上海海洋大学基因工程实验指导

《基因工程实验》讲义

水产与生命学院

2011年12月

目录

注意事项 (2)

实验一中华绒螯蟹肌肉中基因组DNA提取 (3)

实验二动物组织总RNA的提取 (5)

实验三cDNA第一条链的合成 (7)

实验四重组DNA的制备 (8)

（1）利用PCR技术获得DNA片段以及PCR产物的纯化 (8)

（2）纯化产物连接入T载体并将其转化感受态细胞DH5 (10)

（3）碱变性法提取质粒DNA（小规模）并酶切鉴定 (11)

实验五利用RACE法克隆基因 (13)

注意事项

1.上实验课不能迟到，分小组进行实验。

2.课前要提前预习实验内容，弄清实验设计的原理，理清实验顺序。

3.由于实验内容多，时间短，多数实验需要同时或穿插进行，做好

统筹安排。

4.实验的每一步都要详细的记录操作内容、时间、步骤、结果等。

5.对任何自己不熟悉的实验仪器（尤其是移液器）都不要随意操作。

在操作过程中发现任何意外的现象都要及时向任课老师汇报。

6.在实验室内不能大声喧哗，，严格遵守课堂纪律。

7.在实验操作过程中注意一定要穿实验服，带手套，制造的任何垃

圾都要丢到垃圾筐里，严禁随地投弃。特别注意对废弃细菌的杀灭和有毒垃圾的定点投放。

8.实验时损坏的任何物品都要及时申报。

9.实验结束后要把用过的器皿清洗干净并归放整齐、清点数目，向

老师汇报征得同意后方可离开实验室。

10.写作实验报告或实验论文一定要纹理通顺、逻辑清晰、图标说明

详细、讨论分析透彻（包括操作的失误）。

实验一中华绒螯蟹肌肉中基因组DNA提取

一、实验目的：掌握一种提取基因组DNA的方法。

二、实验原理：采用细胞裂解液裂解细胞，加入蛋白酶K除去蛋白，然后用氯仿抽提DNA，最后用RNA酶处理，获得基因组DNA

三、试验材料

1.实验器具：移液抢、灭菌枪头、离心管、恒温仪、高速离心机、研钵、研磨棒。

2.实验对象：中华绒螯蟹

3.试剂：氯仿、无水乙醇、TE。

四、方法步骤：

1.准备：25-30mg中华绒螯蟹肌肉在液氮中研碎，将粉末收集到1.5ml离心管中，用200

μlTE悬浮。注意避免多次冻融样品，每次冻融都大大降低完整DNA的产率。

2.200μl样品加400μl cell lysis solution混匀，再加入6μl Proteinase K混匀，置于55℃

水浴5-10min。其间上下混匀几次，延长消化时间到30min可能效果更好。

3.加入600μl氯仿（自备）混匀，不能太剧烈，以保证DNA的完整性。

4.在台式离心机上，10000转/分，室温离心2min。此时应分成三层，基因组DNA在上层

中，如未能分层，表明样品与氯仿未混匀。取500μl上层清液，置于无菌1.5ml离心管中。

5.加入500μl Precipitation Solution混匀，室温放置2min。10000转/分，离心2min。

6.吸去上清，注意不要吸到沉淀，立即加入100μl，1.2mol/l NaCl,轻轻振荡直至DNA样

品完全溶解，加入3μl RNaseA，置于37℃5-10min，以除去RNA。

7.加入300μl冰冷乙醇（自备），-20℃放置10min。10000转/分，离心5-8min。吸走或倒

掉乙醇，用70%乙醇清洗一次。倒置室温干燥10min。DNA用100μl水或TE溶解。8.电泳检测

电泳：

一、试验目的：依据核酸的相对分子量分离核酸。通过已知大小的标准物移动的距离与未

知片段的移动距离进行比较，推测出未知片段的大小。

二、试验材料：电泳仪、琼脂糖、缓冲液、微波炉、胶板、做胶槽

三、试验步骤：

1.1%浓度的胶：称取0.15g的琼脂糖，加入15ml的0.5×TBE buffer。放入微波炉加热，

使琼脂糖完全溶解混匀。当胶溶液稍微冷却后，混匀后倒入做胶板中。三十分钟后取出。

2.点样：5μl的DNA样品和1μl的上样缓冲液混合后加入胶孔中。

3.电泳：100V，30min左右。

4.染色：将电泳后的琼脂糖凝胶放入含有EB的TBE中染色15分钟。

5.观察拍照。

注意事项：

1.液氮研磨时要充分、迅速。

2.吸取上层水相时切勿吸到中间层（蛋白）。

3.离心时将离心管对称放入离心机中，保持平衡。

实验二动物组织总RNA的提取

【实验目的】

1.掌握一种RNA提取的方法。

【实验原理】

TRIZOL试剂中的主要成分为异硫氰酸胍和苯酚，其中异硫氰酸胍可裂解细胞，促使核蛋白体的解离，使RNA与蛋白质分离，并将RNA释放到溶液中，当加入氯仿时，它可抽提酸性的苯酚，而酸性苯酚可促使RNA进入水相，离心后可形成水相层和有机层，这样RNA与仍留在有机相中的蛋白质和DNA分离开。水相层（无色）主要为RNA，有机相主要为DNA和蛋白质。【实验药品与器材】

匀浆器，微量移液器，微量恒温器，1.5mL离心管，冷冻离心机，Trizol试剂，氯仿，异丙醇，75％酒精，DEPC水，琼脂糖，电泳仪，分光光度计。

【步骤】

取样：将罗氏沼虾活体解剖，迅速取卵巢组织约100mg于1.5ml的离心管中，置液氮罐冷冻备用。用Trizol试剂提取总RNA：

1.每个离心管加1mL Trizol试剂于冰上碾碎组织

2.碾碎后在30℃恒温箱中保存5分钟

3.每1mL Trizol加0.2mL氯仿，用手震荡15秒，放30℃恒温箱中3分钟

4.离心：低温4℃，12000g，15分钟

5.取上层水相到另一干净离心管

6.每1mL Trizol加0.5mL异丙醇，30℃恒温箱中10分钟

7.离心：低温4℃，12000g，10分钟

8.清洗RNA：移去上清，每1mL TRIzol加入1mL75%酒精，用移液枪反复吹洗打散

9.离心：低温4℃，7500g，5分钟

10.乙醇析出，可见白色沉淀于管壁，自然干燥15分钟

11.用30μL DEPC直至完全溶解，然后放置于-80℃冰箱保存。

12.1%琼脂糖凝胶电泳检测RNA质量

13.测OD值

注意事项：

a)整个实验过程中，戴口罩，并随时更换手套。

b)切勿碰触离心管口及盖子内部，以防污染RNA酶。

c)加入Trizol后研磨要迅速，并且在冰上操作。

d)吸取上层水相时切勿吸到中间层（蛋白）。

实验三cDNA第一条链的合成

【实验目的】

掌握cDNA合成的方法，为后续PCR实验做准备。

【原理】

所有合成cDNA第一链的方法都要用依赖于RNA的DNA聚合酶(反转录酶)来催化反应。有一种方法为oligo(dT)引导的cDNA合成法，它利用真核mRNA分子所具有的poly(A)尾巴这种特性。由12-20个脱氧胸腺嘧啶核苷组成的oligo(dT)段片段，在同mRNA分子混合过程中会杂交到poly(A)尾巴上去，并作为引物引导反转录酶按mRNA模板合成第一链cDNA。这种反应的产物是一宗RNA-DNA杂交分子。

【步骤】

1)在PCR管中依次加入以下成分：共10μl

Oligo dT Primer(50μM)1μl dNTP Mixture(10mM each)1μl Total RNA(1000ng/μl)1μl Rnase free dH2O7μl 反应条件：65℃5min,急冷2min

2)在上述反应液（10μl）中加入以下成分

5×PrimeScript Buffer4μl RNase Inhibitor(40U/μl)0.5μl PrimeScript Rtase1μl RNase Free dH2O 4.5μl 总共20μl 反应条件：42℃60min，70℃15min，4℃∞

反应完成后即为cDNA

注意事项：

1.正确使用微量移液器。

2.RNA样品要避免基因组DNA污染。

实验四重组DNA的制备

（1）利用PCR技术获得DNA片段以及PCR产物的纯化

【实验目的】

1.了解PCR的原理，掌握体外大量扩增DNA的方法。

2.学习一种纯化DNA的方法。

【实验原理】

1.PCR类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸

引物。PCR由变性--退火(复性）--延伸三个基本反应步骤构成：①模板DNA的变性：模板DNA经加热至94℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；②模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至40~60℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；③引物的延伸：DNA模板--引物结合物在DNA聚合酶的作用下，于72℃左右，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链重复循环变性--退火--延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2～4分钟，2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。

【实验药品与器材】

PCR仪，电泳仪，微量移液器，微量恒温器，恒温培养箱，恒温摇床，超净工作台，DNA凝胶回收试剂盒，引物，模板DNA，琼脂糖，5×TBE电泳缓冲液，EB，1.5ml、0.2ml离心管，枪头等。

【实验步骤】

（一）PCR检测：25μl反应体系

模板：1μl

水：15.8μl

Buffer：4μl

dNTP：2μl

上下游引物：各1μl

酶：0.2μl

反应条件，Tm：55℃；30循环

注意事项：根据扩增DNA片段长度和引物的Tm值，选择合适的延伸时间和退火温度。

（二）割胶纯化

1.柱平衡步骤：向吸附柱CA2中（吸附柱放入收集管中）加入500μl平衡液BL，12,000

rpm(~13,400×g)离心1分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。

2.将单一的目的DNA条带从琼脂糖凝胶中切下（尽量切除多余部分）放入干净的离心管

中。向胶块中加入3倍体积溶胶液PN（如凝胶重为0.1g，其体积可视为100μl）。

50℃水浴放置10分钟，其间不断温和地上下翻转离心管，以确保胶块充分溶解。如果还有未溶的胶块，可再补加一些溶胶液或继续放置几分钟，直至胶块完全溶解（若胶块的体积过大，可事先将胶块切成碎块）。

注意：胶块完全溶解后最好将胶溶液温度降至室温再上柱，因为吸附柱在较高温度时结合DNA的能力较弱。

3.将上一步所得溶液加入一个吸附柱CA2中（吸附柱放入收集管中），室温放置2分钟，

12,000rpm(~13,400×g)离心30－60秒，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CA2放入收集管中。

注意：吸附柱容积为800μl，若样品体积大于800μl可分批加入。

4.向吸附柱CA2中加入600μl漂洗液PW（使用前请先检查是否已加入无水乙醇），

12,000rpm(~13,400×g)离心30－60秒，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CA2放入收集管中。

5.向吸附柱CA2中加入600μl漂洗液PW，12,000rpm(~13,400×g)离心30－60

秒，倒掉废液。

6.将吸附柱CB2放回收集管中，12,000rpm(~13,400×g)离心2分钟，尽量除去漂洗液。

将吸附柱CB2置于室温放置数分钟，彻底地晾干，以防止残留的漂洗液影响下一步的实验。

注意：漂洗液中乙醇的残留会影响后续的酶反应（酶切，PCR等）试验。

7.将吸附柱CB2放入一个干净的离心管中，向吸附膜中间位置悬空滴加30-50μl洗脱缓

冲液EB，室温放置2分钟。12,000rpm(~13,400×g)离心2分钟收集DNA溶液。

（2）纯化产物连接入T载体并将其转化入感受态细胞DH5α中

【实验目的】

1.认识和学习连接酶的性质和作用以及载体（pGM-T载体）的特性。

2.认识α互补现象，理解重组DNA的筛选、鉴定方法。

【实验原理】

1.T-A连接是利用Taq酶在PCR产物3'末端有加上一个A的特性，使得Taq酶的PCR产物或经过Taq酶加A的PCR产物，和3'末端具有1个突出T的T载体进行连接，由于突出末端可以互补，这样可以大大提高目的基因和载体的连接效率，这样的克隆称作T-A克隆。

2.外源DNA与感受态细胞热激是较常用的转化方法。

3.利用α互补现象筛选重组DNA，pGM-T载体带有一个大肠杆菌DNA的短片段，含有β-半乳糖苷酶基因（lacZ）的调控序列和头146个氨基酸的编码信息（β-半乳糖苷酶的N端），它可与E.coli DH5α编码的β-半乳糖苷酶的C端形成α互补，使生色底物X-gal显蓝色。如有外源DNA插入，α互补被破坏，则形成白色菌落。然后应用酶切和琼脂糖电泳技术鉴定重组DNA。

【实验药品与器材】肠杆菌（DH5α）感受态，LB液体培养基，LB固体培养基，X-gal，IPTG，摇菌管，1.5ml、0.2ml离心管，涂布器，枪头等。

【实验步骤】：

（一）连接

1.将载体在冰上融化，离心数秒。

2.在无菌离心管中加入以下成分：PCR纯化产物5μl，载体1μl，Buffer1μl，水2μl，

连接酶1μl。

3.清弹混合物，短暂离心。16℃过夜。

注意事项：目的DNA和载体的摩尔比例关系影响连接效率。

（二）转化：将获得的重组质粒转入感受态细胞中。

1.取出-80℃保存的感受态细胞DH5α，在冰上融化。

2.将10ul的连接液加到100ul感受态细胞中，混匀，冰上放置30分钟。

3.42℃水浴热激90秒，迅速将管子放到冰上冷却2-3分钟。

注意：42℃热处理很关键，温度要准确，转移速度要快。

4.加入900ul LB培养基，混匀后37℃，150rpm摇床培养45分钟。

5.台式离心机中4000rpm离心2分钟，吸去800ul上清液，混匀剩余的菌液，吸取100ul

涂LB固体平板（含Amp抗生素），37℃过夜培养（12-16小时）。

利用α互补现象筛选重组DNA。

平板制作：在LB琼脂板中央滴加40ul2%X-gal和7ul20%IPTG，用无菌的涂布器涂匀，37℃温育至全部液体被吸收。

（三）鉴定

用牙签挑取白色单菌落于4m LB液体培养基中，37℃摇床过夜培养，准备次日提质粒做酶切鉴定。

（3）碱变性法提取质粒DNA（小规模）并酶切鉴定

【目的】

学习制备质粒DNA技术，掌握常用的小规模提取质粒DNA的一种方法。

【原理】

碱变性法制备质粒DNA是基于染色体DNA与质粒DNA变性和复性的差异而达到分离的目的。在强碱条件下，染色体DNA变性，双螺旋结构解旋、氢键断开；而质粒DNA 的超螺旋结构的氢键不会完全断开。因此在中性条件下，质粒DNA又恢复到原来的结构；而染色体DNA呈网状结构，不能复性到原来的状态。这样通过离心，染色体DNA 与其它大分子物质一起下沉而被除去。

【实验材料】

1.实验器具：超净工作台，恒温振荡器，台式离心机，电泳仪，微波炉，电子天平，酒精

灯，微量移液器，试管，1.5ml离心管，牙签。

2.菌种：大肠杆菌DH5α（含pGM-T重组质粒）。

3.试剂：LB液体培养基，TIANprep质粒小提试剂盒，TBE电泳缓冲液，琼脂糖，6×上

样缓冲液，200bp DNA marker，EB。

【实验步骤】

（一）提质粒

1.在超净工作台中，用牙签挑取单个白色菌落，接种到4ml LB液体培养基中，37℃振荡

培养过夜（12—16h）。

2.柱平衡步骤：向吸附柱CP3中（吸附柱放入收集管中）加入500μl的平衡液BL，12,000

rpm(~13,400×g)离心1分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。

3.吸取3ml菌液，加入两个1.5ml离心管中，12,000rpm离心1分钟，尽量吸除上清液。

4.向3ml菌液沉淀中加入250μl溶液P1（请先检查是否已加入RNase A），使用移液器

彻底悬浮细菌沉淀。

5.向离心管中加入250μl溶液P2，温和地上下翻转6－8次，至菌液清亮粘稠，裂解反

应时间不能超过5分钟，以免质粒受到破坏。

注意：温和地混合，不要剧烈震荡，以免打断基因组DNA，造成提取的质粒中混有基因组DNA片断。

6.向离心管中加入350μl溶液P3，立即温和地上下翻转6–8次，充分混匀，此时将出

现白色絮状沉淀。12,000rpm离心10分钟。

7.将上一步收集的上清液用移液器转移到吸附柱CP3中（吸附柱放入收集管），注意尽量

不要吸出沉淀。12,000rpm离心30-60秒，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP3放入收集管中。

8.向吸附柱CP3中加入600μl漂洗液PW（请先检查是否已加入无水乙醇），12,000rpm

离心30-60秒，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP3放入收集管中。

9.重复步骤8.

10.12,000rpm离心2分钟，目的是将吸附柱中残余的漂洗液去除。

将吸附柱CP3置于一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位滴加50-100μl洗脱缓冲液EB，室温放置2分钟，12,000rpm离心1分钟将质粒溶液收集到离心管中。

（二）酶切鉴定

在PCR管中加入以下成分：

重组质粒DNA1ug

10×buffer EcoRⅠ2ul

EcoRⅠ1ul

ddH2O up to20ul37℃,2h.。电泳检测。

实验五利用RACE法克隆基因

一、实验目的

1.培养学生独立完成一种动物未被单离基因克隆的一种方法。

2.通过学生独立设计并完成实验，培养学生对分子克隆的兴趣。

3.掌握RACE法操作过程。

二、实验对象：

日本沼虾

三、实验药品和器材：

RACE试剂盒，DNA分析软件，加样枪，枪头，1.5ml离心管，PCR仪，上样液，EB，琼脂糖，电泳仪，温度可调式恒温水域等。

四、实验内容

1.日本沼虾vasa基因3’RACE扩增

1）实验原理

2）3'-RACE-Ready cDNA的合成

在PCR管中加入以下试剂

Total RNA（500ng/μl）1μl 3′RACE Adaptor（5μM）1μl 5×M-MLV Buffer2μl dNTP Mixture（10mM each）1μl RNase Inhibitor（40U/μl）0.25μl Reverse Transcriptase M-MLV（RNase H-）（200U/μl）0.25μl RNase Free dH2O 4.5μl Total Volume10μl 反应条件：42℃60min→70℃15min

3）Outer PCR反应

上述反转录反应液1μl 10×Ex Taq Buffer(Mg2+Plus) 2.5μl Vasa基因3′RACE Outer Primer（10μM）2μl TaKaRa Ex Taq?（5U/μl）0.2μl dH2O17.3μl dNTP(各2.5mM)2μl Total Volume25μl 反应条件：94℃5min→（94℃30s，55℃30s，72℃ 1.5min）20个循环→72℃10min

4）Inner PCR反应

Outer PCR产物1μl 10×Ex Taq Buffer(Mg2+Plus) 2.5μl Vasa基因3′RACE Inner Primer（10μM）2μl TaKaRa Ex Taq?（5U/μl）0.2μl dH2O17.3μl dNTP(各2.5mM)2μl Total Volume25μl 反应条件：94℃5min→（94℃30s，55℃30s，72℃ 1.5min）30个循环→72℃10min

预期结果：目的条带大约1000bp

电泳检测。

2.日本沼虾vasa基因5’RACE扩增

1）5'-RACE-Ready cDNA的合成

向PCR管中加入以下试剂

Total RNA（500ng/μl）2μl 5’-CDS primer A1μl SMARTⅡA oligo1μl ddH2O1μl Total Volume5μl 混匀后70℃2min，冰上2min，

向上述混合液中加入以下试剂：

5×First-Strand Buffer2μl DTT(20mM)1μl dNTP Mix1μl MMLV Reverse Transcriptase1μl Total Volume10μl 用移液枪打匀，42℃ 1.5小时，加入100μl Tricine-EDTA，72℃7min，-20℃保存

2）5’RACE PCR反应

向PCR管中加入以下试剂

5-RACE-Ready cDNA 2.5μl UPM(10×)5μl Vasa基因5′RACE Outer Primer（10μM）1μl Master Mix41.5μl Total Volume50μl 反应条件：94℃5min→（94℃30s，68℃30s，72℃ 1.5min）30个循环→72℃10min

预期结果：目的条带大约1000bp。

电泳检测。