组培过程中的玻璃化问题及防治

组培过程中的玻璃化问题及防治

在进行植物组织培养时，经常会发现试管苗生长异常，表现为试管苗叶、嫩梢呈水晶透明或半透时，水浸状；整株矮小肿胀、失绿；叶片皱缩成纵向卷曲、脆弱易碎；叶表缺少角质层蜡质，没有功能性气孔，不具有栅栏组织，仅有海绵组织。这种试管苗生长异常现象就是P.Debergh（1981）首先命名的“玻璃化”（V itrification）。是植物组织培养过程中所特有的一种生理失调或生理病变。

玻璃苗中因其体内含水量高，干物质、叶绿素、蛋白质、纤维素和森质素含量低、角质层、栅栏组织等发育不全，表现为光合能力和酶活性降低，组织畸形，器官功能不全，分化能力降低，所以很难继续用作继代培养和扩大繁殖的材；生根困难，移栽后也很难成活。植物微体快速繁殖时玻璃苗的出现已成为一种很普遍的现象，该苗有时多达50%以上，严重影响繁殖率的提高，已成为茎尖脱毒、工厂化育苗和材料保存等方面的严重障碍，造成人、财、物的极大浪费，所以试管苗下班化现象对植物组织培养的危害是相当严重的，也是亟待解决的问题。

（一）玻璃苗发生的因素

琼脂和蔗糖浓度与玻璃化成负相关，琼脂或蔗糖浓度越高，玻璃苗的比率越低。Daniel G. W. Brown认为玻璃化可能是培养基渗透势不当所致。碳源不仅为芽的形成提供能量，而且也起渗透调节作用，主要影响培养基的渗势（Salisbury等）。随琼脂浓度及纯度的增加，培养基硬度增加，从而影响其衬质势和水分状况。Debergh等研究表明，液体培养基的水势影响玻璃苗的形成，Ziv等认为只要降低培养容器中的相对湿度，就可以降低玻璃苗的比例。刘思颖等（1988）测得丝石竹玻璃苗叶片的水势约为正常苗的 1.9倍，含水量为正常苗的2.09倍—2.21倍。自由水和高湿度可能与肉质嫩梢的形成有关。Davis等研究表明，液体培养是导致玻璃化的主要原因。可以断定，试管苗玻璃化可能是培养基内水分状态不适应的一种生理变态。

许多学者证明培养基中BA浓度和培养温度与玻璃化成正相关，BA浓度越高或培养温度越高，玻璃苗比率越大。Debergh曾用14C-KT 研究表明，随琼脂浓度的增加，K T利用率降低。同时也证明，随BA浓度的增加，玻璃化率增加。Born man等用14C-BA研究表明，14C-BA 的积累与不定芽分化和玻璃化是同步的。玻璃化苗的一个重要特征是叶脉明显加长，而GA3也有类似效应，也许GA3促进了细胞过度生工，从而导致玻璃化。生长素可以改变细胞壁的机械特性，使其具有更大的可塑性。

许多研究表明，非受伤的物理和化学协迫可以增加乙烯的合成。玻璃化被认为是一种非受伤协迫条件下形态上的反应。玻璃苗苯丙氨酸解氨酶（PAL）的活性低于正常植株。在协迫条件下乙烯的快速合成，又通过抑制氨基环丙烷羧酸（ACC）酶的形成，对乙烯起反馈调节作用。通过改善气体交换防止玻璃化形成，可能与克服乙烯反馈抑制有关。一种与膜有关的过氧化物酶直接或间接掺入ACC合成乙烯。现已证明，IAA-氧化酶体系至少在乙烯合成的最后一步起作用。IAA含量降低将进一步通过IAA调节S-腺苷甲硫氨酸（SAM）转化成ACC这一过程，从而降低了乙烯形成。Kevers等曾证明，对于玻璃苗，碱性过氧化酶同功酶活性增加，而酸性同功酶活性降低。但总可溶性过氧化物酶活性增加，仅限于碱性提取物。有人认为，玻璃化的形成主要是膜的效应而与核酸无关。乙烯促进了叶绿素分解及细胞的畸形发展。乙烯处理破坏了膜的结构，随着细胞壁解离，细胞内积累有在量纤维素及泡状物质。可见，乙烯对玻璃化的影响，与改变组织的生理生化及纤维结构有关。Hakkart F. A. 等认为玻璃苗是培养瓶内气体与外界交换不畅造成的。密闭的封瓶口材料是导致玻璃化的原因之一（陈国菊等1992，李云等1996）。

培养基中高的含N量，特别是高的氨态N，也是导致玻璃化的因素。

有人发现不同部位的节段外植体与玻璃化有关，以留兰香基部节段所形成的试管苗玻璃苗严重，中部茎段次之，茎尖最好（柴明良）；重瓣丝石竹中部茎段出现玻璃苗较多，基部茎段较少，茎尖没有（郭达初）。郭东红等（1989）认为瑞香茎尖外植体大小与玻璃化相关，茎尖外植体越小，出现玻璃苗比率越大。

（二）玻璃苗发生的机理

Kevers等的试验表明，苹果砧木M7等的玻璃苗是由于过氧化物酶——吲哚乙酸氧化酶系统控制的乙烯过饱和的影响，并认为细胞激动素和NH4+离子的过剩是一种最初的胁迫，受胁迫的试管苗在乙烯过剩的空气中，抑制了乙烯的生物合成，结果降低苯丙氨酸解氨酶（PAL）和酸性过氧化物酶的活性，从而妨碍组织木质化，导致形成玻璃苗。一种诱导协迫（过多的细胞分裂素和NH4+），可以通过酚含量的快速化调节不断增加的过氧化物酶活性。乙烯的大量形成又对其自身起反馈抑制作用，结果PAL和酸性过氧化物酶活性降低，从而抑制木质化过程的进行。糖用于氨基酸的合成，纤维素含量降低。由于缺乏纤维素和木质素，壁压降低，从而细胞过分吸水，并导致玻璃化。张洪胜等认为在试管苗玻璃化过程中，作为内源激素的乙烯从代谢调节上起了关键性启动作用。而乙烯的产生则取决于培养环境中的胁迫条件，如水势不当，通气不畅（造成缺氧）及培养基用BA量过高等，均会导致乙烯产生。乙烯产生后引发了其他激素质和量上的改变及酶类的变化。因此，发生蛋白质、纤维素和木质素的合成障碍及降解，叶绿素分解黄化，逐渐形成玻璃化症状；张昆瑜等（1991）认为乙烯克服试管苗玻璃化的机理是复杂的，在添加乙烯前体ACC（1-氨基环丙烷-1-羧酸）和乙烯释放剂CEPA（乙烯利）的培养基上证明乙烯对香石竹试管苗干物质积累及组织、器官的发育有利。并发现ACC可促进烟草愈伤组织中的过氧化物酶和苯丙氨酸裂解酶的活

性，加强磷酸戊糖途径与抗氰交替途径，前两个酶是促进木质素合成和细胞壁形成的关键酶，磷酸戊糖途径与叶绿素前体的合成有关，抗氰交替途径则降低了ATP的合成，从而抑制了过度主动吸水，提高了蛋白质和干物质的含量。

李云等（1996）发现植物光呼吸途径和磷酸戊糖（H MP）途径均与玻璃苗的产生有关，即当上述两条呼吸途径的一条或两条同时受阻时，均增加玻璃苗。密封瓶口、高温、高浓度细胞分裂素等因子加快了生长速度，加剧了瓶中气体组成的改变，对瓶内外气体交换提出更高要求，当这种要求不能满足时便出现玻璃化。HMP途径的中间步骤与戊糖化合物代谢有关（如核酸合成），也与木质素形成有关。当HMP 途径被抑制时，壁的再生受抑制，戊糖化合物减少，核酸、蛋白质合成受阻。当光呼吸途径被抑制时，减弱了光呼吸对光合的保护作用，过剩的同化物损坏了光合细胞器，不仅降低了光合作用，同时也阻碍了乙醇酸的的转化，加重了乙醇酸对植物的毒害作用，从而导致玻璃化的产生。

（三）防止和克服玻璃苗的措施

尽管关于玻璃化的成因及其生理机制到目前为止仍未得出一致的结论，但对某些植物的玻璃化已得到有效的控制。这些研究表明，控制玻璃化要从培养的环境条件和生理生化方面入手，具体措施如下：

利用固体培养，增加琼脂浓度，降低培养基的衬质势，造成细胞吸水阻遏。提高琼脂纯度，也可降低玻璃化。

适当提高培养基中蔗糖含量或加入渗透剂，降低培养基中的渗透势，减少培养基中植物材料可获得的水分，造成水分胁迫。

降低培养容器内部环境的相对湿度。

适当降低培养基中细胞分裂素和赤霉素的浓度。

控制温度适当低温处理，避免过高的培养温度在昼夜变温交替的情况下比恒温效果好。

增加自然光照。试验发现，玻璃苗放于自然光下几天后茎、叶变红，玻璃化逐渐消失，因自然光中的紫外线能促进试管苗成熟，加快木质化。

增加培养基中Ca、Mg、Mn、K、P、Fe、Cu、Mn元素含量，降低N和Cl元素比例，特别降低铵态氮浓度，提高硝态氮含量。

改善培养容器的通风换气条件，如用棉塞或通气好的封口膜封口。

青霉素G钾（2mg/L—6mg/L）能有效防治菊花试管苗的玻璃化（陈龙清等），青霉素（40万单位/升）可降低芥菜试管苗的玻璃化（陈国菊等）。

培养基中加入间苯三酚或根皮苷。

用40℃热击（周菊华等）处理瑞香愈伤

1.在培养基中添加活性碳可以防止植物组织自身的酚类物质排泌和变褐老化。对形态发生和器官形成有良好作用。一般认为，活性碳主要吸附非极性物质及色素大分子，可以减少一些有害物质的影响，但是具体吸附的选择性很差，温度低时吸附力增强，温度高是吸附力减弱，甚至会解吸附。通常使用浓度为0.5-10g/L。加入活性炭后使培养基变黑，对一些植物诱导生根有利。大量活性炭的加入会削弱琼脂的凝固能力，因此要多加些琼脂。很细的活性炭容易沉淀，因此通常在琼脂将要凝固时，需轻轻摇动培养瓶。

2.植物外植体组织在接种时的切割面会溢泌一些酚类物质，在接触空气中的氧气后其会氧化为相应的醌类物质，产生可见的茶色、褐色或黑色，此即谓“酚廴尽薄Ｔ谀颈局参铮 绕涫侨却 颈局参锛吧倭坎荼局参镏校 讼窒蠼衔 现亍３Ｓ玫姆乐未胧┤缦拢?br>

A.试用抗酚类氧化的药剂（半胱氨酸及其盐酸盐、二硫苏糖醇、谷胱甘肽、抗坏血酸等。该类药剂一般需用浓度为50-200mg/L。用经过滤灭菌的药液洗涤刚切割的外植体伤口表面，或加入固体培养基的表层，或将刚切割的外植体浸入其中一定时间）

B.适当降低培养基温度。

C.接种后先进行一定时间的暗培养。

D.及时转接入新鲜培养基。

E.选择切取外植体部位等

许多植物的组织培养中发现有褐变现象，尤以木本植物组织培养中褐变严重。褐变主要发生在外植体、愈伤组织的继代、悬浮细胞培养、原生质体的分离与培养等。褐变产物不仅使外植体、细胞、培养基等变褐，而且对许多酶有抑制作用，从而影响培养材料的生长与分化，

严重时甚至导致死亡。

[1] 褐变的机理

正常细胞内，区域性分布使底物与PPO不能接触并不发生褐变，当细胞膜的结构发生变化和破坏时，酶和底物就结合在一块，在氧的作用下，生成醌，从而引起褐变。

引起褐变的条件：氧、引起褐变的酶、底物，缺一不可。

引起褐变的酶：多酚氧化酶（PPO是主要的）、过氧化物酶（POD）、、苯丙氨酸解氨酶等。引起褐变的酶的底物：主要是酚类化合物，可分成3类：

第一类是苯基羧酸，包括邻羟基苯酚、儿茶酚、没食子酸、莽草酸等；

第二类是苯丙烷衍生物，包括肉桂酸、香豆酸、咖啡酸、单宁、木质素等；

第三类是黄烷衍生物，包括花青素、黄酮、芸香苷等。

[2] 影响褐变的因素

因子是复杂的，随植物的种类、基因型、外植体部位及生理状态等的不同，褐变的程度也有所不同。

A.植物种类及基因型

红豆杉愈伤组织的诱导及继代培养过程中，常常发生培养细胞褐变现象，轻者影响细胞生长和繁殖，重者导致细胞死亡。

豆科植物和芸苔属植物原生质体培养中容易褐化也是一个普遍的问题，

橡胶的花药培养中，海垦2号花药的褐变较少，因而愈伤组织的诱导容易；而有些品系花药容易褐变，因而愈伤组织的诱导困难。在组织培养中，有些品种、品系难以成功，而有些则容易成功。

油菜叶原生质体品种373褐化比品种94591、95386严重

B.外植体部位及生理状态

荔枝茎的愈伤组织中度褐变，而根的愈伤组织全部褐变。

欧洲栗幼年型的材料培养时含醌类物质少，成年型材料培养时含醌类物质多，后者比前者褐变严重。

油棕幼嫩外植体（如胚）培养较少褐变，高度分化的叶片接种后则容易褐变。

C.培养基成分及培养条件

硬紫草从长期继代培养且次生代谢物含量高引起培养物的褐变。

用B5培养基可有效地防止褐变。

茼蒿用甘露醇或蔗糖作为渗透压调节剂易发生褐变，不能或只能形成少量细胞团用葡萄糖作渗透压调节剂褐变较少，效果好。

柿树ZT 9.13μmol/L、IAA 0.57μmol/L减轻褐变程度。BA或 K T 提高了褐变

甘蔗组织培养中易产生褐变。

荔枝培养基添加1 mg/L6-BA +0.5 mg/L 2,4-D时，愈伤组织较硬、增殖缓慢、易褐变；培养基添加1 mg/ L 6-BA+1 mg/L2,4-D时，愈伤组织浅黄疏松、增殖快[4]。D.pH值影响材料的褐变

大白菜pH值至6.5，很大程度上可抑制褐变。

水稻pH值为4.5 ～5.0时，生长状态良好的，其表面呈黄白色，pH值为5.5 ～ 6.0时，愈伤组织严重褐变。

E.培养条件不适宜

温度过高或光照过强，均可使PPO的活性提高，从而加速被培养的组织褐变。

高浓度CO2也会促进褐变，其原因是环境中的CO2向细胞内扩散，使细胞内CO32+增多，产生褐变。

[3] 克服褐变的方法a.选择适当的外植体

成年植株比实生幼苗褐变的程度严重，夏季材料比冬季及早春和秋季的材料褐变的程度强。而冬季的芽进入深休眠状态，不太容易生长，所以最好选用早春和秋天的材料作为外植体。取材时还应注意外植体的基因型及部位，选择褐变程度较小的品种和部位作外植体。

b.对外植体进行预处理

空白琼脂培养基中培养5-7天，使组织中的酚类物质部分渗入培养基中。再转移培养基2-3次，切口愈合后，褐变减轻。

c.选择适宜的培养基与培养条件设置不同试验，进行选择。

d.添加褐变抑制剂与吸附剂

有机酸\抗坏血酸、半胱氨酸\柠檬酸、苹果酸和α-酮戊二酸\水解乳蛋白、植酸（PA）\SO2和亚硫酸盐\、脂肪氧化酶、抗坏血酸氧化酶\硫脲、二氨基二硫代甲酸钠、2-巯基苯并噻唑、氯化钠等也是PPO的抑制剂。聚乙烯吡咯烷酮（PVP）是酚类物质的专一性吸附剂，活性炭是一种吸附性较强的无机吸附剂，，能吸附各种微量物质和微小颗粒，

e.进行细胞筛选和多次转移

进行细胞筛选，剔除易褐变的细胞。外植体接种后1~2天立即转移到新鲜培养基中或同一瓶培养基的不同部位，这样能减轻醌类物质对培养物的毒害作用，连续转移5~6次可基本解决外植体的褐变问题。