培养物稀释涂布或平板划线，适宜培养后，用一平板上的单菌落的大小、形状、颜色、质地、光泽等是否相似；对于两种或以上形态的出发菌株，应再分别挑取单菌落划线或稀释涂布培养，检测是否重复出现相同特征。 ⑵镜检特征：对数生长期的培养物革兰氏染色反应应呈现一致性；细胞形状、大小、荚膜、芽孢等特征应相似。 5.2.2 菌种的特性确认 5.2.2.1 生化试验各种微生物具有各自的独特的酶系统，因而在代谢过程中所参与的物质分解和合成代谢的产物也不同，这些代谢产物又具有不同的生化特征。根据此特征，利用生物化学方法来鉴定不同的微生物的试验即为微生物的生化试验。 5.3 菌种的确定方法用无菌的接种环粘取培养物，在相应的培养基平板上划线分离单个菌落，并在适宜条件下培养。培养后观察是否具有典型的菌落形态，然后挑取单一纯菌落，进行革兰染色、镜检，观察其染色特性及菌形。再做生化试验或使用菌种鉴定系统进一步鉴定菌种。 5.3.1 大肠埃希菌的确认 5.3.1.1 菌落形态 ⑴取大肠埃希菌新鲜培养物至胰酪大豆胨液体培养基中，经35℃培养18～24小时后，形成菌膜，管底有粘液状沉淀，培养物有粪臭味。 ⑵取上述培养物接种于麦康凯琼脂平板上，35℃培养18～24小时后，观察结果。 ⑶麦康凯琼脂平板上菌落形态呈鲜桃红色或微红色，菌落中心呈深桃红色，圆形，扁平，边缘整齐，表面光滑，湿润。

细菌营养缺陷型菌株的诱变和筛选鉴定

细菌营养缺陷型菌株的诱变和筛选鉴定作者：徐艳芹作者单位：山东理工大学生命科学院地址：山东淄博255049 摘要：营养缺陷型是指野生型菌株由于某些物理因素或化学因素处理，是编码代谢途径中某些酶的基因突变，丧失了合成某些代谢产物（如氨基酸、维生素）的能力，必须在基本培养基中补充该种营养成分，才能正常生长的一类突变株。这类菌株可以通过降低或消除末端产物浓度，在代谢控制中解除反馈抑制或阻遏，而使代谢途径中间产物或分支合成途径中末端产物积累。在氨基酸、核苷酸生产中已广泛使用营养缺陷型菌株；也可用于遗传学分析、微生物代谢途径的研究及细胞和分子水平基因重组研究中作为供体和受体细胞的遗传标记。本实验选用紫外线为诱变剂，以大肠杆菌为实验材料来诱发突变，并用青霉素法淘汰野生型，逐个测定法检出缺陷型，最后经生长谱法鉴定细菌的营养缺陷型。通过此过程掌握氨基酸营养缺陷型的筛选方法和鉴别过程。关键词：营养缺陷性，诱变剂，大肠杆菌，青霉素，氨基酸 1、实验目的要求了解营养缺陷型突变株选育的原理。学习并掌握细菌氨基酸营养缺陷型的诱变、筛选与鉴定方法。 2、实验原理营养缺陷型是指野生型菌株由于某些物理因素或化学因素处理，使编码合成代谢途径中某些酶的基因突变，丧失了合成某些代谢产物(如氨基酸、维生素)的能力，必须在基本培养基中补充该种营养成分，才能正常生长的一类突变株。这类菌株可以通过降低或消除末端产物浓度，在代谢控制中解除反馈抑制或阻遏，而使代谢途径中间产物或分支合成途径中末端产物积累。在氨基酸、核苷酸生产中已广泛使用营养缺陷型菌株；也可用于遗传学分析、微生物代谢途径的研究及细胞和分子水平基因重组研究中作为供体和受体细胞的遗传标记。营养缺陷型筛选一般分四个环节，即诱变剂处理、营养缺陷型浓缩、检出和鉴定。诱变处理突变频率较低，只有通过淘汰野生型，才能浓缩营养缺陷型而选出

16SrDNA鉴定菌株的标准操作规程

16S r D N A鉴定菌株的标准操作规程

16SrDNA鉴定菌株的标准操作规程 1.适用范围本标准规定了通过特定引物对细菌的16SrDNA片段进行PCR扩增，然后对扩增片段进行序列分析比对，快速获得细菌种属信息的操作规程。本标准适用于未知细菌的快速种属分析，以及为细菌的生化鉴定提供指导信息。 2.方法和原理 16SrDNA鉴定是指用利用细菌16SrDNA序列测序的方法对细菌进行种属鉴定。包括细菌基因组DNA提取、16SrDNA特异引物PCR扩增、扩增产物纯化、DNA测序、序列比对等步骤。是一种快速获得细菌种属信息的方法。细菌rRNA（核糖体RNA）按沉降系数分为3种，分别为5S、16S和23S rRNA。16S rDNA是细菌染色体上编码16S rRNA相对应的DNA序列。16S rDNA由于大小适中，约1.5Kb左右，既能体现不同菌属之间的差异，又能利用测序技术较容易地得到其序列，故被细菌学家和分类学家接受。在 16S rRNA 分子中，可变区序列因细菌不同而异，恒定区序列基本保守，所以可利用恒定区序列设计引物，将16S rDNA片段扩增出来，利用可变区序列的差异来对不同菌属、菌种的细菌进行分类鉴定。 16SrDNA序列的前500bp序列变化较大，包含有丰富的细菌种属的特异性信息，所以对于绝大多数菌株来说，只需要第一对引物测前500bp序列即可鉴别出细菌的菌属。针对科学论文发表或是前500bp无法鉴别的情况，需要进行16SrDNA的全序列扩增和测序，得到较为全面的16SrDNA的序列信息。

由于测序仪一次反应最多只能测出700bp的有效序列，为了结果的可靠性，通常将16SrDNA全长序列分成3部分进行测序。 3.设备和材料 3.1器材移液器（1000μL、200μL 、100μL、10μL）；涡旋振荡器；Eppendorf MixMate；离心机；水浴锅；电泳仪；制冰机；低温冰箱；PCR仪：Veriti 96 Well Thermal Cycler；凝胶成像仪：VersaDoc MP 4000；基因分析仪： AB3500、AB3130 3.2试剂 DNA快速提取试剂：PrepMan Ultra；琼脂糖；PCR试剂：Taq酶，10×Taq Buffer(Mg2+)，dNTPs，ddH2O等； ExoSAP-IT；测序试剂：BigDye Terminator，5×Sequencing Buffer；BigDye XTerminator Purification Kit； 3.3耗材移液器吸头：1000μL、200μL、10μL；离心管：1.5mL、200μL；Micro Amp TM Optical 96-Well Reaction Plate；Micro Amp TM Optical Adhesive Film；