核磁共振光谱分析法在药物分析中的应用

核磁共振光谱分析在药物分析中的应用

摘要

对科学产生最大影响的分析方法是核磁共振技术，它被广泛用于许多领域。本文结合核磁共振及核磁共振光谱法的相关概念，介绍核磁共振光谱分析法的特点及其方法，着重于核磁共振光谱分析在体内药物分析中的应用。核磁共振法以其重现性好、特征性强等优点已成为药物研究的重要手段。随着天然药物生产领域的发展，核磁共振作为质量控制的手段已得到重视，并逐渐地应用于实践。相信不久的将来，核磁共振技术将会更好地为人类服务，为药物研究作出贡献。

Abstract

In science the biggest impact on the analysis method is NMR, it is widely used in many fields. Based on the nuclear magnetic resonance (NMR) and magnetic resonance spectroscopy ,this article introduce nuclear magnetic resonance spectroscopy analysis of characteristics and methods and focusing on nuclear magnetic resonance spectra analysis in vivo drug analysis in application. As natural drug production fields of development, nuclear magnetic resonance (NMR) as quality control means has been seriously, and gradually applied in practice. Nuclear magnetic resonance (NMR) technology will better service to humanity, for drug research to contribute in the future. 关键词: 核磁共振核磁共振光谱法定量分析法药物分析

Keywords: nuclear magnetic resonance nuclear magnetic resonance spectroscopy quantitative analysis method drug analysis

正文：1945年，F．Bloch和E．M．Purcell分别领导的两个小组几乎同时发现了核磁共振(NuelearMagnetic Resonance，简称NMR)现象。NMR技术最初只应用于物理科学领域，但随着超导技术、计算机技术和脉冲傅立叶变换波谱仪的迅速发展，今天核磁共振已成为鉴定有机化合物结构和研究化学动力学等诸多领域中极为重要的方法，而且其应用领域正在逐

步扩大。核磁共振技术在药物检验分析中的应用已有多年，由于其具有其他方法难以比拟的独特优点，即定性测定不具有破坏性、定量测定不需要标样，因此核磁共振技术在药物

分析中应用和发展也越来越广泛?。

核磁共振（Nuclear Magnetic Resonance）原是一种原子核的物理现象，它的原理可以用一个不严格的简单模型来说明：用最简单的原子核──氢核为例，氢原子核是一个带正电的质子，同时原子核具有自旋性，从古典电磁学的观点看来，这个自旋的带电质子将具有磁性，我们不妨把它暂时看成是个小磁铁。如果我们外加一个磁场，小磁铁在磁场中的不同方位与外加磁场产生不同的作用力，如图一a是较稳定的状态，图一b则是较不稳定的状态。也就是说，「小磁铁」在外

加磁场中有了两种不同的位能状态，两者之间能量的差别要看外加磁场的大小，外加磁场愈大，这个能量差就愈大。图一中a,b的两种情形，正好对应质子相反方向的两种自旋所产生的磁距，在未加外磁场时，这两种方向的自旋没有位能的差别，一旦加上外磁场，就有两种不同的能量状态了。这个道理可以应用于其它更复杂的原子核，只要原子核具有自旋，在外加磁场中就会分出不同能量的状态，只是有些核子能量的分歧更复杂罢了。

再回到氢原子核，在磁场中既有两种能量状态，则核子在这两个能阶上的分布就不会一样，低能阶上的分布要比高能阶上的分布多一点，这是自然的定律。如果我们这时在垂直于磁场的方向照射一种电磁波，其频率为ν，其能量为hν（h是蒲郎克常数），使得hν正好等于上述两个能阶的差，这时两能阶间就会有核子迁移的现象发生，其净结果是，处于低能阶上较多的核子吸收了hν的能量达到高能阶。这个现象就是核磁共振。

另外，核磁共振光谱法是利用10－100nm波长的电磁波照射分子，使之与暴露在强磁场中的一定原子核互相作用，并且在某些特定磁场强度处产生强弱不同的吸收信号，以此而建立的有机化学结构分析方法。可用于有机化合物的结构分析、定量分析、分子量测定等方面。对中药化学成分的研究具有重要意义。

下面，介绍一下核磁共振光谱法在药物分析中的应用。

（一）特点：

1、对于确定的核（质子），其信号强度与产生该信号的核（质子）的数目成正比，而与核的化学性质无关。

2、利用内标法或相对比较法，分析混合物中某一化合物时可无需该化合物的纯品作对照。

3、信号峰的宽度很窄，远小于各信号之间的化学位移的差值，因而混合物中不同组分的信号之间很少发生明显的重叠。

4、方法简易快速、专属性高，可选择性地测定复方药物或药物制剂中的组分乃至药物的立体异构体；一般无需分离，且不破坏被测样品。

（二）定量分析方法：NMR图谱中，可获得化学位移、偶合常数、共振峰面积或峰高。化学位移和偶合常数是结构测定的重要参数；而共振峰面积或峰高是定量分析的依据。共振峰面积或峰高直接与被测组分的含量成正比。定量分析时，一般只对该化合物中某一指定基团上质子引起的峰面积或峰高与参比标准中某一指定基团上质子引起的峰面积进行比较，即可求出其绝对含量。当分析混合物时，也可采用其各个组分的各自指定基团上质子产生的吸收峰强度进行相对比较，然后求得相对含量。因此，在测量峰面积或峰高以前，必须了解化合物的各组成基团上质子所产生共振峰的相应位置，也就是它们的化学位移值（值），并选择一个合适的峰作为分析测量峰。常用的NMR定量分析方法有：

1、内标法（绝对测量法）：在样品溶液中，直接加入一定量内标物质后，进行NMR 光谱测定。将样品指定基团上的质子引起的共振峰（即吸收峰）面积与由内标物质指定基团上的质子引起的共振峰面积进行比较，当样品与内标均经精密称重时，则样品的绝对重量(Wu)可由下式求得：W u/W s=A u·EW u/ A s·EW s——W u=W s·A u·EW u/ A s·EW s式中：Au为样品测得和峰面积（不少于5次测定的平均

值）；A

s 为内标物测得的峰面积（不少于5次测定的平均值）；EW

u

为样品在该化学

位移处的质子当量；EW

s

为内标在该化学位移处的质子当量。若样品重为W，则百分含量=W u/W×100%

对内标物要求：(1)最好能产生单一的共振峰，在扫描的磁场区域中，参比共振峰

与样品峰的位置至少有30Hz的间隔；(2)应溶于分析溶剂中；(3)应有尽可能小的质子当量(EW

s

)；(4)不应与样品中任何组分相互作用。常用的内标物有：苯或苯甲酸苄酯（在5.3ppm处，由C6H5COOCH2-C6H5中的-CH2所致），适用于非芳香化合物；马来酸，适用于非链烯型化合物。

2、相对测量法：当不能获得样品的纯品或合适的内标时，可用相对测量法进行分析。操作方法与内标法相同。计算相对含量是以样品指定基团上一个质子引起的吸收峰面积(A1/n1)和杂质指定基团上一个质子引起的吸收峰面积(A2/n2)进行比较，然后按下式计算样品与该杂质的相对百分含量：

样品的相对百分含量={(A1/n1/[(A1/n1)+(A2/n2)]}×100%

式中，n

1和n

2

是指定基团的质子数。本法适用于含有一、二种杂质的样品的分析。

3、外标法：欲测样品中某一组分的含量，可采用该组分的标准品做成一系列不同浓度的标准液，使样品液浓度在其范围内，然后进行NMR测定，由所得图谱中某一指定基团上质子引起的峰面积对浓度作图，即得标准品的校正曲线。在平行条件下，测定样品溶液组分指定基团上质子的峰面积，即可由校正曲线求得样品的浓度。

4、峰高或峰位测量法：结构相似的混合物样品（如互为异构体），由于其NMR峰分离效果不好，用峰面积定量法不能精确测定，误差较大，此时可考虑采用峰高测量法或峰位测量法。

(1)峰高测量法：是基于峰高与样品中有关核的浓度成正比，各组分之间的峰高比只取决于样品的百分组成，而与样品的多少和仪器的性能无关。测定某一对异构体时，先用异构体I和II的纯品配成溶液，再用质子快速交换简化光谱。由简化的NMR光谱可知两异构体的吸收峰互不干扰；可测出各自峰高。两者摩尔数

M I +M

II

=1，若两者的峰高为H

I

和H

II

，则：

H

I

=M

I

×C

I

=（1-M

II

）C

I

；H

II

=M

II

×C

II

；两式中，C

I

和C

II

是异构体I和II的峰

高系数，为已知，H

I 和H

II

可测得。据此可求得M

I

和M

II

。

(2)峰位测量法：当样品中两种组分之间具有可进行质子快速交换的基团时，经质子快速交换后，原来两种组分基团的信号合并，在NMR光谱上得到单一信号，此峰的化学位移与两组分的摩尔分数有线性关系，因此，测出混合物的化学位移，可直接求出二组分的混合比例。如有机胺及其盐的N-CHa上的质子可以进行质子快速交换，可用NMR法定量测定有机胺酸性水溶液的氯仿提取液中游离胺及其盐的比例。混合物中N-CHa的化学位移(m)可按下式计算：

m= b+( a- b)Xa 式中 b和 a为纯的游离胺及其盐的化学位移，Xa为盐的摩尔分数。以 m对Xa或Xb（游离胺的摩尔分数）作图，应呈直线关系。因此可先用纯品配成已知组成比例的混合物，测得其 m并作出校正曲线后，再测得未知混合物的 m，即可由校正曲线求得Xa或Xb。

下面介绍核磁共振光谱在体内药物分析的应用

体内药物分析是对生物体内药物及其代谢物的分析。由于体内样品有这样一些特点：药物及其代谢物在大量的体液中浓度很低；存在着内源性干扰物质；取样量受限制；样品具有不重复性。而NMR在体内药物分析中具有明显的优点，即简便性、无损伤性、连续性、高分辨性和多目标性，因此其在体内药物分析中有较广泛的应用[33。MRS能检测含H、P、C、F、Na等生化物质的代谢变化H1。，其中以H、c、F、P应用最多。质子(H)磁共振波谱多用于监测与脂肪、氨基酸及神经递质有关的多种微量代谢物，临床研究中能观测到的有N一乙酰天门冬氨酸、含胆碱的化合物、肌酸、肌醇、乳酸和磷酸肌酸等。(1)N一乙酰天门冬氨酸(N—

acetylaspartate，NAA)主要存在于神经元中，是目前公认的神经元结构完整性的标志物，NAA降低提示神经元缺失，受损或功能活动异常。但是Bhakoo等发现成熟的少突胶质细

胞也表达NAA，可能就是H—MRS中的2．02ppm的信号。

(2)含胆碱的化合物(choline—contmning compounds，CHO)为磷酸脂代谢产物，在脑形成髓鞘过程中被用来合成磷脂，主要存在于细胞膜上，反映细胞膜的合成及代谢变化。(3)

肌酸和磷酸肌酸(creatine andphos2phocreatine，Cr+PCr)存在于神经元及胶质细胞中，参与磷酸转运及能量储备，受高能磷酸酯的代谢影响。在H—MRS研究中，因为其浓度相

对稳定，多作为其他物质浓度的参照，但对此也有不同看法。Chang等就发现无症状的重度可卡因滥用者的颞顶叶白质cr显著升高，而NAA正常。(4)肌醇(myo—inositol，MI)主要存在于胶质细胞中，被认为是胶质细胞特异性的标志物，其浓度增加提示胶质细胞增生。细胞外渗透压增高亦导致MI升高。谷氨酰胺和谷氨酸复合物(glutamine，gluta—mate，GLX)，前者主要存在于胶质细胞内，后者是一种兴奋性神经递质，主要位于谷氨酸能神经元内。(5)乳酸(1actare，Lac)为糖酵解的主要代谢产物，可反映无氧酵解的情况，是组织供氧不足的标志¨1。。碳13(c)核天然丰度低，其谱峰强度仅为质子峰的1／63，因而C—NMR灵敏度远低于氢谱。NMR的迅速发展将信号累加平均(CAT)、质子噪声去偶、偏共振去偶、PFr、NOE、DEPT等新技术与C—NMR结合，使C—NMR也能用于体内药物分析。C—NMR一大特点为化学位移范围很宽

(约300ppm)，相当于氢谱化学位移范围的20倍。因此不同化学环境的c共振峰重叠机会甚少，分辨率优于氢谱，实践中常将二者互补使用。已报道过用C—NMR研究布洛芬、雷尼替丁枸橼酸铋、脱氧青蒿素的体内过程。Ogiso等用C—NMR探讨了脂肪酸对普萘洛尔透皮吸收的影响。实验结果表明：与月桂酸酰胺及甲酯化合物相比，月桂酸对普萘洛尔透皮吸收的增强作用显著。普萘洛尔制剂中加入月桂酸后，血浆中普萘洛尔浓度明显提高。Copeland等用c—NMR和1H—NMR共同确认了免疫抑制剂环孢霉素’G的两种代谢途径：羟基化和去甲基化¨]。其代谢物药理活性均低于原型药。氟一19核磁共振波谱(F—NMR)在体内药物分析中可检测浓度高于10 mol，／ml、化学位移范围在一20ppm一50ppm的含氟药物及其代谢物。对于单氟原子药物谱图中每一组峰即代表一种含氟物质。F—NMR对传统生物样品中药物的研究已有许多报道，如尿样中氟氯西林代谓}研究；尿样、肝脏、肿瘤中5一氟尿嘧啶(5一Fu)代谓}及5一FU灌流心脏的心脏毒性研究；尿样中氟比洛芬代谢途径归属等。Tandon等用F—NMR对小鼠腹腔注射抗病毒药物三氟胸苷(F3TdR)后的尿样、血浆、肝脏进行分析，检测出三种代谢物：52三氟胸腺嘧啶(F3T)(12．02ppm)、5一三氟甲基一5，6一二氢胸腺嘧啶(DHF3T)(8119ppm)和5一三氟甲基一5，6一双羟基胸腺嘧啶(DOHF3T)(一0．53ppm)。其中后两种代谢物为首次检测，这就为F3TdR的体内过程提供了进一步的解释。近年来NMR谱技术发展到对整体生物系统进行体内药物分布、代谢监测。由于内源性含氟物质的浓度极低，背景干扰小，使F—NMR 优于其它磁核谱技术而首先应用于整体生物分析．Murphy等用质子去偶及NOE增益F—NMR监测接受化疗病人的肝脏中5一FU及其代谢物(FBAL)。Campbell等利用NMR 无损伤特性及表面线圈技术，测定了不同剂量抗菌素3一氟甲基青霉索V衍生物在活体sD大鼠体内的药物浓度。将静脉注药后的麻醉鼠置于表面线圈中，用F—NMR 测定鼠膀胱内尿样及胸内药物浓度。Jynpe等用F—NMR分析了给药后24h内抗菌素

氟罗沙星在正常人肝脏及肌肉中的分布。上述研究为无损伤测定生物活体内药物提供了例证，且为药代动力学研究提供了一种动态测定研究的方法。磷一31磁共振波谱(P—MRS)被广泛用于研究组织能量代谢和生化改变，可监测7种不同的化合物：磷酸单酯(phosphomonoesters，PME)，磷酸二酯(phos—phodiesters，PDE)，磷酸肌酸(phospho—creatine，PCr)，无机磷(inorgan—icphosphate，Pi)，三磷酸腺苷(仪，B，一adenosine tri—phosphates，0l，B，1一ATP)。PME和PDE反应了膜磷脂及其代谢信息，PCr、Pi、__仅，B，1一ATP可提供高能磷酸代谢信息。

核磁共振法以其重现性好、特征性强等优点已成为药物研究的重要手段。随着天然药物生产领域的发展，核磁共振作为质量控制的手段已得到重视，并逐渐地应用于实践。总之，核磁共振无疑会给天然药物研究带来巨大的推动作用。

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