华南师范大学实验报告

华南师范大学实验报告

学生姓名____罗婵_________ 学号________

专业___生物技术________年级、班级___07级7班_____

课程名称___生物化学实验____实验项目_蛋白质等电点测定和沉淀反应实验类型□验证□设计□综合实验时间_2008年_9 月_23日

实验指导老师__李德红______ 实验评分__________________

一、实验目的

了解蛋白质的两性解离性质；学习测定蛋白质等电点的一种方法；加深对蛋白质胶体溶液稳定因素的认识；了解沉淀蛋白质的几种方法及其实用意义。

二、实验原理

蛋白质是两性电解质，其解离状态和解离程度受溶液的酸碱度影响。当溶液的PH达到一定数值时，蛋白质颗粒上正负电荷的数目相等，在电场中既不向阴极移动，也不向阳极移动，此时溶液的PH值称为此种蛋白质的等电点。在等电点时，蛋白质的理化性质都有变化，可利用此种性质的变化测定各种蛋白质的等电点。最常用的方法是测其溶解度最低时的溶液PH值。

在水溶液中的蛋白质分子由于表面生成水化层和双电层而成为稳定的亲水胶体颗粒，在一定的理化因素影响下，蛋白质颗粒可因失去电荷和脱水而沉淀。蛋白质的沉淀反应可分为两类，可逆的沉淀反应和不可逆的沉淀反应。

三、实验步骤及结果

（一）酪蛋白等电点的测定

四、结果分析

（一）酪蛋白等电点的测定

结果如图：

④③②①

该实验通过测酪蛋白溶解度最低时的溶液PH值来测定其等电点。

蛋白质在等电点时，以两性离子的形式存在，其总净电荷为零，这样的蛋白质颗粒在溶液中因为没有相同电荷而互相排斥的影响，所以最不稳定，溶解度最小，极易借静电引力迅速结合成较大的聚集体，因而沉淀析出。

该实验结果如图所示，第3支试管中的溶液最为混浊，因此酪蛋白的等电点为第3支试管的PH值，即酪蛋白的PI=4.7

该实验应注意，蒸馏水的PH必须调到7，因为蒸馏水的PH值会影响所配置的溶液PH 的改变，可能会出现混浊度区分不明显的现象，从而影响等电点的测定。

（二）蛋白质的沉淀及变性

1、蛋白质的盐析

盐类在水中分解为正负离子，往蛋白质溶液中加入高浓度盐类可以破坏蛋白质胶体周围的水膜，同时又中和了蛋白质分子的电荷，因此使蛋白质产生沉淀，这种加盐使蛋白质沉淀析出的现象，叫盐析。

不同蛋白质盐析时所需的盐浓度不同，因此调节盐浓度，可使混合蛋白质中的几种蛋白质分段析出，这种方法称为分段盐析。

该实验就是利用分段盐析的方法，先在蛋白质溶液中加硫酸铵至50%饱和度，沉淀析出球蛋白，再继续加硫酸铵至饱和，沉淀析出清蛋白

由盐析获得的蛋白质沉淀，其蛋白质分子结构尚未发生显著变化，当降低其盐类浓度时，沉淀又能再溶解，并保持其天然性质而不变性，故蛋白质的盐析作用是可逆过程。

由此可见，盐析法是分离制备蛋白质的常用方法。

2、重金属离子沉淀蛋白质

该实验往沉淀中加水，沉淀不溶解。若静置一段时间，沉淀会变成棕褐色，这是因为银离子被氧化而产生颜色的改变。

重金属盐类易与蛋白质结合成稳定的沉淀而析出。蛋白质在水溶液中是酸碱两性电解质，在碱性溶液中(对蛋白质的等电点而言)，蛋白质分子带负电荷，能与带正电荷的金属离子结合成蛋白质盐。经过这种处理后的蛋白质沉淀不再溶解于水中，说明它已发生了变性。重金属盐类沉淀蛋白质的反应通常很完全，特别是在硷金属盐类存在时。因此，生化分析中，常用重金属盐除去体液中的蛋白质;临床上用蛋白质解除重金属盐的食物性中毒。

实验结果如图：

3、某些有机酸沉淀蛋白质

该实验往沉淀中加水，沉淀不溶解，静置一段时间后，沉淀沉于试管底部，有分层现象。

实验原理为：某些酸类能和蛋白质化合成不溶解的蛋白质盐而沉淀，沉淀的条件应当是pH小于等电点，这样蛋白质带正电荷易于与酸根负离子结合成盐。

实验结果如图：

4、有机溶剂沉淀蛋白质

本实验在加乙醇后沉淀不明显，是因为此时的溶液PH并不等于蛋白质的等电点PI，加乙醇只是破坏了蛋白质分子表面的水化层，效果不明显；加入NaCl溶液之后，中和了蛋白质分子表面的双电层，于是促进了沉淀的形成。

由本实验可知，可与水混合的有机溶剂，如酒精、甲醇、丙酮等，对水的亲和力很大，能破坏蛋白质颗粒的水化膜，在等电点时使蛋白质沉淀。在常温下，有机溶剂沉淀蛋白质往往引起变性。例如酒精消毒灭菌就是如此，但若在低温条件下，则变性进行较缓慢，可用于分离制备各种血浆蛋白质。

实验结果如图：

5、乙醇引起的变性与沉淀

该实验中三支试管的变化如图所示：

①②

④③

乙醇作为一种有机溶剂，在常温条件下会使蛋白质变性。

第一组现象中，只有试管1中的溶液有沉淀生成，因为试管1中加入了PH4.7的缓冲溶液，该PH值等于蛋白质的等电点PI，所以蛋白质表面总净电荷为零，不满足维持蛋白质溶液稳定的条件，沉淀析出。

第二组现象中，试管2中的甲基红遇碱变为黄色，试管3中的甲基红遇酸变为紫红色(甲基红的变色PH范围是4.2—6.3)。

第三组现象中，试管2、3中的溶液分别被醋酸溶液和碳酸钠溶液中和，同时使蛋白质分子表面的电荷被中和，其表面总静电荷为零，则沉淀析出，该沉淀为白色絮状沉淀。

第四组现象中，试管1中因为有缓冲液，其PH维持在4.7处不变，所以加盐酸时，由于其PH突然减小，刚开始有一段时间沉淀消失，溶液变澄清，但静置一段时间后，由于缓冲液的作用，PH又回到4.7，沉淀重新出现。试管2、3中，由于溶液酸性较大，使变性蛋白质的表面重新带上电荷，满足了维持溶液稳定的条件，所以沉淀消失。

由本实验可知，蛋白质变性后，有时由于维持溶液稳定的条件仍然存在（如电荷），并不析出。因此，变性蛋白质不一定都表现为沉淀，而沉淀的蛋白质也未必已变性。

五、思考题

1、什么是蛋白质的等电点？

蛋白质是两性电解质，其解离状态和解离程度受溶液的酸碱度影响。当溶液的PH达到一定数值时，蛋白质颗粒上正负电荷的数目相等，在电场中既不向阴极移动，也不向阳极移动，此时溶液的PH值称为此种蛋白质的等电点。

2、蛋白质溶液为什么在等电点时容易发生沉淀？

蛋白质在等电点时，以两性离子的形式存在，其总净电荷为零，这样的蛋白质颗粒在溶液中因为没有相同电荷而互相排斥的影响，所以最不稳定，溶解度最小，极易借静电引力迅速结合成较大的聚集体，因而容易发生沉淀。