新一代测序技术的发展和应用_田李
·特约综述·
2015, 31(11):1-8
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN
DNA 测序技术在生命科学的发展中起着越来越重要的作用。新一代测序技术是一种革命性的技术，它的出现使得科研人员能够以相对较少的经费获得以往望尘莫及的海量DNA 序列，从根本上改变了人们研究生命科学的方式
［1］
。现阶段，生命科学的研
究已经从以往研究单一基因转变为研究整个基因组，其中既包括了基础研究中的基因组、转录组和表观遗传，也涉及了应用研究中的医学诊断和农作物育种等［2］
。本文回顾了DNA 测序技术的演化，并论述了其在生命科学研究中的应用。
1 测序技术的发展
1.1 第一代测序技术
Sanger 等在20世纪70年代中期发明了DNA 末端终止法测序技术，他的发明第一次为人们开启了解读生命遗传密码的大门，Sanger 本人也因此获得了1980年诺贝尔化学奖［3］。DNA 末端终止法测序技术的基本原理是：通过在DNA 聚合酶、模板、放射性同位素标记的引物、dNTP 和ddNTP 的作用下发生延伸反应，由于ddNTP 的存在，会形成长度不一的DNA 延伸片段；然后采用平板凝胶电泳，用4
收稿日期：2015-04-10
基金项目：国家自然科学基金项目（31501588），中国博士后科学基金项目（2014T70621），山东省自然科学基金项目（ZR2013CQ018）作者简介：田李，博士，副教授，研究方向：植物病原真菌的致病机理及比较基因组学；E -mail ：tianlister@https://www.360docs.net/doc/7f14642790.html, 通讯作者：赵云峰，博士，教授，研究方向：细胞生物学；E -mail ：yfz667788@https://www.360docs.net/doc/7f14642790.html,
新一代测序技术的发展和应用
田李1?张颖2?赵云峰1
（1.曲阜师范大学生命科学学院，曲阜 273165；2. 山东水利职业学院，日照 276826）
摘 要： DNA 测序技术是人类探索生命秘密的重要研究手段。自第一代的Sanger 测序技术诞生以来，DNA 测序技术经历了三代变革，产生了第二代到第四代测序技术，统称为新一代测序技术。目前，新一代测序技术的数据产出能力呈指数增长，而且这一技术本身也从依赖DNA 聚合酶的生化反应转变为面向物理学中纳米技术的新领域。新一代测序对生命科学领域具有里程碑意义，引领了科学研究模式革新和研究思维的转变。科研人员可利用新一代测序技术对基因组、转录组和表观组等诸多领域展深入的研究。分析了新一代测序技术的特点，并对其未来的发展方向以及应用进行了展望。
关键词： 新一代DNA 测序；边合成边测序； 单分子测序；纳米孔；应用DOI ：10.13560/https://www.360docs.net/doc/7f14642790.html,ki.biotech.bull.1985.2015.11.003
The Next Generation Sequencing Technology and Its Applications
Tian Li 1 Zhang Ying 2 Zhao Yunfeng 1
（1. College of Life Science ，Qufu Normal University ，Qufu 273165；2. Shandong Water Polytechnic ，Rizhao 276826）
Abstract : DNA sequencing technology is an important research method in life science. Since the birth of the Sanger sequencing technology, DNA sequencing technology has experienced three generations of change, resulting the second generation to the fourth generation sequencing technology. DNA sequencing not only has been improving its productivity in an exponential growth rate but also been evolving into a new technological territories toward physical disciplines of nanotechnology. Next generation sequencing that has landmark significance of life sciences, can improve researches in the genome, transcriptome and epigenome. This review analyzes technical characteristics of the next generation sequencers and provide prospective insights into their future development and applications.
Key words : next generation sequencing; sequence by synthesis ；
single molecule sequencing ； nanopore ；applications 网络出版时间：2015-11-26 15:41:55
网络出版地址：https://www.360docs.net/doc/7f14642790.html,/kcms/detail/11.2396.Q.20151126.1541.001.html
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条电泳道来分离4个反应的所得产物，便可以按顺序读出相应的DNA序列。在那个年代，测序主要依靠手工操作，难以自动化，并且依赖电泳技术，试剂消耗也大，这些都极大限制了测序的通量。
其后在此技术原理的基础上产生了几次变革，主要技术上的变化有以下三点：（1）采用具有颜色的荧光染料取代了放射性同位素标记；（2）采用毛细管电泳技术取代了平板凝胶电泳技术；（3）并行化程度更高。这其中应用最广泛的是ABI公司的3730测序仪，它可以在一次运行中分析96个样本，读长最多可以超过1 000 bp。这一代测序技术在人类基因组计划的后期阶段起到了关键的作用，加速了人类基因组计划的完成［4］。但是，由于其对电泳分离技术的依赖，使其难以进一步提高分析的速度和通过微型化降低测序成本，因此在2005年后，除了在PCR 产物测序和病毒的基因组测序中继续发挥重要作用，其他均已较少采用。但由于其在原始数据质量（准确率高达99.999%）以及序列读长方面具有的优势，它还将与新的测序平台并存。
1.2 第二代测序技术
高通量测序技术进入市场，使DNA测序技术在2005年发生了重要转折，改变了测序的规模化进程。Illumina、Roche和ABI公司都推出了各自的新一代DNA测序仪，主要技术革新有以下几点：（1）采用矩阵分析技术，实现了大规模并行化，使得矩阵上的DNA；（2）不再采用电泳技术，使得DNA测序仪得以微型化，测序成本大大降低；（3）边合成边测序，测序速度大幅提高。与Sanger测序相比，第二代测序技术单次运行产出序列数据量大，所以又被通称为高通量测序技术。其技术原理是：首先构建DNA模板文库，将DNA固定在芯片表面或微球表面；然后通过扩增形成DNA簇或扩增微球；最后利用聚合酶或者连接酶进行一系列循环的反应操作，通过CCD相机采集每个循环反应中产生的光学事件信息，从而获得DNA 片段的序列。
1.2.1 Illumina Genome Analyzer Illumina公司于2007年以6亿美元收购基因测序公司Solexa，推出了成熟商业产品 Genome Analyzer［5］。该技术利用单链DNA两端的非对称接头将DNA片段固定在芯片表面形成寡核苷酸桥，并将该芯片放置于流通池内，完成DNA模板文库构建步骤。经过多个PCR循环扩增出大量的复制产物，每一簇复制产物都分别固定在芯片表面的特定位置上。然后，测序引物杂交到扩增产物中的接头上，开始合成测序反应。在每一轮的测序循环中，DNA聚合酶和标记不同荧光基团的4 种核苷酸被同时加入到流通池中，按照碱基互补配对的原则延伸一个核苷酸。此时采集荧光基团所发出的荧光图像，就可以获得模板中这一位置的DNA序列信息。为防止额外的延伸，每个核苷酸的3'羟基是被封闭起来的，然后打开3'端，继续进行下一轮反应并重复多次，以获得约50个碱基的DNA序列。
1.2.2 Roche 454 Genome Sequencer 该技术将固化引物的微球与单链DNA相结合，构建DNA模板文库［6］。调整微球与文库片段的比例，以保证大多数微球只能结合1个单链DNA分子。油与水溶液混合形成油包水结构乳滴，利用微乳滴PCR来生成扩增产物。经过多轮循环，每个微球表面都结合了大量相同的DNA片段。富集微球并转移到带有规则微孔阵列的微孔板上，每个微孔只能容纳1个微球。微孔板的其中一面可以进行测序反应，另一面则与CCD光学检测系统相接触。
序列测定同样采用边合成边测序［7］。三磷酸核苷结合到DNA链上会释放出焦磷酸，此时通过荧光素酶和ATP硫酰化酶产生级联反应会释放出光信号。454利用该光学信号来进行检测。具体方法是顺次向微孔板中加入4种dNTP 中的一种，监测每个微孔之中是否释放出光信号，表明该dNTP 是否连接到DNA片段上，以此明确DNA模板上的互补碱基。
1.2.3 Life Technologies SOLiD System 与454 类似，SOLiD也采用微乳滴PCR 的方法扩增DNA模板［8］，并将扩增微球固定在玻璃基板上形成高通量的阵列。SOLiD采用连接反应进行边合成边测序。将通用引物与连在微球上的DNA文库模板杂交，然后进行一系列的连接反应。每个连接反应都发生在DNA延伸链和带有荧光标记的单链八核苷酸探针池中的某一探针之间。八核苷酸探针的碱基与特定的荧光颜色有明确的对应关系。经过一系列复杂的连接，酶切
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和下一引物结合的反应循环后，获取荧光图象，即可根据碱基与荧光之间的对应关系读出DNA序列 信息。
第二代技术是目前市场上主流的DNA测序技术，已经广泛地应用于各项研究领域中。较第一代测序技术而言，测量通量明显提高。第二代测序技术极大地推进了基因组相关研究的进展，以前让研究者望尘莫及的基因组测序工作，现在几乎每一个实验室都可以开展。但是其不足之处也日益凸显。首先，第二代测序读长较短［9］。这一缺点对后续的序列拼接，组装以及注释等生物信息学分析带来了很大困难。SOLiD 测序仪和Illumina公司的测序仪读取的单一序列长度一般介于75-100 bp，Roche 公司的454测序仪可以达到700 bp 的读长，相应的其通量仅仅为0.7 Gb，因此其成本偏高。其次，第二代测序技术原理是建立在PCR的基础上，但是扩增后得到的DNA分子片段的数目和扩增前DNA分子片段的数目比例有相对偏差，在分析基因表达方面存在较大的弊端［10］。因此序列读长较短和需要模板扩增步骤，成为第二代测序技术最集中的弊端所在。这样就需要开发出不经过扩增的单分子测序、读长超过以往的新型测序技术，第三代测序技术便应运而生。
1.3 第三代测序技术
第三代测序技术的技术标志就是单分子测序和
及其与生命科学的融合。第三代测序技术通过在单一DNA分子组成的阵列上进行合成测序。在一个表面积限定的介质上使用单个分子，可以增加独立分析的DNA片段的数量，也意味着不再进行昂贵的DNA扩增步骤了，因此，可以使数据产出量更高，并且将进一步降低测序的成本。但同时该技术也带来了一些新的挑战，主要集中在单分子水平光学信号的检测方面。主要的问题是要降低没有参与到实际化学反应中的游离荧光分子的背景干扰。解决原则主要是将检测局限在测序反应发生的实际位置附近。下面以在商业化中应用较好的Pacific Biosciences公司的单分子实时测序仪SMRT加以 阐述［11，12］。
SMRT单分子实时测序仪以SMRT芯片为载体进行测序反应。SMRT芯片是一种带有很多零模式波导孔的金属片，在该纳米孔的底部区域锚定有DNA聚合酶。由于零模式波导孔直径只有几十个纳米，其直径低于光的波长，所以光线无法透射。这样就创造了一个体积很小的检测空间。测序时，被打断成许多小的片段的基因组DNA分散到不同的零模式波导纳米孔中。当孔底部聚合反应发生时，不同荧光标记的dNTP会在小孔的荧光探测区域中被DNA聚合酶滞留数十毫秒，在这期间，荧光标记会在激光束的激发下发出相应的荧光，根据荧光的种类就可以判定该位置核苷酸的种类。
目前，SMRT技术的平均读长已经提升至3 000 bp左右，在这一点上远远优于二代测序技术，所以在序列拼接和需要跨越重复区域的DNA组装中有着极大优势。另外，读长的增加也使需要测序覆盖深度随之下降，进一步降低了测序的成本。但是因为是单分子测序，测序中产生的任何一个错误都会被真实地记录下来，这就造成了SMRT测序仪最致命的问题。具体来说，测序错误可能是会出现碱基的插入和缺失错误：碱基缺失错误是由于在某些时刻碱基掺入DNA链的速度过快，超过了相机最大的拍摄帧数；插入错误是由于在某些时刻DNA聚合酶随机的选择一些dNTP，但并未真正将这些dNTP掺入DNA链中。这些测序错误导致SMRT测序仪的准确性仅有85%，相比第二代测序技术至少99.5%的测序准确率，确实是很大的短板。但这些错误是随机的，并不会随着读长的增加而增加。未来随着测序试剂的优化以及每个纳米孔可获得的数据量的增加，测序错误会随着测序覆盖深度的增加逐渐被降低，相信单分子测序技术可以在不断的发展过程中克服其劣势［13］。
1.4 第四代测序技术
在上述第二代测序和第三代测序技术中，DNA 序列都是在荧光等发光物质的协助下，通过DNA聚合酶将不同的dNTP连接到DNA链上，读取此过程中释放出的不同光学信号而间接确定的。这些方法都需要昂贵的光学监测系统，并依赖DNA聚合酶读取碱基序列，这些项目都增加了测序的成本。因此
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开发出不使用生物化学试剂，直接读取DNA序列信息的新型测序方法是非常可取的，由此构成了第四代测序技术的主要思想。
第四代测序技术中的代表当属纳米孔测序，它不需要对DNA样品进行任何生物或化学方面的处理，而采用物理方法直接读出其碱基序列［14，15］。其基本原理可概括为：单个碱基通过纳米孔通道时，就会引起通道电学性质的变化，并且由于ATGC这4种不同的碱基存在电学性质差异，使得它们穿越纳米孔时所引起的电学参数的变化量也不同。因此，不同的电学参数变化量就对应通过纳米孔的相应碱基。由此可见，第四代测序技术特点是完全抛弃了在复杂的DNA聚合酶的生化反应中进行DNA序列的读取，而是利用不同碱基的电学性质差异，通过纳米孔等直接对碱基穿过电极时的电流变化进行测量实现的。从目前的情况来看，研究人员已经在纳米孔的制造和DNA分子的控制上取得了一定的进展，但是目前第四代测序技术所取得的成果还都处在实验室阶段并且存在着其局限性，但是最近的研究工作表明未来新一代的DNA测序平台可能将在其中产生［16］。
1.5 测序技术的发展趋势
回顾上述四代测序平台的技术的发展，可以看出，生物化学技术和固态技术的融合推动了DNA测序技术的进步。现阶段，技术的融合有从生物化学手段向物理手段发展的趋势［17］，相信这一趋势将继续持续下去。下一代DNA测序技术将可能不再使用生物化学的方法，而物理手段纳米技术将有可能发挥更大的作用。未来基于纳米孔的DNA测序技术，当线性DNA通过纳米孔时，核苷酸序列就会被确定下来。这样可以同时实现长读长和高通量。理论上一个纳米孔结构单次测序读长可能仅仅受到线状DNA链的长度限制；而表面积很小的芯片上也可以容纳不计其数的纳米孔。因此，预计新一代的测序技术在具有超高通量的同时，其读长也将轻易超过以长读长闻名的第一代测序技术。
2 新一代测序技术的应用
2.1 基因组从头测序
基因组从头测序是在没有任何现有的DNA序列
资料的情况下，直接对某个物种的基因组进行测序。第一代测序技术在1990年启动的人类基因组计划和多种模式生物，如拟南芥（Arabidopsis thaliana）［18］、线虫（Caenorhabditis elegans）［19］和小鼠（Mus mus-culus）［20］全基因组测序中起了重要的作用。但是，测序速度慢、成本高和通量低的第一代测序技术远远不能满足人们对大量生物基因组解析的需求，因此第二代测序技术出现后，人们开始选择使用新一代测序技术进行全基因组从头测序。熊猫（Ailurop-oda melanoleura）基因组［21］的从头测序是第一次完全采用第二代测序技术完成的大型物种的全基因组从头测序，标志着第二代测序技术和拼接组装技术登上了基因组从头测序的历史舞台。2011年以来，第二代测序技术快速发展。伴随着测序所需的成本的降低和测序时间的缩短，采用第二代测序技术从头测序的全基因组犹如雨后春笋般出现，基因组学研究也迎来了革命性突破。不过第二代测序技术测序读长短，这就要求必须有足够的覆盖度才能完成基因组序列的拼接。第三代测序技术具有读长长的特点，在基因组测序中能降低测序后contig的数量，大大减少了后续的基因组组装的工作量，节省大量的测序成本和时间。科学家仅仅用0.5×的第三代测序平台的测序数据结合38×的第二代测序的数据，就完成了马达加斯加指猴基因组序列的组装［22］。现阶段，三代测序技术均有其优势与局限性。因此从根本上说，要完成特定物种的基因组从头测序，必须进行合理评估以选择合适的测序平台。
2.2 基因组重测序
基因组重测序是针对已知基因组序列的物种而言，重新测序的对象是该物种具有不同性状的其他个体。通过基因组重测序并进行差异信息分析，人们能够快速的进行很多有意义的研究，具有重大的科研价值和产业价值。具体来说主要有以下几点：（1）在群体水平研究物种的进化历史和对环境的适应性。对种内具有不同表型的个体进行基因组重测序，可以在全基因组水平上找到群体内个体间的DNA差异，包括大量的SNPs和结构变异（structure variations，SVs）等变异信息，而这些差异可能与这些个体的表型差异存在关联性，从而明确基因组是
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如何进化以使物种适应不同环境等问题。Lam等［23］对14株栽培大豆和17株野生大豆进行了全基因组重测序，通过比较分析，鉴定出了栽培大豆中获得以及丢失的18万多个遗传变异位点，且栽培大豆相对于野生大豆有着更低水平的遗传多样性，这可能与人类的选择有关。（2）基因组重测序可以在全基因组水平扫描出与动植物重要性状相关的变异位点，是育种研究中迅速有效的新方法。Zheng 等［24］采用基因组重测序技术，对950份世界范围内的水稻栽培种进行了遗传分析，鉴定出18个与粒重和开花期相关联的候选基因，为水稻的进一步遗传育种提供了理论基础。（3）遗传突变、适应进化和表型筛选是创造出带有优良性状突变体的有力工具，基因组重测序技术有利于突变位点的定位和鉴定。Ashelford等［25］对一个拟南芥突变体的回交系进行基因组重测序，成功鉴定出在 AtNFXL-2基因中引起该突变表型的SNP位点。
2.3 转录组测序
转录组测序（RNA-seq）是从总RNA 中富集出单链mRNA 经反转录得到双链cDNA，而后对其进行高通量测序分析。第二代测序技术发展后，RNA-seq在新基因发现、可变剪切位点识别、基因表达和小RNA测序及其靶标mRNA的识别上都有重要应用。而第三代测序技术拥有实时测序的特点，可以直接对RNA进行测序，免除了将RNA转变成DNA 的过程，更加促进了RNA-seq
作出阐述。
2.3.1 mRNA测序 Chen等［26］采用RNA-seq对飞蝗（Brugia malayi）的转录组进行了测序，对获得的21.5 Gb的序列进行了拼接，共得到7万多转录本，由此鉴定出11 490 个蝗虫蛋白的编码基因，从基因组范围内全面解析了飞蝗的核心基因集。Li 等［27］使用RNA-seq分析了玉米叶片的转录组，得到约120 Mb的转录组数据，结合玉米基因组序列，预测了基因的结构和可变剪接事件。结果显示，大部分玉米基因存在不同的mRNA可变剪接事件，这表明可变剪接事件比预期的更常见。这些数据为研究远比预期复杂的玉米转录调节机制提供了广泛的依据。
2.3.2 基因表达分析 随着测序技术的进步，科学家们越来越多的采用数字基因表达谱（digital gene expression，DGE）技术进行基因差异表达分析。该技术的基本原理是将mRNAs反转录成cDNAs，然后将cDNAs进行双酶切，使得一条mRNA对应一个相应的短DNA标签，而后采用高通量测序和分析流程，经过生物信息分析比较不同样本间各种标签条数，找出差异的表达标签，从而明确差异基因表达。
Wang等［28］利用数字基因表达谱技术分析了野生型棉花和它的突变体基因表达情况发现，在野生型和突变体之间，磷酸酶基因、纤维素合成酶基因和脱氢酶基因表达差异水平最大，而上述基因都参与了棉纤维细胞的发育过程，从而证实了在纤维早期发育中基因转录调控的高度复杂性。Hao等［29］首先对红豆杉通过RNA-seq技术对其转录组进行了从头测序组装，并基于生物信息学分析和同源蛋白的搜索，鉴定出2万多个红豆杉单一基因序列；然后使用数字基因表达谱技术分析了根、茎和叶3种组织中基因差异表达情况，鉴定出一批红豆杉组织特异性基因和紫杉烷生物合成途径的重要基因。
2.3.3 小RNA测序及其靶标mRNA的识别 Guo 等［30］采用高通量RNA-seq测序，分析了常规条件下和H2O2胁迫处理条件下的水稻幼苗的miRNAs组。通过生物信息学分析发现，有7个miRNAs家族在H2O2胁迫处理条件下呈现出明显的差异表达。这些miRNAs的靶基因参与了包括养分运输、转录调控、细胞增殖和细胞程序化凋亡不同的代谢过程和细胞周期调控，说明多样化的miRNAs形成了一个复杂的植物氧化应激反应的调控网络。除此之外，在水稻中还发现了32个尚未鉴定出的miRNAs，并且首次发现了一个前体位于植物外显子小RNA，说明植物也可以使用某些外显子作为miRNA的来源。
明确了全基因组范围内的miRNAs组后，鉴定miRNAs的靶标mRNAs可以对其生物学功能展开详细的研究。随着测序技术的发展，现在可以采用RNA-seq技术用于miRNAs的靶标mRNAs配对关系的发现，这一方法被称为降解组测序。其基本原理 是：在植物体内大多数的miRNAs剪切mRNA的位点是两者互补区域的第10位核苷酸，经剪切后靶mRNA产生了3'剪切片段和5'剪切片段；其中3'剪切片段含有5'单磷酸基团，可用于下游高通量测
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序；而含有帽子结构的5'剪切片段和含有5'帽子结构的尚未降解的mRNA缺少5'单磷酸基团，无法进入下游的高通量测序。因此，对3'端降解片段进行高通量测序并进行比较分析后，可以直观地发现在某个mRNA的某个位点上会出现一个波峰，该mRNA便是miRNAs的靶标mRNA，波峰位置便是候选的miRNA剪切位点。Zhou等［31］利用降解组测序在水稻中鉴定miRNAs 靶基因，发现了87个miRNAs的177个靶标mRNAs。这些靶标mRNAs在水稻的基因表达调控中发挥重要作用，构成了复杂的调节网络。
2.3.4 第三代测序技术与RNA测序 利用第三代测序平台，可以免除将RNA转变成cDNA的步骤，实现RNA的直接测序［32］。这是因为第三代测序平台为单分子测序平台，将DNA聚合酶换为反转录酶便可对RNA直接进行测序，利用该技术已成功对酿酒酵母的RNA进行了直接测序［33］。
2.4 新一代测序技术对表观遗传学的贡献
表观遗传学是研究在非基因序列改变前提下，DNA甲基化和组蛋白修饰等所导致的基因表达水平变化。而随着测序技术的发展，产生了表观基因组学，它是在基因组水平上对表观遗传学改变的研究。DNA甲基化修饰、组蛋白修饰是表观基因组学的重要研究内容。
2.4.1 DNA甲基化修饰 亚硫酸氢盐可以使DNA
的胞嘧啶则可以保持不变。利用上述原理，对亚硫酸氢盐处理过的基因组测序并且与未经处理的序列相比较，就可以得到全基因组范围内单碱基分辨率水平的甲基化图谱，这就是全基因组甲基化测序 技术。
Xiang 等［34］利用全基因组甲基化测序技术，对家蚕的2个个体进行了测序，得到了家蚕丝腺的甲基化图谱，共找出17万个甲基化位点，其中绝大部分位于GC岛，0.11%的胞嘧啶发生了甲基化修饰。在这些甲基化位点中，基因内部的甲基化占了很大一部分；而在基因启动区域、rDNA 区域和转座元件区域甲基化程度很低。说明在高等生物中发挥重要调控作用的启动子区甲基化、核糖体rDNA甲基化
和转座子区的甲基化未在昆虫中进化出来，家蚕甲基化谱的成功绘制为解析昆虫类的表观遗传调控提供了重要资料。
第三代测序技术对DNA聚合酶的工作状态进行了实时监测，聚合酶每合成一个碱基都要消耗一个时间段，而当DNA模板的碱基带有甲基化等修饰时，聚合酶的速度就会慢下来。通过这一原理就可以判断DNA模板的这个位置是否存在甲基化修饰，为表观遗传学研究开辟了一条新路［35］。
2.4.2 组蛋白修饰 染色质免疫共沉淀（Chromatin immunoprecipitaion，ChIP）是研究体内DNA与蛋白相互作用的一种方法，开始往往用在解析转录因子在基因组范围内的结合位点上。近年来，将该技术与新一代测序技术相结合后产生了染色质免疫共沉淀-测序（ChIP-seq）技术，在表观遗传学中发挥了重要作用。先通过ChIP富集与特定组蛋白修饰相结合的DNA片段，然后进入高通量测序流程，最后将获得的所有DNA序列标签定位到基因组上，从而获得不同修饰的组蛋白在全基因组范围内的DNA结合区段信息。Wang等［36］采用ChIP-seq 技术，对玉米幼苗的4种组蛋白修饰（H3K4me3、H3K27me3、H3K36me3和H3K9ac）进行了详尽的研究，表明其中3种组蛋白修饰（H3K4me3、H3K9ac和H3K36me3）正调控基因表达；而组蛋白修饰H3K27me3负调控基因表达。
3 小结
DNA测序技术的发展已经成为生物学领域最前沿的领域之一。从测序技术上来看，已经商业化的前三代测序技术由于之间功能上的互补性，它们将长期共存；而第四代测序技术指明了未来测序技术的发展方向。 从应用方面来看，快速而廉价的DNA 测序能力将使基因组学成为研究生物学问题的常规方法，引领我们开辟一系列新的研究领域。
参 考 文 献
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（责任编辑李楠）
纳米孔测序是极具前景的下一代测序技术
纳米孔测序是极具前景的下一代测序技术 Nanopore Sequencing 2019 - Patent Landscape Analysis 随着各种技术的新产品推出，哪些公司将在知识产权方面引领纳米孔测序？ 纳米孔测序是极具前景的下一代测序技术 据麦姆斯咨询介绍，纳米孔测序是新一代测序（NGS）技术之一，被认为能够彻底革新DNA分析。随着时间地推移，目前已经开发出了不同形式的纳米孔测序技术，包括蛋白质纳米孔、固态纳米孔和复合纳米孔。该技术可以高速生成超长读数，减少样品制备时间以及将读数重组成原始序列所需要的数据处理时间。 这项新技术可以开发一个需要遗传指纹来快速识别癌症类型和病原体的全新客户群。根据DataBridge的数据，全球下一代测序市场将快速增长，市场规模预计将从2017年的48.3亿美元增长到2024年的163.5亿美元，2018~2024年期间的复合年增长率（CAGR）预计为19.2%。 目前，Oxford Nanopore Technologies是唯一一家将基于纳米孔的测序仪推向市场的公司。不过，还有其它几家公司正在开发自己的相关技术，Oxford Nanopore Technologies公司可能很快将不再是纳米孔测序仪的唯一供应商。例如，Two Pore Guys公司宣布将在2019年春季发布其产品套件。 随着新产品在未来的相继推出，了解纳米孔测序市场相关参与者的知识产权（IP）状况和策略，同时发现专利新申请人及其所带来的威胁至关重要。为此，著名市场研究机构Yole 子公司Knowmade深入调研了基于纳米孔的测序技术（蛋白质、固态和复合）及其应用（肿瘤学、植物遗传学等）中涉及的知识产权主要参与者。本报告可以帮助读者发现业务风险和机遇，预测新兴应用，支持战略决策以加强市场地位。 纳米孔测序全球专利申请趋势 对专利申请趋势的分析表明，从2008年到2013年，纳米孔测序相关的专利申请获得了重要增长。这一增长源自于学术研究团队（哈佛大学和加州大学）对纳米孔测序概念的验证。
新一代测序技术的发展及应用前景
２０１０年第１０期杨晓玲等：新一代测序技术的发展及应用前景 等交叉学科的迅猛发展。 １．１第二代测序——高通量低成本齐头并进以高通量低成本为主要特征的第二代测序，不再需要大肠杆菌进行体内扩增，而是直接通过聚合酶或者连接酶进行体外合成测序¨】。根据其原理又可分为两类：聚合酶合成测序和连接酶合成测序。１．１．１聚合酶合成测序法Ｒｏｃｈｅ公司推出的４５４技术开辟了高通量测序的先河。该技术通量可达Ｓａｎｇｃｒ测序的几百倍，而成本却只有几十分之一，因此一经推出，便受到了国际上基因组学专家的广泛关注。４５４采用焦磷酸合成测序法ＨＪ，避免了传统测序进行荧光标记以及跑胶等繁琐步骤，同时利用乳胶系统对ＤＮＡ分子进行扩增，实现了大规模并行测序。截止到２０１０年４月，已有７００多篇文献是采用了４５４测序技术（ｈｔｔｐ：／／４５４．ｃｏｍ／ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ．ａｎｄ—ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ／ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ．ａｓｐ），对该技术是一个极大的肯定。 Ｉｌｌｕｍｉｎａ公司推出的Ｓｏｌｅｘａ遗传分析仪是合成技术的进一步发展与延伸。该技术借助高密度的ＤＮＡ单分子阵列，使得测序成本和效率均有了较大改善。同时Ｓｏｌｅｘａ公司提出的可逆终止子”１也是该技术获得认可的原因之一。与４５４相比。Ｓｏｌｅｘａ拥有更高的通量，更低的成本。虽然片段长度较短仍是主要的技术瓶颈，但是对于已有基因组的物种来说，Ｓｏｌｅｘａ理所当然成为第二代测序技术的首选。２００８年以来，利用该技术开展的研究大幅度上升，报道文献达４００多篇（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｌｌｕｍｉｎａ．ｃｏｍ／ｓｙｓｔｅｍｓ／ｇｅｎｏｍｅ—ａｎａｌｙｚｅｒ＿ｉｉｘ．ｉｌｍｎ）ｏ １．１．２连接酶合成测序法２００７年ＡＢＩ公司在Ｃｈｕｒｃｈ小组拍１研究成果的基础上推出了ＳＯＬＩＤ测序仪。该技术的创新之处在于双碱基编码…的应用，即每个碱基被阅读两次，因此大大减少了测序带来的错误率，同时可以方便的区分ＳＮＰ和测序错误。在测序过程中，仪器自动加入４种荧光标记的寡核苷酸探针，探针与引物发生连接反应，通过激发末端的荧光标记识别结合上的碱基类型。目前ＳＯＬＩＤ３．０测序通量可达２０Ｇ，而测序片段仅有３５—５０ｂｐ，这使得该技术与Ｓｏｌｅｘａ相比，应用范围还不够广泛。ＡＢＩ公司正加快研发进度，争取在片段长度方面做出重大突破。 ＤａｎａｈｅｒＭｏｔｉｏｎ公司推出Ｐｏｌｏｎａｔｏｒ¨１测序仪同样也是基于Ｃｈｕｒｃｈ小组的研究成果，但是该设备的成本要低很多，同时用户在使用时可以根据自己的研究目的设置不同的测序条件。而ＣｏｍｐｌｅｔｅＧｅ—ｎｏｍｉｃｓ公司推出的ＤＮＡ纳米阵列与组合探针锚定连接测序法＂１则具有更高的容错能力，试剂的消耗也进一步减少，目前已顺利完成３个个体基因组的测序工作。 １．２第三代测序——单分子长片段有望实现第二代测序技术虽然在各方面都有了较大的突破，但是仍然建立在ＰＣＲ扩增的基础上。为了避免ＰＣＲ扩增带来的偏差，科学家目前正在研制对ＤＮＡ单个分子直接测序的第三代测序仪。最具代表性的包括Ｈｅｌｉｓｃｏｐｅ单分子测序仪，单分子实时合成测序法，纳米孔测序技术等。 Ｈｅｌｉｃｏｓ技术仍然是基于合成测序原理¨…，它采用了一种新的荧光类似物和灵敏的监测系统，能够直接记录到单个碱基的荧光，从而克服了其他方法须同时测数千个相同基因片段以增加信号亮度的缺陷。ＰａｃｉｆｉｃＢｉｏｓｃｉｅｎｅｅｓ公司研发的单分子实时合成测序法充分利用了ＤＮＡ聚合酶的特性，可以形象的描述为通过显微镜实时观测ＤＮＡ聚合酶，并记录ＤＮＡ合成的整个过程。纳米孔测序技术［１１’１２１则是利用不同碱基在通过纳米小孔时引起的静电感应稍有不同，或者不同碱基通过小孔的能力各有差异，来加以区分不同的碱基信号。 ２应用与实践 Ｋａｈｖｅｊｉａｎ在２００８年的一篇综述中提到¨“：“如果你可以随心所欲地测序，你会开展哪些研究？”。人类基因组计划的完成和近年来高通量测序的兴起，使越来越多的科研工作者认识到，我们对于生物界的认识才刚刚起步。基因图谱的绘制并不意味着所有遗传密码的破解，癌症基因组的开展也没有解决所有的医学难题。ＤＮＡ变异的模式和进化机制，基因调控网络的结构和相互作用方式，复杂性状及疾病的分子遗传基础等，仍是困扰生物学家和医学家的难题，而高通量测序的广泛应用，也许可以让我们知道的更多。 ２．１ＤＮＡ水平的应用 ２．１．１全基因组测序新一代测序技术极大地推
DNA测序技术的发展和其最新进展
DNA测序技术的发展及其最新进展 摘要：自从诺贝尔奖得主桑格于1977年发明了第一代DN测序技术以来，DNA测序技术已经作为重要的实验技术广泛的应用于现代生物学研究当中。经过了几十年的发展，DNA测序技术日臻成熟，并且以单分子测序为特点的第三代测序技术也已经诞生。本文主要就每一代测序技术原理和特点及其最新进展做简要介绍。 关键词：DNA测序技术；第三代DNA测序技术；最新进展 The Development and New Progress of DNA Sequencing Technology Abstract: Since Nobel Prize Winner Sanger have founded the first generation of DNA Sequence technology in 1977, DNA sequencing technology has been widely used in modern biological researches as an important experimental. Over decades of year’s development, DNA sequence technology mature gradually and the third generation sequencing technologies characterized by single-molecule sequencing have also emerged. The mechanisms and features of each generation of sequencing technology and their latest progress will be discussed here. Key Words: DNA Sequence technology ; third generation DNA sequencing ;latest development 1.引言 DNA测序技术是分子生物学研究中最常用的技术,它的出现极大地推动了生物学的发展。自从1953年Watson和Crick发现DNA双螺旋结构后[1]，人类就开始了对DNA序列的探索，在世界各地掀起了DNA测序技术的热潮。1977年Maxam和Gilbert报道了通过化学降解测定DNA序列的方法[2]。同一时期,Sanger发明了双脱氧链终止法[3]。20世纪90年代初出现的荧光自动测序技术将DNA测序带入自动化测序的时代。这些技术统称为第一代DNA测序技术。最近几年发展起来的第二代DNA测序技术则使得DNA测序进入了高通量、低成本的时代。目前,基于单分子读取技术的第三代测序技术已经出现,该技术测定DNA序列更快,并有望进一步降低测序成本,推进相关领域生物学研究。本文主要介绍DNA测序技术的发展历史及不同发展阶段各种主要测序技术的特点，并针对目前新一代DNA测序技术及目前国际DNA测序最新进展做简要综述。
几种常见的基因测序技术的优缺点及应用复习过程
几种常见的基因测序技术的优缺点及应用
随着人类基因组计划的完成，人类对自身遗传信息的了解和掌握有了前所未有的进步。与此同时，分子水平的基因检测技术平台不断发展和完善，使得基因检测技术得到了迅猛发展，基因检测效率不断提高。从最初第一代以 Sanger 测序为代表的直接检测技术和以连锁分析为代表的间接测序技术，到 2005 年，以 Illumina 公司的 Solexa技术和 ABI 公司的 SOLiD 技术为标志的新一代测序(next-generation sequencing，NGS) 的相继出现，测序效率明显提升，时间明显缩短，费用明显降低，基因检测手段有了革命性的变化。其技术正向着大规模、工业化的方向发展，极大地提高了基因检测的检出率，并扩展了疾病在基因水平的研究范围。2009 年 3 月，约翰霍普金斯大学的研究人员在《Science》杂志上发表了通过 NGS外显子测序技术，发现了一个新的遗传性胰腺癌的致病基因PALB2，标志着 NGS 测序技术成功应用于致病基因的鉴定研究。同年，《Nature》发表了采用 NGS 技术发现罕见弗里曼谢尔登综合征MYH3 致病基因突变和《Nat Genet》发表了遗传疾病米勒综合征致病基因。此后，通过 NGS 技术，与遗传相关的致病基因不断被发现，NGS 技术已成为里程碑式的进步。2010 年，《Science》杂志将这一技术评选为当年“十大科学进展”。 近两年，基因检测成为临床诊断和科学研究的热点，得到了突飞猛进和日新月异的发展，越来越多的临床和科研成果不断涌现出来。同时，基因检测已经从单一的遗传疾病专业范畴扩展到复杂疾病和个体化应用更加广阔的领域，其临床检测范围包括高危疾病的新生儿筛查、遗传疾病的诊断和基因携带的检测以及基因药物检测用于指导个体化用药剂量、选择和药物反应等诸多方面的研究。目前，基因检测在临床诊断和医学研究的应用正越来越受到医生的普遍重视和引起研究人员的极大的兴趣。 本文介绍了几种 DNA 水平基因检测常见的方法，比较其优缺点和在临床诊断和科学研究中的应用，对指导研究生和临床医生课外学习，推进临床科研工作和提升科研教学水平有着指导意义。 1、第一代测序 1.1 Sanger 测序采用的是直接测序法。1977年，Frederick Sanger 等发明了双脱氧链末端终止法，这一技术随后成为最为常用的基因测序技术。2001 年，Allan Maxam 和 Walter Gibert 发明了 Sanger 测序法，并在此后的 10 年里成为基因检测的金标准。其基本原理即双脱氧核苷三磷酸(dideoxyribonucleoside triphosphate，ddNTP) 缺乏PCR 延伸所需的 3'-OH，因此每当 DNA 链加入分子 ddNTP，延伸便终止。每一次 DNA 测序是由 4个独立的反应组成，将模板、引物和 4 种含有不
新一代测序法简介
新一代测序法简介 新一代测序方法是一种直接测序法，它既可以分析基因和DNA的组成(定性分析)，也可以测定同一类型基因在表达过程中产生的数量（定量分析），以及不同类型基因或DNA 之间的差别所在（交叉对比分析）。自2004年，454测序技术发展以来，已经出现的测序产品超过六种之多。这些产品的技术特点见下表： 产家名称产品技术特点优缺点 化学反应测序方法误读率样品准备高通量程度 Roche (454 Life Science) 焦磷酸标记的链 反应 焦磷酸基 标记 <1% 较复杂，需PCR 中等 Illumina（Solexa）四色可逆终止码合成法1%—3% 较复杂，需PCR 中—高ABI(SOLID) 双色可逆终止码合成法1%—5% 较复杂，需PCR 中—高Helicos Bioscience 单色可逆终止码合成法2%—8% 简单，无需PCR 高—超高Intelligent Biosystm 四色可逆终止码合成法1%—5% 较复杂，需PCR 中—高 Pacific Bioscience 四色焦磷酸基标 记焦磷酸基 标记 3%—8% 简单，无需PCR 高 VisiGen 焦磷酸基标记 FRET 焦磷酸基 标记 3%—8% 简单，无需PCR 高 在这些技术中，从所分析的样本在测序前是否需要扩增，大致可以分为两类，即克隆扩增型和单分子测序型。两种类型在测序技术上区别并不大，但对结果的影响却有不小的差别。主要体现在两个方面：（1）单分子测序更能反应细胞或组织内分子的真实情况，尤其是在需要定量分析的情况下。而克隆扩增型中的PCR反应使得样品中DNA分子的扩增机会并不完全均等，这会对基因表达的定量分析造成影响；（2）单分子测序具有通量更高的优势。克隆扩增使得同一类型的分子数目急剧上升，在提高同类型分在在固相表面出现的几率同时，也降低了不同类型分子出现的机会。 面重点介绍Pacific Biosciences公司推出的Single Molecule Real Time (SMRT?) DNA Sequencing（单分子实时DNA测序）。 首先，在这一测序技术中有主要有两个关键的技术： 一、荧光标记的脱氧核苷酸避免了碱基的空间位阻效应。显微镜现在也无法实现实时看到“单分子”，但是它可以实时记录荧光的强度变化。当荧光标记的脱氧核苷酸被掺入DNA 链的时候，它的荧光就同时能在DNA链上探测到。当它与DNA链形成化学键的时候，它的荧光基团就被DNA聚合酶切除，荧光消失。这种荧光标记的脱氧核苷酸不会影响DNA聚合酶的活性，并且在荧光被切除之后，合成的DNA链和天然的DNA链完全一样； 二、纳米微孔（Zero-mode waveguide (ZMW)）。因为在显微镜实时记录DNA链上的荧光的时候，DNA链周围的众多的荧光标记的脱氧核苷酸形成了非常强大的荧光背景，这种强大的荧光背景使单分子的荧光探测成为不可能。Pacific Biosciences公司发明了一种直径只有10nm的纳米孔，单分子的DNA聚合酶被固定在这个孔内。在这么小的孔内，DNA链周围的荧光标记的脱氧核苷酸有限，而且由于A，T，C，G这四种荧光标记的脱氧核苷酸非常快速地从外面进入到孔内又出去，它们形成了非常稳定的背景荧光信号。而当某一种荧光标记的脱氧核苷酸被掺入到DNA链时，这种特定颜色的荧光会持续一小段时间，直到新的化学
下一代测序技术
下一代测序技术 摘要：DNA测序技术对生物学的发展有着最根本的意义。Sanger法测序经过了30年的应用和发展，而在过去三年中，以454, solexa, SOLiD为代表的高通量测序平台已经大幅度降低了测序成本，提高了测序速度，成为基因组测序市场的主流。在此基础上，各种下一代测序技术正在快速研发，将使基因组测序和重测序的通量和成本更加平民化，为基因组学、遗传学、生物医学和健康科学等领域的发展创造更加广阔的前景。本文将对所有新的测序技术的原理、优势和应用进行总结和展望。 1977年Maxim、Gilbert发明的化学降解法测序技术和Sanger发明的双脱氧末端终止法测序技术不仅为他们赢得了诺贝尔奖，也使得从DNA序列层面研究分子遗传学成为可能。特别是后者，从最开始的凝胶电泳到越来越高通量的毛细管电泳，从开始的手工操作到越来越多自动测序仪的出现，各种改进的Sanger 测序技术统治了DNA测序领域三十年，至今仍在长片段测序，大片段文库测序方面有广泛的应用。人类基因组计划（HGP）的完成就是靠Sanger测序法。 在耗费了庞大成本的人类基因组计划宣布完成之后，越来越多的物种基因组测序工作对测序成本和通量提出了更高的要求，新一代测序技术（也被称为第二代测序技术）开始登上历史舞台。2005年454 life science公司率先推出了焦磷酸测序技术，使测序成本较Sanger法降低了100倍，速度快了（提高）100倍，人类基因组测序逐步进入了100，000美元时代。如今，454 FLX测序仪（Roche Applied Science）、基于“边合成边测序”的Solexa测序仪(Illumina Inc.)和使用“边连接边测序”的SOLiD测序仪(Applied Biosystems)已经成为基因组测序市场的主流机型。除此之外，2008年一年内又有HeliScope单分子测序仪（Helicos）和Polonator(Dover/Harvard)两种测序机型商品化。 在NHGRI（美国人类基因组研究中心）的支持和推动下，未来几年内测序成本将在目前基础上再下降100倍，最终使个人基因组测序成本降至1000美元，人类将革命性的进入个人基因组时代。高通量和低成本的测序技术将进入到普通实验室，基因组测序的简单化将使分子生物学飞跃发展，个人基因组测序产业化也将对健康医学等领域产生革命性的影响。本文将首先对目前已经商品化的新一代测序技术（454、Solexa、SOLiD、HeliScope）做一介绍和比较，再对正在研发中的各种下一代测序方法（第三代测序技术）的原理和应用做一详细的介绍和展望。 1. Roche 454测序技术 2005年454生命科学公司在《自然》杂志发表论文，介绍了一种区别于传统Sanger法的全新高通量测序方法，将测序成本降低了100倍以上，开创了第二代测序技术的先河，454测序仪也成为最先商品化的第二代测序仪。正是在此基础上，其它如Solexa、SOLiD等第二代测序仪才相继问世。454测序技术的原理在于首先使用乳液PCR（emulsion PCR）技术（图一a）扩增已经连接上接头的基因组文库片段，扩增子结合在28 μm的磁珠表面，将乳液破坏后用变性剂处理磁珠，再将含有扩增子的磁珠富集到芯片表面，用测序引物进行测序。在测序过程中，454使用了一种“焦磷酸测序技术”（Pyrosequencing），即在合成DNA 互补链的过程中，每加入一种单核苷酸（dNTP），如与模板链配对结合，就会释放出一个焦磷酸，与底物腺苷-5’-磷酸硫酸（APS）在A TP硫酸化酶作用下合成A TP，与荧光素（Luciferin）一起在荧光素酶(Luciferase)的作用下，会发出一个光信号，由芯片背后连接的电荷耦合装置（CCD，Charge Coupled Device）捕捉。454测序技术合成DNA链使用的是普通单核苷酸，没有任何标记，合成中也没有切割基团等生化反应，因此读长可以达到300-400bp。但没有阻断（block）和去阻断（de-block）过程也意味着对连续重复单核苷酸的阅读只能根据信号强度来判断，容易对其中插入和缺失碱基阅读错误。454测序技术相比较其他第二代测序技术如Solexa和SOLiD, 在读长上有着巨大的优势，但是目前成本要略高。总体而言，高读长使得454技术比较利于De Novo拼接和测序。
NGS在临床中的应用
高通量测序在临床分子诊断中的应用与展望 对于单基因遗传病，以往临床实验室主要借助于Sanger测序、等位基因特异性聚合酶链反应（allele-specific polymerase chain reaction，AS-PCR）、荧光原位杂交、DNA印记杂交等技术进行检验。NGS技术针对癌症、心血管疾病、肾病、糖尿病等复杂性疾病的遗传学筛查与诊断提供了便捷的途径。另外，NGS技术在病原微生物的快速鉴定、药物的靶向治疗以及产前筛查等多个领域具有潜在的应用优势。 1 测序技术的发展及性能比较 2006年，Illumina公司推出了Solexa测序平台。目前，该公司已经推出了多种型号的测序平台，如MiSeq、HiSeq、NextSeq等系列，其中MiSeq系列适合于小型基因组测序，HiSeq系列适用于大型基因组测序。2007年，美国应用生物系统公司推出SOLiD测序平台。该平台采用五轮测序法以4色荧光标记寡核苷酸的连接合成为基础，测序准确性得以提高。2010年，美国生命科学公司和太平洋生物科学公司分别发布了半导体测序平台和第3代单分子实时（single molecule realtime，SMRT）DNA测序平台。这2种测序技术与以往的基于光学信号的检测技术不同，半导体测序平台通过半导体芯片直接感应在序列合成过程中磷酸二酯键3'OH基团释放的质子；第3代测序仪通过纳米孔技术记录单个聚合酶在不受干扰情况下连续合成，其中PacBio RS II每次运行能够产生60 000×16条序列，每条序列的平均长度达8 500 bp。 一般来说，以上每种测序仪在序列读段长度、准确性、测序通量、价格等多个方面存在一定的差异。焦磷酸测序平台测序读段较长，测序通量较低，成本相对较高；Illumina系列平台产生的读段相对较短，测序费用相对较低，应用比较广泛；SOLiD测序平台在通量和准确性方面相对以上2种类型的测序平台有明显改善，但是测序长度更短；半导体测序平台以及SMRT测序平台相比其他测序平台运行时间较短，另外单分子测序平台减少了测序前的扩增准备工作，测序读段较长，但是测序成本和错误率都相对较高[8-10]。一些常用的测序仪的测序原理和性能见表1。
DNA测序技术发展简史
DNA测序技术发展简史 摘要：本文回顾了1965年一来DNA测序技术的发展，重点介绍了双脱氧链终止测序法及Maxam-Gillbert DNA化学降解法的出现，以及其他的一些相关技术的发展，以简练清晰的脉络梳理了DNA测序技术的发展史。 关键词：DNA测序；双脱氧链终止测序法；Maxam-Gillbert DNA化学降解法 l953年，Watson和Crick提出DNA双螺旋结构模型以后，人们就开始探索研究DNA 一级结构的方法。1965年，美国Cornell大学以Rober Holley为首的科学家小组，第一次完成了长度为75个核苦酸的酵母丙氨酸tRNA的全序列测定并将结果发表在Science杂志上。其办法是利用各种RNA酶把tRNA降解成寡核苷酸，经分离纯化之后，再分别测定这些寡核苷酸短片段的核苷酸顺序掀开了DNA测序技术研究的序幕[1]。但那时由于没有找到分别降解四种脱氧核糖核酸的专一酶，只能通过测定RNA 的序列来推测DNA的序列，即先将RNA用酸水解或外切酶降解，再经双向电泳同系层析将其分开（小片段重叠法）。 1971年，华裔分子生物学家吴瑞博士（Dr．Ray Wu）在1968年独创性地设计了一种崭新的引物-延伸测序策略，发展出了测定DNA核苷酸序列的第一个方法，提高了DNA序列分析的速度，并于1971年首次成功地测定了λ噬菌体两个粘性末端的完整序列[2]。 l977年，英国剑桥大学分子生物学实验室的Fred Sanger领导的研究小组在吴瑞博士的基础上分别在Nature和PNAS发表文章，提出DNA聚合酶的双脱氧链终止原理测定核苷酸序列的方法，Sanger作为世界上第一个解决DNA测序的科学家，再一次荣获诺贝尔奖（1980年）[3]。DNA双脱氧链终止测序法，也称酶法或末端终止法，是利用2’,3’-双脱氧三磷酸核苷(2’,3’-ddNTP或简称ddNTP)来终止DNA的复制反应。ddNTP可以在DNA聚合酶作用下通过其5’-磷酸基团掺入到正在增长的DNA链中，但由于ddNTP在脱氧核糖的3’位置缺少一个羟基，它们不能同后续的dNTP形成磷酸二酯键（由M．R．Atkinson等人于1969年发现），从而中断延伸反应。该法将待测DNA样品分成四组，在每组DNA合成反应混合物的四种普通dNTP中加入少量的一种ddNTP，这样一来，链延伸将与偶然发生但却十分特异的链终止展开竞争，最终得到反应一系列的核苷酸链，其长度取决于从用以起始DNA合成的引物末端到出现过早链终止的位置之间的距离，由于这四组独立的酶反应中分别采用四种不同的ddNTP，将产生四组分别终止于模板链的每一个A、G、C或T的位置上的寡核苷酸，使用变性测序凝胶电泳分析这四组反应的产物，即可从放射自显影片上直接读出DNA的序列[4]。 而美国哈佛的Alan Maxam和Walter Gilbert领导的研究小组也几乎同时发明出DNA序列测定方法——Maxam-Gillbert DNA化学降解法测序，其基本原理是用特异的化学试剂修饰DNA分子中的不同碱基，然后用哌啶切断反应碱基的多核苷酸链。该法设计四组特异的反应：①G反应，用硫酸二甲酯使鸟嘌呤上的N7甲基化，加热引起甲基化鸟嘌呤脱落，导致多核苷酸链可在该处断裂；②G+A反应，用甲酸使A和G嘌呤环上的N原子质子化，从而使其糖苷键变得不稳定，再用哌啶使键断裂；③T+C反应，用肼使T和C的嘧啶环断裂，再用哌啶除去碱基；④C反应，在有盐存在时，只有C与肼反应，并被哌啶除去。这样一来，同一个末端标记的DNA片段在四组互相独立的化学反应中分别得到部分降解，每一组反应特异地针对某一种或某一类碱基，生成四组放射性标记的分子，从共同起点（放射性标记末端）延续到发生化学降解的位点，每组混合物中均含有长短不一的DNA分子，其长度取决于该组反应所针对的碱基在原DNA全片段上的位置。最后，通过聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分离此后组产物，再从放射自显影片上即可读出序列[5]。
下一代测序工作流程自动化
下一代测序（NGS）彻底改变了基因组学研究领域，使全基因组测序比以往任何时候都更有效率。然而，典型的NGS工作流程是鲜有革新的，因为它面临许多手动操作步骤和来自成本、通量以及结果变异性的诸多挑战。传统的样品制备和数据分析方法非常耗时，并更易出错。 针对这些挑战，自动化技术为此提供了相应的解决方案，并通过减少样品间变异提高了最终数据的精准度。然而，为您的NGS工作流程选择适合的自动化设备是一个复杂的过程。为了给您的实验室配备最佳的自动化整合系统，首先要对以下的四个因素进行评估，然后再作出决定： ? 自动化将如何影响您的实验流程？ ? 您可选的自动化方案有哪些？ ? 需要多少培训？ ? 您的自动化解决方案是否需要扩展，以满足未来的需求？
Ilumina文库构建杂交选择和靶向捕获簇扩增和测序Ilumina文库构建杂交选择和靶向捕获簇扩增和测序
图3，高通量PCR纯化自动化工作流程 您是否在纯化时使用真空泵和离心过滤？图3描述了一个中高通 进一步加速：靶标富集技术 量的自动化工作流程图。 基于磁珠技术的靶标富集方法，比如SureSelect靶标富集 试剂盒和SureSelect人全外显子试剂盒，能使您仅对感兴 趣的基因片段测序，提高了几个数量级的实验效率。这些操 作很容易实现和高度扩展，凸显出Bravo自动化液体处理 平台的速度和精度的优势。
如果您的实验室需要更高的通量，您可考虑增加一个更全面的自动化系统。安捷伦BenchCel 微孔板工作站是一个灵活的、可扩展的、通量可媲美大型系统的紧凑桌面式平台。由市面上最灵活和调度高效的安捷伦VWorks 软件控制，BenchCel 工作站可用于复杂的和简单的应用流程，比起传统的手动操作方法能提供更长的无人值守时间和更大的通量。 对于超高通量、高生产率的实验室，您可能需要放弃桌面型系统。安捷伦独立的BioCel 自动化系统基于一个易于定位的直驱机械臂(DDR)。这种高度灵活的系统能与安捷伦其它自动化模块，或第三方设备组合形成定制系统，以满足您实验室的需要。 自动化方案的选择 想一想您实验室的整个工作流程。有各种不同的自动化解决方案——从垂直移液工作站到BenchCel 工作站再到BioCel 系统，可以满足不同的通量需求。自动化将提高实验数据的准确性和一致性——您是否需要一个完全无人值守的自动化解决方案？安捷伦拥有一系列的自动化设备可供选择，以适应不同实验室的需要。安捷伦的Bravo 自动液体处理平台具有宽量程的高精度移液性能、兼容不同类型微孔板的灵活性以及独特的开放式设计，易于整合到其他的自动化工作流程中。结合Bravo 自动化液体处理平台可以大大减少样品制备和检查下一代测序文库质量所花费的时间，并通过减少样本间变异提高了数据质量。 图4. 桌面型选择： A ．Bravo 自动化液体处理平台 B ．BenchCel 微孔板操作工作站独立的高通量系统：C. BioCel 系统 A B C
几种常见的基因测序技术的优缺点及应用
几种常见的基因测序技术的优缺点及应用 发布时间:2014-07-19 来源:毕业论文网 随着人类基因组计划的完成，人类对自身遗传信息的了解和掌握有了前所未有的进步。与此同时，分子水平的基因检测技术平台不断发展和完善，使得基因检测技术得到了迅猛发展，基因检测效率不断提高。从最初第一代以Sanger 测序为代表的直接检测技术和以连锁分析为代表的间接测序技术，到2005 年，以Illumina 公司的Solexa技术和ABI 公司的SOLiD 技术为标志的新一代测序(next-generation sequencing，NGS) 的相继出现，测序效率明显提升，时间明显缩短，费用明显降低，基因检测手段有了革命性的变化。其技术正向着大规模、工业化的方向发展，极大地提高了基因检测的检出率，并扩展了疾病在基因水平的研究范围。2009 年 3 月，约翰霍普金斯大学的研究人员在《Science》杂志上发表了通过NGS外显子测序技术，发现了一个新的遗传性胰腺癌的致病基因PALB2，标志着NGS 测序技术成功应用于致病基因的鉴定研究。同年，《Nature》发表了采用NGS 技术发现罕见弗里曼谢尔登综合征MYH3 致病基因突变和《Nat Genet》发表了遗传疾病米勒综合征致病基因。此后，通过NGS 技术，与遗传相关的致病基因不断被发现，NGS 技术已成为里程碑式的进步。2010 年，《Science》杂志将这一技术评选为当年“十大科学进展”。 近两年，基因检测成为临床诊断和科学研究的热点，得到了突飞猛进和日新月异的发展，越来越多的临床和科研成果不断涌现出来。同时，基因检测已经从单一的遗传疾病专业范畴扩展到复杂疾病和个体化应用更加广阔的领域，其临床检测范围包括高危疾病的新生儿筛查、遗传疾病的诊断和基因携带的检测以及基因药物检测用于指导个体化用药剂量、选择和药物反应等诸多方面的研究。目前，基因检测在临床诊断和医学研究的应用正越来越受到医生的普遍重视和引起研究人员的极大的兴趣。 本文介绍了几种DNA 水平基因检测常见的方法，比较其优缺点和在临床诊断和科学研究中的应用，对指导研究生和临床医生课外学习，推进临床科研工作和提升科研教学水平有着指导意义。 1、第一代测序 1.1 Sanger 测序采用的是直接测序法。1977年，Frederick Sanger 等发明了双脱氧链末端终止法，这一技术随后成为最为常用的基因测序技术。2001 年，Allan Maxam 和Walter Gibert 发明了Sanger 测序法，并在此后的10 年里成为基因检测的金标准。其基本原理即双脱氧核苷三磷酸(dideoxyribonucleoside triphosphate，ddNTP) 缺乏PCR 延伸所需的 3'-OH，因此每当DNA 链加入分子ddNTP，延伸便终止。每一次DNA 测序是由4个独立的反应组成，将模板、引物和 4 种含有不同的放射性同位素标记的核苷酸的ddNTP 分别与DNA 聚合酶混合形成长短不一的片段，大量起始点相同、终止点不同的DNA 片段存在于反应体系中，具有单个碱基差别的DNA 序列可以被聚丙烯酰胺变性凝胶电泳分离出来，得到放射性同位素自显影条带。依据电泳条带读取DNA 双链的碱基序列。 人类基因组的测序正是基于该技术完成的。Sanger 测序这种直接测序方法具有高度的准确性和简单、快捷等特点。目前，依然对于一些临床上小样本遗传疾病基因的鉴定具有很高的实用价值。例如，临床上采用Sanger 直接测序FGFR 2 基因证实单基因Apert 综合征和直接测序TCOF1 基因可以检出多达90% 的与Treacher Collins 综合征相关的突变。值得注意的是，Sanger 测序是针对已知致病基因的突变位点设计引物，进行PCR 直接扩增测序。
下一代DNA测序技术研究进展综述
深度DNA测序技术在基因组测序中的研究策略和进展 摘要：回顾了经典DNA测序技术原理，重点阐述了深度测序技术在基因组测序中的研究策略，并结合目前比较常见的二代测序仪来分析比较相互之间的特点和优势，最后，对即将到来的三代测序法的研究进展给予了简单的介绍。 关键词：深度DNA测序基因组测序仪 DNA测序技术的发展过程漫长而艰辛，然而，我们现在获取的大部分DNA序列信息还是依靠基于Sanger在1977年建立的“DNA双脱氧链末端终止测序法”的DNA测序技术获得的。另外就是Maxam和Gilbert建立的“化学降解测序法”。在过去的七年当中，DNA测序技术的发展至少受到来自四个方面的影响：首先是人类基因组计划的出现，这项计划的实施过程中，科学家们面临了巨大的经费问题，因为传统的Sanger测序法无论怎么优化，都无法大幅度降低测序的成本，这很大程度促进了人们对在测序过程中如何降低成本的技术方面的研究。第二，人类以及其他主要模式生物参考序列数据库的建立使得短片段阅读（short-read）成为可能,这极大的促进了短片段测序技术的发展。第三，新型分子生物学技术的不断涌现导致了越来越多的诸如RNA表达染色体构象等生物现象的出现，这就需要有高通量DNA测序手段去解释这些问题，这也极大的促进了新型测序技术的发展。第四，其他学科领域的技术的发展，例如计算机技术，数据存储及分析技术，聚合酶工程技术等，极大地支持了DNA测序技术的应用。本文主要是对目前新一代DNA测序（也叫深度测序）技术（Next-generation DNA sequencing technologies）的研究策略及目前国际DNA测序最新进展做一简要的综述。 1.Sanger测序法 先来回顾一下经典的DNA测序法，从上世纪九十年代早期开始，几乎所有的DNA测序都是利用半自动化的毛细管电泳Sanger测序技术完成的（图1-a）。后来出现了高通量测序法，这种方法首先要对DNA预处理，获取大量的待测序模板即质粒或PCR产物。然后在测序一种发生测序生化反应，这个过程会产生大量长短不一（因为终止位点不一样），末端被荧光标记的延伸产物。再用分辨率高的毛细管凝胶电泳分离这些延伸产物，通过对延伸产物末端四种不同荧光颜色的区分，利用计算机软件自动“读
三代测序原理技术比较
导读从1977年第一代DNA测序技术（Sanger法）1，发展至今三十多年时间，测序技术已取得了相当大的发展，从第一代到第三代乃至第四代，测序读长从长到短，再从短到长。 摘要：从1977年第一代DNA测序技术（Sanger法）1，发展至今三十多年时间，测序 技术已取得了相当大的发展，从第一代到第三代乃至第四代，测序读长从长到短，再从短到长。虽然就当前形势看来第二代短读长测序技术在全球测序市场上仍然占有着绝对的优势位置，但第三和第四代测序技术也已在这一两年的时间中快速发展着。测序技术的每一次变革，也都对基因组研究，疾病医疗研究，药物研发，育种等领域产生巨大的推动作用。在这里我主要对当前的测序技术以及它们的测序原理做一个简单的小结。 图1：测序技术的发展历程 生命体遗传信息的快速获得对于生命科学的研究有着十分重要的意义。以上（图1）所描述的是自沃森和克里克在1953年建立DNA双螺旋结构以来，整个测序技术的发展历程。 第一代测序技术 第一代DNA测序技术用的是1975年由桑格（Sanger）和考尔森（Coulson）开创的链终止法或者是1976-1977年由马克西姆（Maxam）和吉尔伯特（Gilbert）发明的化学法（链降解）. 并在1977年，桑格测定了第一个基因组序列，是噬菌体X174的，全长5375个碱基1。自此，人类获得了窥探生命遗传差异本质的能力，并以此为开端步入基因组学时代。研究人员在Sanger法的多年实践之中不断对其进行改进。在2001年，完成的首个人类基因组图谱就是以改进了的Sanger法为其测序基础，Sanger法核心原理是：由于ddNTP的2’和3’都不含羟基，其在DNA的合成过程中不能形成磷酸二酯键，因此可以用来中断DNA 合成反应，在4个DNA合成反应体系中分别加入一定比例带有放射性同位素标记的ddNTP（分为：ddATP,ddCTP,ddGTP和ddTTP），通过凝胶电泳和放射自显影后可以根据电泳带的位置确定待测分子的DNA序列（图2）。这个网址为 sanger测序法制作了一个小短片，形象而生动。 值得注意的是，就在测序技术起步发展的这一时期中，除了Sanger法之外还出现了一些其他的测序技术，如焦磷酸测序法、链接酶法等。其中，焦磷酸测序法是后来Roche公司454技术所使用的测序方法2–4，而连接酶测序法是后来ABI公司SOLID技术使用的测序方法2,4，但他们的共同核心手段都是利用了Sanger1中的可中断DNA合成反应的dNTP。
下一代测序技术的内容概览
下一代测序技术的内容概览 高通量DNA测序技术（下一代测序技术NGS）在过去的15年里已经有了快速的发展，新的方法也在继续实现商业化。随着技术的发展，对基础和应用科学中的相关应用范围也在增加。这篇综述的目的是提供一个对NGS方法论的概述以及相关的应用。每个简要的讨论之后都跟有制造商和基于网页的可视化。关键词搜索，例如用Google，可能也会提供有帮助的网页链接和信息。 方法的建立 DNA测序方法的建立是Sanger双脱氧合成法以及Maxam-Gilbert的化学裂解法。Maxam-Gilbert化学裂解法是基于DNA的化学修饰然后在邻近修饰过的核苷酸附件的位点进一步裂解DNA骨架。Sanger测序采用了特殊的链终止核苷酸（双脱氧核苷酸），它缺少一个 3‘OH连接位点。因此，不能够在DNA聚合酶的作用下合成磷酸二酯键，结果是正在伸长的DNA链在该位置终止了。双脱氧核苷酸是具有放射性的或者具有荧光标记的，便于分别在测序凝胶或者自动测序仪器上识别。尽管原始的Maxam-Gilbert方法的化学特性已经被进行修饰来帮助消除有毒性的反应物，但是Sanger测序通过合成双脱氧核苷酸的方法已经变成了一种测序的标准。 Sanger测序法在1977年被创建，并且在UNIT7.4中被详尽的描述了。尽管通过当前NGS 标准测序相对较慢，但是在Sanger末端终止法的改进，自动化，以及商业化这些方面已经使它能够在当前的多种应用范围中成为最适当的测序方法。特别的，超薄的凝胶板电泳已经被多通道毛细血管电泳代替了，逐渐还出现了自动填充可循环的毛细血管以及电动样品加样，这对提高Sanger测序过程的速度与便利性有很大的贡献。在Sanger测序中已经出现的最显著的创新点有：（1）荧光染色的发展，（2）采用末端循环测序降低所要求的输入DNA的质量并且用耐热聚合酶高效准确的将终止物染色与正在伸长的DNA链结合起来，（3）解释和分析序列软件的发展。在自动化的Sanger测序项目中的主导者是Applied Biosystem（AB）。当前商业化的AB测序仪全部使用的是荧光染色和毛细管电泳（CE）。用于DNA测序或者片段分析协议的机器的容量在发生改变，4组毛细血管（SeqStudio Genetic Analyzer），8到24组毛细管（3500 Series Genetic Analyzer），以及48到96组（3700 Series Genetic Analyzer）。所以的这些测序仪产生了600-1000个碱基的正确的序列。尽管多年以来，不同种类基于Sanger测序的测序仪器已经被引进，包括来自Licor，Amersham，MilliGen，Perkin Elmer 和Dupont，所以的这些除了AB仪器都已经被停产了。 Sanger测序技术在一些应用中任然非常有用，而这些应用中高通量测序是不被要求的。一些DNA测序的核心设备和以测序来获利的公司提供了Sanger测序服务。对于个体测序反应对公共的用法是在一个特殊的模板上用特殊的DNA引物，例如去检验质粒的构建和PCR 产物。既然来自大量的商家的用于DNA纯化的分子生物试剂盒和试剂以及相对较高质量的合成产物都是可用的，这就使得甚至是相对较大的Sanger测序项目都能够在合理的时间框架和成本范围内完成。 除了检测DNA的序列AB仪器上的毛细管电泳（CE）还被应用到测量酶对基于荧光标记的DNA底物的选择活性，列如，可以分析DNA片段的大小。毛细管电泳同样能够用来同时分析一个单反应中的多个底物，产物或者反应介质，通过不同的荧光标记。CE被用在DNA 聚合酶和DNA连接酶动力学，以及包括冈崎片段和核糖核苷酸的删除修复的偶联酶通路的研究中。AB CE在在糖生物学中也是很有用的，可以用来分析荧光标记的多糖。 第二代测序方法 术语“下一代”隐含着DNA测序技术发展的下一步，同时也表明将会产生一个以下一代命名的新技术。我们更喜欢用下一代，第三代等这些术语，因为我们意识到上述的自动化的
新一代测序技术研究内容
新一代测序技术研究内容 新一代测序技术不仅仅是生命科学基础研究的重要工具，它即将发展为一个新型的巨大产业群，彻底改变生命科学相关产业和医学的发展模式，并给人类社会带来不可估量的巨大影响。 该技术主要包括基因组学、转录组学、表观组学三个方面的研究。 （1）基因组学 基因组学，或称基因体学，是研究生物基因组和如何利用基因的一门学问。该学科提供基因组信息以及相关数据系统利用，试图解决生物、医学和工业领域的重大问题。此外，基因组学能为一些疾病提供新的诊断和治疗方法，有助于医生获得更多的治疗信息并进行个性化医疗。同时，基因组学还被用于食品与农业部门。 在新一代测序技术中，基因组学方面主要包括以下八个方面的测序研究： ①全基因组从头测序 从头测序即de novo测序，不需要任何参考序列资料即可对某个物种进行测序，用生物信息学分析方法进行拼接、组装，从而获得该物种的基因组序列图谱。利用全基因组从头测序技术，可以获得动物、植物、细菌、真菌的全基因组序列，从而推进该物种的研究。一个物种基因组序列图谱的完成，意味着这个物种学科和产业的新开端！这也将带动这个物种下游一系列研究的开展。全基因组序列图谱完成后，可以构建该物种的基因组数据库，为该物种的后基因组学研究搭建一个高效的平台；并为后续的基因挖掘、功能验证提供DNA序
列信息。 ②全基因组重测序 随着测序成本降低和已知基因组序列物种增多，全基因组重测序已经成为动植物育种、群体进化、药物研发、疾病研究和临床诊断中最为迅速而有效的方法之一。全基因组重测序是对基因组序列已知物种的个体进行基因组测序，并在个体或群体水平进行差异性分析的测序方法。在全基因组水平上扫描并检测与生物体重要性状相关的突变位点，具有重大的科研价值和产业价值。 ③外显子测序 外显子测序是指利用序列捕获技术将探针能覆盖到的全基因组外显子区域DNA捕捉并富集后再进行高通量测序的基因组分析方法。该方法能够获得指定外显子捕获平台探针设计区域及侧翼200bp序列的遗传信息，极大地提高了人类基因组中外显子区域的研究效率，显著降低了研究成本。目前主要用于识别和研究与疾病、种群进化相关的编码区及UTR区域内的结构变异。 ④目标区域测序 目标区域测序是指利用特制的探针对客户感兴趣的蛋白编码区域DNA或某段特定序列进行捕获，富集后进行高通量测序的基因组分析方法。该方法能够获得指定目标区域的遗传信息，极大地提高了基因组中特定目标区域的研究效率，显著降低了研究成本。通过目标区域测序，可以对候选位点或候选基因进行验证，也可以进一步找到候选区域或候选基因内的易感位点，适用于候选基因关联分析等研究。