Western-blot-操作步骤
Western blot 操作步骤
实验原理：
Western blot，也称Western blotting、蛋白印迹，是用抗体检测蛋白的重要方法之一。Western blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE），被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如PVDF 膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。
内参:
WB过程监测以及目的蛋白定量的标准；最重要和最不可或缺的对照就是内参照。
1.内参可检测整个WB实验过程及体系是否正常工作，如果一个实验连内参照都出不了阳性结果的话（在内参抗体有效的情况下），那么这个体系就是存在问题的；
2、起半定量的标准的作用，内参一般选择管家基因编码表达的蛋白，在很多组织和细胞中都是稳定表达的，因此可以作为检测靶蛋白表达量的标准；
内参名称分子量大小适用范围
beta-actin 43kDa 胞浆和全细胞
GAPDH 30-40kDa 胞浆和全细胞Tubulin 55kDa 胞浆和全细胞VCDA1/Porin 31kDa 线粒体
COXIV 16kDa 线粒体
TBP 38kDa 细胞核
实验步骤
一、蛋白样品制备（组织中总蛋白的提取）
第一步：
法（1）敲取0.07-0.1g组织+400-500ul裂解液，放入打样管，放入打样机打样。
法（2）实验室研钵研磨：取稍大于0.1g的样品放入研钵中，加少量液氮冻硬，用研杵来回研磨至粉末状，用枪头刮取收集入离心管。
注：任何操作都要在液氮中进行，并且要将枪头和离心管提前泡在液氮中。
第二步：取出的样品放置冰上1-2h（中间混匀5-6次）直至裂解完全。
第三步：样品离心×2，取上清于新的EP管中。
（离心条件：13000rpm，4℃，30min）
注：离心机提前预冷至4℃。
二、蛋白含量的测定
第一步：在96孔板第一列1-8分别为浓度为0，1，2，4，6，8，9，10倍的蛋白标准液+水=10或20ml，再加上5倍稀释的考马斯亮蓝染液200ml。
第二步：在96孔板后面几列依次加入稀释的蛋白样品或原液10-20ml以及5倍稀释的考马斯亮蓝染液200ml。
注：原液浓度太高时进行稀释，用裂解液稀释。
三、电泳
第一步：清洗玻璃板
将玻璃板在蒸馏水下冲洗干净，去除杂质，再用去离子水清洗一遍，自然晾干。
第二步：配胶
（1）玻璃板对齐后放入夹中卡紧，然后垂直卡在架子上准备灌胶。
（2）配分离胶，加入TEMED后立即摇匀即可灌胶。待胶面升到玻璃板3/4位置时即可。然后胶上加一层水，液封后的胶凝固更快。
注：加水液封时须缓慢，否则胶会被冲变形。
（3）当水和胶之间有一条折射线时，说明胶已凝固。倒去胶上层水并用吸水纸将水吸干。配浓缩胶，加入TEMED后立即摇匀即可灌胶。将剩余空间灌满浓缩胶，然后将梳子插入浓缩胶中。待到浓缩胶凝固后，两手分别捏住梳子的两边竖直向上轻轻将其拔出。
注：插梳子时要使梳子保持水平，两边对齐垂直插入。
（4）用水冲洗一下浓缩胶，将其放入电泳槽中。（小玻璃板面向内，大玻璃板面向外。若只跑一块胶，槽另一边要垫一块塑料板且有字的一面面向外。）
第三步：上样
（1）测完蛋白含量后，计算含50mg蛋白的溶液体积即为上样量。适量蛋白加入4：1 5×Loading Buffer于离心管，100℃水中煮5min使蛋白变性。放置冰上3min，离心15min，13000rpm，4℃。（2）加足够的1×电泳缓冲液后开始准备上样。（电泳液至少要没过内测的小玻璃板。）用微量进样器贴壁吸取样品，将样品吸出不要吸进气泡。将加样器针头插至加样孔中缓慢加入样品。（加样太快可使样品冲出加样孔，若有气泡也可能使样品溢出。）
第四步：电泳
浓缩胶80V电压跑20分钟，至蛋白marker分离即可加压，也可多跑几分钟；分离胶120V 电压跑至底端。
第五步：停止电泳
纯水冲洗玻璃板，取胶，清洗切去浓缩胶，在Marker下方切角做标记，将胶泡在清水中。
四、转膜（跑胶时准备转膜用品，最主要赶气泡）
第一步：剪PVDF膜，并提前切角标记方向，甲醇中泡1-3min。
第二步：将膜、海绵、滤纸一起泡入1×转膜液中，放4℃保存。
第三步：将夹子打开使黑的一面保持水平。在上面垫一张海绵垫，用玻棒来回擀几遍以擀走里面的气泡。(一手擀另一手要压住垫子使其不能随便移动。)在垫子上垫2层滤纸，一手固定滤纸一手用玻棒擀去其中的气泡。将胶盖于滤纸上，轻轻用玻棒擀去气泡。将膜用镊子盖于胶上完全对齐，并除气泡。在膜上盖2层滤纸并除去气泡。最后盖上另一个海绵垫，合起夹子。整个操作在4℃的1×转膜液中进行，要不断的擀去气泡。膜两边的滤纸不能相互接触，接触后会发生短路。第四步：将夹子放入转膜槽中，黑对黑，白对红。电转移时会产热，过热有可能造成蛋白质的降解，同时大量产热，会使凝胶膨胀，有可能在胶和膜之间产生空隙，引起转膜不均匀，所以在转膜槽中放入冰盒，在冰水混合物中进行转膜。
注：转膜条件是电流300mA或电压70V，2h；另一个约束条件就是电压必须控制在60-70V，调节电流。
第五步：转完后将膜放入装水的小盒中冲洗，倒水后，加5%的封闭液，摇床封闭1h。五．抗体孵育，免疫反应
第一步：回收封闭液，加入一抗，摇床30min-1h，4℃过夜，再孵育30min-1h。
第二步：一抗回收，用PBST洗，洗5次，每次5min。
第三步：加二抗，孵育2h。
第四步：二抗回收，用PBST洗，洗5次，每次5min。
第五步：纯水冲洗5-7次，倒掉纯水，加化学发光，膜在化学发光中浸泡2-3min，成像。
实验药品试剂
1.裂解液：
母液（动物组织蛋白提取Buffer）：蛋白酶抑制剂：Pmsf（配）=100:1:1
母液常温放置；蛋白酶抑制剂和Pmsf需-20℃保存；裂解液需-4℃保存。
2.考马斯亮蓝染液，使用前用无菌水稀释。
3.转膜液的配制（1×）1L
试剂剂量
Tris 3.028g
14.4g
Glaline（甘氨酸）
SDS1g
先定容800ml，调制PH=8.3，然后+200ml甲醇，混匀。
4.蛋白电泳Buffer（5×）1L
试剂剂量
Tris15g
72g
Glaline（甘氨酸）
SDS5g
直接定容至1L，无需灭菌和调pH；使用前稀释至1×。
5.磷酸盐缓冲液（PBS，10×）500ml
试剂剂量
NaCl 40g
KCl 1g
Na HPO·2H O 7.2g
KH PO 1.2g
调制pH=7.4-7.5
6.PBST配制
1L的PBS+5ml 20%Tween20
7.封闭液（5%）
脱脂奶粉5g，溶于PBST，定容至1L。
8.一抗溶于封闭液；二抗溶于PBST。
9.按照如下表格配制SDS-PAGE的浓缩胶(也称堆积胶、积层胶、上层胶)
成分配制不同体积SDS-PAGE浓缩胶所需各成分的体积（mL）
2346810 5%胶
蒸馏水 1.4 2.1 2.7 4.1 5.5 6.8 30%Acr-Bis(29:1)0.330.50.67 1.0 1.3 1.7
0.250.380.50.75 1.0 1.25 1M Tris，pH8.8
10%SDS0.020.030.040.060.080.1
0.020.030.040.060.080.1 10%过硫酸铵
TEMED0.0020.0030.0040.0060.0080.01 10.根据目的蛋白的分子量大小选择合适的分离胶（下层胶）浓度
SDS-PAGE分离胶浓度最佳分离范围
50-150kD
6%胶
30-90kD
8%胶
20-80kD
10%胶
12-60kD
12%胶
10-40kD
15%胶
成分配制不同体积SDS-PAGE分离胶所需各成分的体积（毫升）
51015203050
6%分离胶
蒸馏水 2.0 4.0 6.08.012.020.0
30%Acr-Bis(29:1) 1.0 2.0 3.0 4.0 6.010.0
1.9 3.8 5.77.611.419.0
1M Tris，pH8.8
10%SDS0.050.10.150.20.30.5
0.050.10.150.20.30.5
10%过硫酸铵
TEMED0.0040.0080.0120.0160.0240.04
成分配制不同体积SDS-PAGE分离胶所需各成分的体积（毫升）
51015203050
8%分离胶
蒸馏水 1.7 3.3 5.0 6.710.016.7
30%Acr-Bis(29:1) 1.3 2.7 4.0 5.38.013.3
1.9 3.8 5.77.611.419.0
1M Tris，pH8.8
10%SDS0.050.10.150.20.30.5
0.050.10.150.20.30.5 10%过硫酸铵
TEMED0.0030.0060.0090.0120.0180.03成分配制不同体积SDS-PAGE分离胶所需各成分的体积（毫升）
51015203050 10%分离胶
蒸馏水 1.3 2.7 4.0 5.38.013.3 30%Acr-Bis(29:1) 1.7 3.3 5.0 6.710.016.7
1.9 3.8 5.77.611.419.0
1M Tris，pH8.8
10%SDS0.050.10.150.20.30.5
0.050.10.150.20.30.5 10%过硫酸铵
TEMED0.0020.0040.0060.0080.0120.02成分配制不同体积SDS-PAGE分离胶所需各成分的体积（毫升）
51015203050 12%分离胶
蒸馏水 1.0 2.0 3.0 4.0 6.010.0 30%Acr-Bis(29:1) 2.0 4.0 6.08.012.020.0
1.9 3.8 5.77.611.419.0
1M Tris，pH8.8
10%SDS0.050.10.150.20.30.5
0.050.10.150.20.30.5 10%过硫酸铵
TEMED0.0020.0040.0060.0080.0120.02成分配制不同体积SDS-PAGE分离胶所需各成分的体积（毫升）
51015203050 15%分离胶
蒸馏水0.5 1.0 1.5 2.0 3.0 5.0 30%Acr-Bis(29:1) 2.5 5.07.510.015.025.0
1.9 3.8 5.77.611.419.0
1M Tris，pH8.8
10%SDS0.050.10.150.20.30.5
0.050.10.150.20.30.5 10%过硫酸铵
TEMED0.0020.0040.0060.0080.0120.02