细胞冻存的方法与步骤

细胞冻存、解冻方法与细胞计数

江苏大学附属医院风湿科李晶K返回主页》

一、细胞冷冻保存

1、材料：

生长良好之培养细胞、新鲜培养基、DMSO（Si gma D-2 6 5 0）＞无菌塑料冷冻保存（Na 1 gene 5 0 0 0 -00 20）、0、4 % （w/ v）try pan blue（GibcoBRLI 5 250-061）.血球计数盘与盖玻片、等速降温机（KRYOlOSeri esl

I ）

2、冷冻保存方法：

（1 ）传统方法：冷存管置于4°C 1 0分钟一一＞-20°C3 0分钟一一〉-80°C 1 6~18小时（或隔夜）＞液氮槽

v a p orph a s e长期储存.

-20°C不可超过1小时，以防止胞内冰晶过大，造成细胞大量死亡，亦可跳过此步骤直接放入一80°C冰箱中，惟存活率稍微降低一些。

（2 ）程序降温:利用已设定程序得等速降温机以一1?- 3°C/分钟之速度由室温降至（一8 0 °C以下）-12 0 °C, 再放在液氮槽v a p orpha s e长期储存。适用于悬浮型细胞与hyb r idom a之保存。

3、步骤：

（1）冷冻前24-48小时更换半量或全疑培养基，使细胞处于指数生长期。

（2）配制冷冻保存溶液（使用前配制）：另取一离心管，加入培养基、血淸，逐滴加入二甲基亚砚（DMSO）至 20%浓度，即制成双倍得冻存液，置于室温下待用。

（3）离心收集培养之细胞，用加血淸得培养基重悬起细胞，取少量细胞悬浮液（约0、1ml）计数细胞浓度及冻前

存活率。

（4）取与细胞悬液等量得冻存液，缓慢逐滴加入细胞悬液，并晃动试管，制成细胞冻存悬液（DMSO最后浓度为5?10%）,使细胞浓度为1?5X 10r cells/mb混合均匀，分装于已标示完全之冷冻保存管中，l~2m 1/vial,并取少量细胞悬浮液作污染检测?严密封口后，注明细胞冬称、代数、日期。然后进行冻存。

4、注意事项：

（1）欲冷冻保存之细胞应在生长良好（logphase）且存活率高之状态，约为80~90%致密度。冷冻前检测细胞就是否仍保有其特有性质，例如hybr i doma应在冷冻保存前一至二日测试就是否有抗体之产生。

（2）细胞在液氮中可长期冻存无限时间，而不会影响细胞活力;在一70度可保存数月。

（3）注意冷冻保护剂之品质。DMS0应为试剂级等级，无菌且无色（以0、2 2micron FGLP Telf I on过滤或就是直接购买无菌产品，如Sigma D-2650）,以5'10ml小体积分装,4°C避光保存，勿作多次解冻。Glycerol亦应为试剂级

等级，以高压蒸汽火菌后避光保存。在开启后一年内使用，因长期储存后对细胞会有毒性。本方法中先制备双倍冻存液，可避免DMSO宜接加入时释放得热呈:对细胞得损伤。缓慢逐滴加入细胞悬液就是使细胞逐步适应高渗，可降低细胞受损。DHSO可能引起部分白血病细胞株得分化，可换用10 %甘油冻存。

（4 ）冷冻保存之细胞浓度：

①n orm a 1 human fibroblast： 1^ 3 X1 0 s c e 11 s /m 1

②hybridom a : 1?3 X 10s cells / ml,细胞浓度不要太髙，某些hybridoma会因冷冻浓度太高而在解冻24小时后死去。

③ad h er e nt tumo r 1 i n e s ：5~7X 10°,依细胞种类而异.A den o carcinom a解冻后须较髙之浓度，而HeLa 只需 r 3 X 10s c e 1 1 s/ml

④other sus pen s ions： 5 ?10X 1 06cells/ml? human lymp h oc y t e 须至少 5X 10' cells/ml.

（5）冷冻保护剂浓度为5或1 OWDMSO,若就是不确左细胞之冷冻条件，在做冷冻保存之同时，亦应作一个backup c ulture,以防止冷冻失败。

（6）冻存可用10%?90$得血淸，一般高浓度血淸有助于维护细胞活力，此处介绍20%终浓度有利于细胞悬浮而少沉积（4度时）,复苏存活率在80%?90%以上，对原代培养细胞，以90%血淸冻存更为有效。

二、冷冻细胞活化

1、冷冻细胞之活化原则为快速解冻，以避免冰晶重新结晶而对细胞造成伤害，导致细胞之死亡。

2、细胞活化后，约需数日，或继代一至二代，其细胞生长或特性表现才会恢复正常（例如产生单株抗体或就是苴它蛋白质）.

3、材料

3 7 °C恒温水槽、新鲜培养基、无菌吸管/离心管/培养瓶、液氮或干冰容器

4、步骤：

（1 ）操作人员应戴防护而罩及手套，防止冷冻管可能爆裂之伤害。

（2）自液氮或干冰容器中取出冷冻管，检査盖子就是否旋紧，由于热胀冷缩过程，此时盖子易松掉。

（3）将新鲜培养基宜于3 7 °C水槽中回温，回温后喷以70%酒精并擦拭之，移入无菌操作台内。

（4）取岀冷冻管，立即放入3 7°C水槽中快速解冻，轻摇冷冻管使其在1分钟内全部融化，以70%洒精擦拭保存管外部，移入无菌操作台内。

(5)取出解冻之细胞悬浮液，缓缓加入有培养基之培养容器内(稀释比例为1:10?1 :15),混合均匀，放入CO2 培养

箱培养?取0、1ml解冻细胞悬浮液作存活测试。

(6)解冻后就是否立即去除冷冻保护剂(例如DMSO或glycero 1),依细胞种类而异，一般而言，大都不需要立即去

除冷冻保护剂。惟若要立即去除，则将解冻之细胞悬浮液加入含有5-10m 1培养基之离心管内，离心lOOOrpm, 5分钟，移去上淸液，加入新鲜培养基，混合均匀，放入C 02培养箱培养。

(7)若不需立即去除冷冻保存剂，则在解冻培养后隔日更换培养基.

三、细胞计数与存活测试

1、原理：

⑴计算细胞数目可用血球计数盘或就是Coul tercoun t er粒子计数器自动计数。

(2)血球汁数盘一般有二个c h a mb e r s ,每个ch a m b e r中细刻9个1mm'大正方形，其中4个角落之疋方形再细刻1 6个小格，深度均为0 .1mm.当chamber上方盖上盖玻片后，每个大正方形之体积为1 mm’XO. 1 mm二1、Ox 10 'ml o使用时，计数每个大正方形内之细胞数目，乘以稀释倍数，再乘以10",即为每ml中之细胞数目.

(3)存活测试之步骤为dyeexclusio n ,利用染料会渗入死细胞中而呈色，而活细胞因细胞膜完整,染料无法渗入而不会呈色。一般使用蓝色之tryp a n b lue染料，如果细胞不易吸收tr y pa n blue,则用红色之Er y t h ro s i n bluisho U-算细胞活率：活细胞数/(活细胞数+死细胞数)X100亂计数应在台盼兰染色后数分钟内完成，随时间延长，部分活细胞也开始摄取染料;因为台盼兰对蛋白质有很强得亲与力，用不含血淸得稀释液，可以使染色汁数更为准确。

2、材料：

0、4%w/ v trypan b 1 ue(G ibcoB RL1 5 250—061) ;Erytho sin b luish st a in;取 0、1 g r am Er y t h r osin bluish (Sigma E-9259)及0、0 5 gram pre ser vat ive methyl pa r aben (SigmaH-3647)溶于 10 0 mlC a ++/Mg++f r ee s a 1 ine; iflL 球计数盘及盖玻片(H e mocyt o met e r a n d co v ersl i p)；计数器(counter)：低倍倒立显微镜：粒子汁数器(Co u It e rcoun t er, Cou I t e r Electron i cs)?白细胞稀释液(4%乙酸溶液)。

3、步骤：

(1)取50卩1细胞悬浮液与5 0 u 1 trypan blue (or E rythrosin b lu i s h)等体积混合均匀于1、5m I小离

心管中。

(2 )取少许混合液(约15 u 1 )自血球汁数盘c h amb e r上方凹槽加入，盖上盖玻片，于1 00倍倒立显微镜下观察，活细胞不染色，死细胞则为蓝色(或红色-E r y thr o sin bluish )?

(3)计数四个大方格之细胞总数，再除4,乘以稀释倍数(至少乘以2,因与trypan blue等体积混合)，最后乘以 10：即为每ml中细胞悬浮液之细胞数。若细胞位于线上，只il?上线与右线之细胞(或汁下线与左线之细胞)。

注：4大格细胞总数X稀释倍数X1 0 74二细胞数/ ml;每一大格得体积=0. lcmXO. lcmXO. 0 1 cm=10_,m 1

计数板讣数时，最适浓度为5?1 0X10'细胞/ml,此范羽外计数误差偏大。髙浓度细胞悬液，可取岀部分作稀释或连

续稀释后计数。

5、范例：

T75 mono 1 aye r cu I t ure制成10ml细胞悬浮液，取0、1ml溶液与0、lml trypan bl u e混合均匀于试管中，取少许混合液加入血球计数盘，计数四大方格内之细胞数目.

活细胞数/方格：55, 6 2,49,5 9：死细胞数/方格:5,3,4, 6;细胞总数=2 4 3

平均细胞数/方格=6 0、75;稀释倍数二2 ；

细胞数/ml:60、75X10l X2(稀释倍数)二1、2 2 X 1 06：

细胞数/fl ask (10 ml):l、22X10' X 10m 1=12. 2X10 '

存活率：2 25/243= 92、6%