细菌内毒素检验方法验证方案

细菌内毒素检验方法验证方案

1 概述:为了符合2010版GMP的要求，为了确保生产检验出符合预定用途和注册要求的产品，确保产品质量合格。保证用药安全。确认检查方法的科学持续稳定可靠适用性理想。本方案对注射用水细菌内毒素检查方法进行验证。

2 验证目的:为确保注射用水细菌内毒素检测方法的专属性、灵敏度在本实验室条件下的适用性保证检测结果科学准确可靠，特制定此方案对注射用水细菌内毒素检查方法进行验证。

3 验证方式:结合实验室实际情况，按照2010版药典附录细菌内毒素检查方法检查。由合格的检验人员对同一批供试品进行检查同一操作方法同一批供试品检查重复检查3次记录检查结果对比，看检查结果是否符合要求，重复性稳定性是否符合要求。

4 验证范围:适用于注射用水细菌内毒素检查方法验证，按照2010版药典附录细菌内毒素检查方法检查项下要求逐一进行。

5 验证结果的评价:根据药典合格标准来验证确认，确认检查方法检查结果的重现性稳定性是否符合要求。适用性是否理想。

6 验证机构组成

6.1验证委员会根据验证工作需要，常设验证委员会，负责所有验证工作的领导和组织，负责审批验证方案和验证报告、发放验证证书。验证委员会针对每一个具体验证项目成立专门的验证小组，负责该验证项目的验证方案起草，实施、组织与协调，负责验证结果记录与评定，负责完成验证报告。 6.2验证委员会组成: 姓名部门及职务验证委员会中职务验证工作中职责

6.4职责:

6.4.1 验证委员会:

6.4.1.1 负责验证方案的审批。

6.4.1.2 负责验证的总协调工作，以保证本验证方案顺利实施。 6.4.1.3 负责验证数据及结果的审核。

6.4.1.4 负责发放验证证书。

6.4.2 验证小组:

6.4.2.1 负责验证方案的制定和实施。

6.4.2.2 负责验证工作的组织与协调。

6.4.2.3 负责验证数据的收集和结果评定。

6.4.2.4 负责完成验证报告。

7文件准备和培训

7.1所需文件已准备齐全。

7.2培训:在确认实施前，依据验证小组通过的方案，对参加验证人员培训，明确分工。

培训记录:

培训内容日期培训人接受培训人注射用水细菌内毒素检查方法验证方案8验证进度计划

8.1验证小组提出完整的验证计划，经验证委员会批准后实施，整个验证活动分以下几个阶段完成。

: 从年月日至年月日 ; 培训

注射用水细菌内毒素检查方法验证 :从年月日至年月日 ; 9验证依据参考文献

培训内容日期培训人接受培训人注射用水细菌内毒素检查方法验证方案9.1根据2010版药典附录细菌内毒素检查方法、附录XVIII A 中药质量标准分析方法验证指导原则验证方案的编写、实施、结果的评价。

10验证内容:

10.1试药与试剂:

号试剂/试药品名批号/规格备注

试剂

细菌内毒素工作标

准品

细菌内毒素检查用

水

确认结果是否达到标准:

检查人: 确认人:

时间: 时间:

10.2 仪器设备:

10.2.1 精密仪器及需校验的仪器

序号仪器设备品名编号/型号校验时间有效期电子天平

电热干燥箱

恒温水浴箱

水银温度计

旋涡混合器确认结果是否达到标准 ?是 ?否

检查人: 确认人:

时间: 时间:

10.2.2一般工器具

序号仪器设备品名编号/型号备注

移液管

凝集管

三角瓶

试管

试管架

洗耳球

时钟

75%酒精棉

剪刀

砂轮确认结果是否达到标准 ?是 ?否

检查人: 确认人:

时间: 时间:

10.3注射用水内毒素检查方法验证

10.3.1 实验准备:试验室及人员等条件均满足内毒素试验试验条件。

10.3.1.1. 玻璃器皿的洗涤将玻璃器皿放入铬酸洗液或其他热原灭活剂或清洗液中充分浸泡，然后取出将洗液空干，用自来水将残留洗液彻底洗净，再用蒸馏水反复冲洗三遍以上，空干后放入适宜的密闭金属容器中或用锡箔纸包好后再放入金属容器内，放置入烤箱。 10.3.1.2. 除去玻璃器皿表面可能存在的外源性内毒素玻璃器皿置烤箱后，将烤箱调至250?，待烤箱温度升至设定的温度后开始计时，干烤至少1 小时。达到规定时间后，关断电源，待烤箱温度自然降至室温。在不打开金属容器的情况下，可在两天内使用;如果玻璃器皿用锡箔纸包装，在不打开包装的情况下可在两周内使用，否则须再次干烤除去可能存在的外源性内毒素。

10.3.2验证内容具体验证步骤

10.3.2.1. 鲎试剂灵敏度复核方法验证，同一操作方法操作符合三次，记录结果看结果是否稳定重复性是否良好。

10.3.2.2. 实验操作

10.3.2.2.1.细菌内毒素标准溶液的制备取细菌内毒素工作标准品一支，轻弹瓶壁，使粉末落入瓶底，然后用砂轮在瓶颈上部轻轻划痕，75%酒精棉球擦拭后启开，启开过程中应防止玻璃屑落入瓶内。按照标准品说明书，加入规定量的细菌内毒素检查用水溶解其内容物，用封口膜将瓶口封严，置旋涡混合器上混合15分钟。然后进行稀释，制备成4个浓度的细菌内毒素标准溶液，即2λ、λ、

0.5λ、0.25λ(λ为所复核的鲎试对的标示灵敏度)，每稀释一步均应在旋涡混合器上混合30 秒钟。

10.3.2.2.2.待复核鲎试剂的准备取规格为0.1ml/ 支的鲎试剂18支，轻弹瓶壁，使粉末落入

酒精棉球擦拭后启开备用，防止玻璃屑落入瓶内。每支加瓶底，用砂轮在瓶颈轻轻划痕，75%

入0.1ml 检查用水溶解，轻轻转动瓶壁，使内容物充分溶解，避免产生气泡。

10.3.2.2.3.加样将已充分溶解的待复核鲎试剂18支(管)放在试管架上，排成5列，其中4列4支(管)，1列2支(管)。4 支(管)4 列每列每支分别加入0.1ml 的2λ、λ、0.5λ、和0.25λ的内毒素标准溶液;另2支(管)加入0.1ml检查用水(阴性对照)。 10.3.2.2.4.加样结束后，将鲎试剂用封口膜封口，轻轻振动混匀，避免产生气泡，连同试管架放入37??1?水浴或适宜恒温器中，试管架保持水平状态，保温60?2 分钟。 10.3.2.2.5. 观察并记录结果。将试管架从水浴中轻轻取出，避免振动，将每管拿出缓缓倒转180?观察，管内形成凝胶，并且凝胶不变形，不从管壁滑脱者为阳性，记录为(+);未形成凝胶或凝胶不能保持完整并从管壁滑脱者为阴性，记录为(,)。(备注:保温和拿取试管的过程中应避免受到振荡造成假阴性结果)

10.3.2.3. 实验结果计算如最大浓度2λ4管均为阳性，最低浓度0.25λ4管均为阴性，阴性对照为阴性时实验为有效，按下式计算反应终点浓度的几何平均值即为鲎试剂灵敏度的复核结果(λc)。

λc = lg -1 (?X/4) 式中x为反应终点浓度的对数值(lg)。反应终点浓度是系列递减的内毒素标准溶液中最后一个呈阳性结果的浓度。

10.3.2.4结果判断

10.3.2.4.1判断标准当λc在0.5λ,2λ(包括0.5λ和2λ)时判定该批鲎试剂灵敏度复核合格，可用于干扰实验和供试品细菌内毒素检查，并以λ(标示灵敏度)为该批鲎试剂的灵敏度。

10.3.2.5鲎试剂灵敏度复合试验验证结果如下表:

第一次验证结果如下表:第一次

检验目的检验日期

检验依据室温

试剂名称: 生产单位批号灵敏度/效价规格鲎试剂 EU/ml

细菌内毒素标准品 EU/支细菌内毒素检查用水反应结果保温时间( —— ) 内毒素浓度 EU/ml(稀释序号倍数) 2λ 1

2

3

4

λ 1

2

3

4

0.5λ 1

2

3

4

0.25λ 1

2

3

4

阴性对1

照 2 结果计算λc = lg-1 (?X/4)=

结果判断当λc在0.5λ,2λ(包括0.5λ和2λ)时判定该批鲎试剂灵敏度复

核合格，可用于干扰实验和供试品细菌内毒素检查同时可以进入下一

步验证

检验人员: 复合人员:

日期日期

确认结果是否符合要是? 否 ? 求

检查人: 确认人:

日期: 日期:

检验目的检验日期检验依据室温试剂名称: 生产单位批号灵敏度/效价规格

鲎试剂 EU/ml

细菌内毒素标准品 EU/支细菌内毒素检查用水反应结果保温时间( —— ) 内毒素浓度 EU/ml(稀释序号倍数) 2λ 1

2

3

4

λ 1

2

3

4

0.5λ 1

2

3

4

0.25λ 1

2

3

4

阴性对1

照 2 结果计算λc = lg-1 (?X/4)=

结果判断当λc在0.5λ,2λ(包括0.5λ和2λ)时判定该批鲎试剂灵敏度复

核合格，可用于干扰实验和供试品细菌内毒素检查同时可以进入下一

步验证

检验人员: 复合人员:

日期日期

确认结果是否符合要是? 否 ? 求

检查人: 确认人:

日期: 日期:

验证结果如下表:第三次

检验目的检验日期

检验依据室温试剂名称: 生产单位批号灵敏度/效价规格鲎试剂 EU/ml 细菌内毒素标准品 EU/支细菌内毒素检查用水反应结果保温时间( —— ) 内毒素浓度 EU/ml(稀释序号倍数) 2λ 1

2

3

4

λ 1

2

3

4

0.5λ 1

2

3

4

0.25λ 1

2

3

4

阴性对1

照 2 结果计算λc = lg-1 (?X/4)=

结果判断当λc在0.5λ,2λ(包括0.5λ和2λ)时判定该批鲎试剂灵敏度复

核合格，可用于干扰实验和供试品细菌内毒素检查同时可以进入下一

步验证

检验人员: 复合人员:

日期日期

确认结果是否符合要是? 否 ?

求

检查人: 确认人:

日期: 日期:

10.3.2.5.1鲎试剂灵敏度复合试验三次验证试验结果评价如下表:

验证试验结果一次二次三次结果计算λc = λc = λc= 结论

确认结果是否符合要求:是? 否 ?

检查人; 确认人:

日期: 日期

10.3.3干扰试验预实验:同法操作检查三次试验记录试验结果进行对比。目的:初步确定供试品的最大不干扰浓度或最小稀释倍数为正式干扰试验提供依据。是检验在某一浓度下的供试品对于鲎试剂与内毒素的反应有无干扰作用。使用的供试品溶液应为未检验出内毒素且不超过所使用的鲎试剂的最大有效稀释倍数的溶液。

10.3.3.1将内毒素检查阴性的供试品进行一系列倍数稀释，但最大的的稀释

倍数不得超过MVD=CL/λ(λ为现在市面最高灵敏度，这里选公司能买到的最高灵敏度) 10.3.3.2使用鲎试剂对每一稀释倍数进行检验。

每一稀释倍数下做2只供试品管和2只供试品阳性对照(即用该浓度的供试品稀释液将内毒素标准品制成2λ浓度)。另取2只加入细菌内毒素检查用水做为阴

性对照，2只加入2λ浓度的内毒素标准溶液作为阳性对照。供试品阳性对照溶液的制备举例制备稀释4倍的供试品阳性对照液方法，取0.3ml浓度为4.0λEU /ml 的内毒素标准溶液+0.3ml稀释倍数为2的供试品稀释液----制得0.6ml 含

2λEU/ml内毒素标准液的稀释倍数为4的供试品稀释液。保温(60min)?2min后观察，并记录结果。

10.3.3.3当阴性对照为阴性阳性对照为阳性时试验有效。

当系列浓度中出现供试品溶液2管为阴性，供试品阳性对照2管为阳性时。认为供试品在该浓度下不干扰试验，此稀释倍数即为最小不干扰倍数，即可选择该稀释倍数进行正式干扰试验。当系列浓度中所有浓度的供试品管都不为阴性，或供试品阳性对照管不为阳性时，说明该供试品对内毒素与鲎试剂的反应村子啊存在干扰，则应对供试品进行更大倍数的稀释(不得超过MVD，)或者通过其他方式排出干扰。为确保所选则的处理方法能不有效的排出干扰且不会是内毒素失去活性，要使用预先添加了标准内毒素在经过处理的供试品溶液进行干扰试验。当供试品的内毒素限值单位为,,,,,或,,,, 时。应将做小不干扰稀释倍数换算成最大不干浓度(即该稀释倍数下溶液的浓度)以,,,,,或,,,,表示。 10.3.3.,这里干扰试验预试验用注射用水来检查试验。注射用水限值为含内毒素量不得过0.125EU。按,,,,,,,λ计算出灵敏度为0.03EU/ml下的MVD值将供试品溶液稀释一系列进行检验，用灵敏度为0.25EU/ml的鲎试剂进行试验。试验结果如下表: 第一次稀释倍数原液倍倍倍观察供试品溶液

+或--

观察供试品阳性对照 +或--

第二次稀释倍数

观察供试品溶液 +或--

观察供试品阳性对照 +或--

观察供试品溶液 +或--

观察供试品阳性对照 +或--

结论

确认结果是否符合要求:是? 否 ?

检查人; 确认人:

日期: 日期

结论

确认结果是否符合要求:是? 否 ?

10.3.4干扰试验:目的是检验某一浓度下的供试品对于鲎试剂与内毒素的反应物干扰作用。试验重复三次。

10.3.4.1. 操作方法:

10.3.4.1.1.制备内毒素标准对照溶液取1支细菌内毒素标准品，用细菌内毒素检查用水稀释成4个浓度的标准溶液即2λ、λ、0.5λ、0.25λ(方法同

10.3.2.2.1)。 10.3.4.1.2制备含内毒素的供试品溶液:将供试品稀释至预实验中确定的不干扰稀释倍数，

λ、λ、0.5λ、再用此稀释液将10.3.3.1.1中的同支细菌内毒素标准品稀释成4个浓度即20.25λ的含内毒素的供试品溶液。这里以注射用水来进行试验

10.3.4.1.3鲎试剂的准备:取规格为0.1ml/支的鲎试剂36支，轻弹壁使粉末落入瓶底，用砂轮在瓶颈轻轻划痕，75%酒精棉球擦拭后启开备用，防止玻璃屑落入瓶内。每支加入0.1ml检查用水溶解，轻轻转动瓶壁，使内容物充分溶解，避免产生气泡。

10.3.4.1.4加样将准备好的鲎试剂取其中18支(管)放在试管架上，排成5列，4列4支(管)，1列2支(管)。其中的4支4列每列每支分别加入0.1ml的2.0λ、1.0λ、0.5λ、0.25λ的内毒素标准溶液，另一列2支(管)加入0.1ml检

查用水作为阴性对照。将另外18支(管)鲎试剂放在试管架上，排成5列，4列4支(管)，1列2支(管)。其中的4支4列每列每支分别加入0.1ml的含2.0λ、1.0λ、0.5λ、0.25λ的内毒素的供试品溶液，另一列2支(管)加入0.1ml供

试品溶液作为样品阴性对照。加样结束后，用封口膜封口，轻轻振动混匀，避免产生气泡，连同试管架放入37?1?水浴或适宜恒温器中，保温60?2分钟后，观察并记录结果。 10.3.4.2实验结果计算如两组最大浓度2.0λ均为阳性，最低浓度0.25λ均为阴性，阴性对照, 管均为阴性时，按下式计算用检查用水制成的内毒素标准溶液的反应终点浓度的几何平均值(Es)和用供试品溶液或稀释液制成的内毒素溶液的反应终点浓度的几何平均值(Et). Es= lg-1 (?Xs/4) Et= lg-1 (?Xt/4)

Xs、Xt分别为用检查用水和供试品溶液或稀释液制成的内毒素溶液的反应终点浓度的对数值(lg)。

10.3.4.3结果判断 10.3.4.3.1.判断标准当Es在0.5λ,2.0λ(包括0.5λ

和2.0λ)时，且Et在0.5 Es,2.0Es(包括0.5 Es和2.0Es)时，则认为供试品在该浓度下不干扰实验，可在该浓度下对此供试品进行细菌内毒素检查。当Et不在0.5 Es,2.0Es(包括0.5 Es和2.0Es)时，则认为供试品在该浓度下干扰实验。

10.3.4.3.2.判断结果:

10.3.4.4干扰试验验证结果如下表:

干扰试验验证结果第一次

检验目的检验日期

检验依据室温

试剂名称: 生产单位: 批号: 灵敏度/效规格

价

鲎试剂 EU/ml 细菌内毒 EU/支

素标准品

细菌内毒 EU/ml

素检查用

水

反应结果保温时间( , )

序号内毒素标结果阴性内毒素的结果阴性

准溶液打(—) 阳供试品溶打(—)阳

性打 (+) 液性打(+) 加入内毒2λ 1 素标准品2 浓度EU/ml3 与供试品4 内毒素溶λ 1 液(稀释倍2 数) 3

4

0.5λ 1

2

3

4

0.25λ 1

2

3

4

阴性对照 1

2

-1结果计算 Es= lg (?Xs/4)=

-1Et= lg (?Xt/4)=

结果判断当Es在0.5λ,2.0λ(包括0.5λ和2.0λ)时，且Et在0.5

Es,2.0Es(包括0.5 Es和2.0Es)

时，则认为供试品在该浓度下不干扰实验，可在该浓度下对此供试品进行细菌内毒素检查。

当Et不在0.5 Es,2.0Es(包括0.5 Es和2.0Es)时，则认为供试品在该浓度下干扰实验。检验人员: 复合人员:

日期日期

确认结果是否符合要求是? 否 ? 检查人; 确认人: 日期

日期:

干扰试验验证结果第二次

检验目的检验日期检验依据室温

试剂名称: 生产单位: 批号: 灵敏度/效规格

价鲎试剂 EU/ml 细菌内毒 EU/支素标准品

细菌内毒 EU/ml 素检查用

水

反应结果保温时间( , )

序号内毒素标结果阴性内毒素的结果阴性

准溶液打(—) 阳供试品溶打(—)阳

性打 (+) 液性打(+) 加入内毒2λ 1 素标准品2 浓度EU/ml3 与供试品4 内毒素溶λ 1 液(稀释倍2 数) 3

4

0.5λ 1

2

3

4

0.25λ 1

2

3

4

阴性对照 1

2

-1结果计算 Es= lg (?Xs/4)=

-1Et= lg (?Xt/4)=

结果判断当Es在0.5λ,2.0λ(包括0.5λ和2.0λ)时，且Et在0.5

Es,2.0Es(包括0.5 Es和2.0Es)

时，则认为供试品在该浓度下不干扰实验，可在该浓度下对此供试品进行细菌内毒素检查。

当Et不在0.5 Es,2.0Es(包括0.5 Es和2.0Es)时，则认为供试品在该浓度下干扰实验。检验人员: 复合人员:

日期日期

确认结果是否符合要求是? 否 ? 检查人; 确认人: 日期

日期:

干扰试验验证结果第三次

检验目的检验日期检验依据室温

试剂名称: 生产单位: 批号: 灵敏度/效规格

价

鲎试剂 EU/ml 细菌内毒 EU/支

素标准品

细菌内毒 EU/ml

素检查用

水

反应结果保温时间( , )

序号内毒素标结果阴性内毒素的结果阴性

准溶液打(—) 阳供试品溶打(—)阳

性打 (+) 液性打(+) 加入内毒2λ 1 素标准品2 浓度EU/ml3 与供试品4 内毒素溶λ 1 液(稀释倍2 数) 3

4

0.5λ 1

2

3

4

0.25λ 1

2

3

4

阴性对照 1

2

-1结果计算 Es= lg (?Xs/4)=

-1Et= lg (?Xt/4)=

结果判断当Es在0.5λ,2.0λ(包括0.5λ和2.0λ)时，且Et在0.5

Es,2.0Es(包括0.5 Es和2.0Es)

时，则认为供试品在该浓度下不干扰实验，可在该浓度下对此供试品进行细菌内毒素检查。

当Et不在0.5 Es,2.0Es(包括0.5 Es和2.0Es)时，则认为供试品在该浓度下干扰实验。检验人员: 复合人员:

日期日期

确认结果是否符合要求是? 否 ?

检查人; 确认人: 日期

日期:

(NC)，2支加入0.1ml供试品阳性对照溶液作为供试品阳性对照管(PPC)。10.3.4.5.4将试管中溶液轻轻混匀后，用封口膜封闭管口，垂直放入37??1?水浴或适宜恒温器中，保温60?2分钟。保温和取放试管过程应避免受到振动造成假阴性结果。 10.3.4.5.5结果判断

10.3.4.5.6判断标准当阳性对照都为阳性、供试品阳性对照都为阳性且阴性对照都为阴性时，实验有效。若供试品2管均为阴性，认为该供试品符合规定;如供试品2 管均为阳性，应认为不符合规定;如2 管中1管为阳性，1 管为阴性，按上述方法另取4支供试品管复试，4管中如有1管为阳性，即认为不符合规定。若第一次实验时供试品的稀释倍数小于MVD而结果出现2 管均为阳性或2管中1管为阳性时，按同样方法复试，复试时要求将其稀释至MVD。

10.3.4.5.7验证结果如下表:

第一次

供试品名称供试品阳性对照结果阳性对照 ( +) 阴性对照 ( +)

( +) ( -) ( -) ( -) 注射用水批号 1管 2管 1管 2管 1管 2管 ( ) 结果是否有效

结果判断每1ml 中含内毒素量不得过0.125EU，才符合规定检验人员: 复核人员:

日期日期

检查人; 确认人: 日期

日期:

第二次

供试品名称供试品阳性对照结果阳性对照 ( +) 阴性对照 ( +)

( +) ( -) ( -) ( -) 注射用水批号 1管 2管 1管 2管 1管 2管 ( ) 结果是否有效

结果判断每1ml 中含内毒素量不得过0.125EU，才符合规定检验人员: 复核人员:

日期日期

检查人; 确认人: 日期

日期:

第三次

供试品名称供试品阳性对照结果阳性对照 ( +) 阴性对照 ( +)

( +) ( -) ( -) ( -) 注射用水批号 1管 2管 1管 2管 1管 2管 ( ) 结果是否有效

结果判断每1ml 中含内毒素量不得过0.125EU，才符合规定检验人员: 复核人员:

日期日期

检查人; 确认人: 日期

日期:

11 偏差分析

序号偏差处理方法 1

2

3

偏差处理结果是否符合标准要求 ?是 ?否

检查人: 确认人:

时间: 时间:

12 验证结论

13 拟定再验证方案及验证周期:

1当检查方法发生较大变更需再验证;

2在日常监测中发现检查法异常，转移等需进行再验证;

3 当试验条件改变可能影响检查结果时应再验证。

4 再验证时应按照药典附录要求及本方案进行再验证, 或根据实际情况修订补充验证方案后进行再验证。

14验证结果完整性评价:

1验证小组负责对验证结果进行评审，对验证结果的评审见“验证结果完整性总评价记录”，其包括:

1.1 验证结果是否有遗漏?

1.2 验证实施过程中对验证方案有无修改,修改原因、依据、是否经过批准, 1.3 验证记录是否完整,

1.4验证结果是否符合标准要求?偏差及对偏差的说明是否合理?是否需要进一步补充试验? 15 会签

16 验证结果最终批准