PTPA对PP2AC+Y307磷酸化水平的作用及其机制
华中科技大学
硕士学位论文
PTPA对PP2AC Y307磷酸化水平的作用及其机制
姓名：聂运娟
申请学位级别：硕士
专业：病理学与病理生理学
指导教师：周新文
2011-01-19
PTPA对PP2A C Y307磷酸化水平的作用及其机制
中文摘要
阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease, AD)是一种渐进性的记忆丢失和认知功能损伤的神经退行性疾病，AD患者脑内两大特征性病理学改变是神经元内形成大量神经原纤维缠结(neurofibrillary tangles, NFT)，以及细胞间大量老年斑（senile plaques, SP）的沉积。其中，神经原纤维缠结的主要成分是异常磷酸化的tau蛋白。人体内有107个酪氨酸磷酸酯酶，其中PP2A属于PPP家族，在AD发生发展过程中发挥重要的磷酸酯酶作用，影响着tau的磷酸化。PP2A催化亚基的活性调节方式主要有：改变PP2A C的表达水平以及对PP2A C翻译后修饰——Leu309甲基化和Tyr307磷酸化。PTPA是一种普遍存在于哺乳动物组织和细胞的蛋白，PTPA能够通过改变PP2A C空间构象和增加Leu309位点甲基化水平来增强PP2A磷酸酯酶的活性，但对PP2A C的Tyr307位点磷酸化水平是否存在作用，目前尚不清楚。
目的：研究PTPA对PP2A C Tyr307位点磷酸化水平的影响及其可能机制。
材料和方法：构建PTPA野生型质粒（wt-PTPA）和特异性针对PTPA基因序列的RNA干扰质粒pSUPER-siPTPA（siPTPA），分别转染入HEK293/tau细胞系，蛋白免疫印迹技术检测tau蛋白各位点磷酸化水平，检测与tau磷酸化相关的激酶、PP2A C蛋白、PP2A C去甲基化、磷酸化水平的变化。用PP2A活性试剂盒检测转染PP2A活性变化；用细胞免疫荧光观察PTPA与tau的磷酸化位点的细胞共定位；用RT-PCR方法检测PTP1B转录水平变化。
结果：（1） wtPTPA有效地增加了PTPA的表达，pSUP-siPTPA有效地降低了PTPA的表达；（2）293/tau细胞内过表达PTPA可以降低tau磷酸化水平，敲除PTPA 使tau蛋白磷酸化水平增加；（3）调控PTPA表达水平可改变PP2A活性，但对GSK-3β没有影响；（4）OA可逆转过表达PTPA后对tau磷酸化水平的降低；（5）过表达PTPA能降低PP2A C Y307磷酸化水平；PTPA敲除后PP2A C Y307磷酸化水平升高；（6）过表达PTPA能增加PP2A C Y307位点磷酸酯酶PTP1B的转录和蛋白表达水平；PTPA敲除后PTP1B的转录和蛋白表达水平降低，而其他引起PP2A C Y307变化的激酶没有发生变化。
结论：PTPA调控PTP1B的mRNA和蛋白水平而影响PP2A C307位点酪氨酸
磷酸化。
关键词：蛋白磷酸酯酶活化因子；蛋白磷酸酯酶－２Ａ；酪氨酸３０７；蛋白酪氨酸磷酸酯酶１Ｂ；ｔａｕ蛋白；磷酸化
The effects of PTPA on PP2A C Y307 phosphorylation level and the underlying mechanism
Postgraduate: Yunjuan Nie
Supervisor:Prof. Xinwen Zhou
Abstract
Alzheimer's disease (Alzheimer's disease, AD) is a progressive memory loss and cognitive impairment in neurodegenerative disease, the characteristic pathological changes in the brain is: neurofibrillary tangles (NFT) in neurons and senile plaques (senile plaques, SP). The main component of neurofibrillary tangles is the abnormal phosphorylated tau protein. 107 types of tyrosine phosphatases are in human body; PP2A belongs to PPP family, and plays an important role in tau phosphorylation. PP2A catalytic subunit is regulated by catalytic subunit level and posttranslational modification, for example methylation at Leu309 and phosphorylation at Tyr307. PTPA, exists in animal tissues and cells, could activate PP2A via changing PP2A C space conformation and increasing methylation level at Leu309 by PME. It’s not clear whether PTPA has effects on Tyr307 phosphorylationai level.
Objective: To explore the effects of PTPA on PP2A C Y307 phosphorylational level and the underlying mechanism.
Materials and Methods:PTPA wild type plasmid (wt-PTPA) and siPTPA (pSUPER-siPTPA) were constructed and transfected into HEK293/tau cells. Proteins levels were detected by Western blotting and Immunofluorescence, PP2A actvity was detected by protein phosphatase activity assay kit, RT-PCR was used to deteced PTP1B mRNA.
Results: (1) Overexpression of PTPA reduces tau phosphorylation level, knockdown of PTPA increases tau phosphorylation level; (2) Overexpression of PTPA increases
PP2A activity, PTPA knockdown decreases PP2A activity; (3) PTPA regulates PP2A C Y307 phosphorylation and PP2Ac L309 methylation level, but has no obvious effects on other major enzymes which regulate tau phosphorylation; (4) Overexpression of PTPA increases PTP1B mRNA and protein levels; PTPA knockdown decreases PTP1B mRNA and protein levels.
Conclusion: PTPA can regulate PP2A C Y307 phosphorylation level by changing PTP1B mRNA and protein level.
Key word:PTPA,PP2A, Y307, PTP1B, tau, phosphrylation
主要英文缩略词表
AD Alzheimer’s Disease 阿尔茨海默病PTPA Phosphotyrosyl phosphatase activator 酪氨酸磷酸酯酶活化
因子
NFTs Neurofibrillary tangles 神经纤维缠结
SP Senile plaque 老年斑
APP Amyloid precursor protein 淀粉样前体蛋白A?Beta amyloid ?淀粉样蛋白PP2A Protein Phosphatase 2A蛋白磷酸酯酶-2A PME-1 phosphatase methylesterase 1 磷酸酯酶甲基转移酶GSK-3 Glycogen synthase kinase-3 糖原合酶激酶-3 PTP1B Phosphotyrosyl phosphatase type 1B 蛋白酪氨酸磷酸酯酶Src Src kinase Src激酶
ERK Extracellular signal-regulated kinase 细胞外信号调节激酶OA Okadaic acid 岗田酸
√独创性声明
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得的研究成果。据我所知，除文中已标明引用的内容外，本论文不包含任何其他
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指导教师签名： 日期： 年 月 日 日期： 年 月 日
正文
前言
阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease, AD)是一种以渐进性记忆丢失和认知功能损伤为特点的神经退行性疾病，AD患者脑内两大特征性病理学改变是：在神经细胞内大量形成神经原纤维缠结(neurofibrillary tangles, NFT)，以及在细胞间沉积大量老年斑（senile plaques, SP）1,2,3,4。其中，神经原纤维缠结的主要成分是异常磷酸化的tau蛋白1,2,3,4,5。Tau蛋白是一种微管相关蛋白，广泛分布于中枢和外周神经系统。生理情况下，tau蛋白有促进微管组装，维持微管稳定，连接其他细胞骨架蛋白等功能。磷酸化是一种普遍的蛋白翻译后修饰，磷酸化的失调涉及到许多疾病的发生。越来越多的研究报道蛋白激酶和蛋白磷酸酯酶的调节失衡是AD样tau过度磷酸化的直接原因6,7,8,9。而在众多的蛋白激酶和酯酶中，被报道最多的是GSK-3 44,45和PP-2A10,11,12，他们在tau磷酸化过程中发挥了重要的作用。
其中，丝/苏氨酸蛋白磷酸酯酶主要包括PP2A、PP2B、PP513,14,15,19,21 等，PP2A对tau蛋白去磷酸化的作用最明显8.9.10,11,15,16。体外实验证明PP2A可以使非正常磷酸化的tau去磷酸化，PP2A在人体内占tau磷酸酯酶活性的71%，而在AD脑内，PP2A活性降低8.9.10,11,16。PP2A通过调节神经微管相关蛋白( tau，map2)的磷酸化状态而使神经纤维保持稳定17,18。如 PP2A 活性下降，将导致高度磷酸化的tau 积聚于神经纤维而促使神经元变性，构成早老性痴呆主要的病理学改变8.9.10,11,15,16。现已证实在阿尔茨海默病(AD)的转基因动物模型中，PP2A 活性明显下降20,22,23，但其具体机制还不清楚，目前研究发现PP2A催化亚基的活性调节方式主要有：改变PP2A C的表达水平8,9,10及对PP2A C翻译后修饰——Leu309甲基化和Tyr307磷酸化7,8,9。在体外，调节PP2Ac的酪氨酸307位点（Tyr307）的主要有：受体或者非受体依赖性的酪氨酸蛋白激酶如p60src、p56 lck使PP2Ac的Tyr307磷酸化47,48，蛋白酪氨酸磷酸酯酶1B（PTP1B）使PP2Ac的Tyr307去磷酸化49。
PTPA是一种从酵母到人类高度保守的蛋白质，酵母的PTPA由两个基因YPA1 和YPA2编码，敲除YPA1 或YPA2均可导致酵母死亡，表明PTPA功能的重要性28。免疫印迹检测哺乳动物组织和细胞普遍存在PTPA蛋白，但是不同
组织内PTPA的分布不同。其中脑内的含量最高24,25,26。有报道PTPA可以促进PP2A酪氨酸磷酸酯酶活性29,30,31,32，在ATP和mg2+作为必要的辅助因子存在情况下，PTPA可以发挥三磷酸腺苷酶活性，促进PP2A酪氨酸磷酸酯酶活性29,31。如果将190位点脯氨酸突变为苯丙氨酸，则 PTPA/Mg2+.ATP不能激活PP2A磷酸酯酶活性30。P190是PTPA使PP2A产生顺反异构的作用位点，PTPA的顺反异构作用对于PP2A的活性反应是必需的因素30。PP2A 在体内存有可逆的甲基化反应，并受甲基酯酶的调节而去甲基化失活31，证明了PTPA可以激活PP2A-PME1丝/苏氨酸磷酸酯酶活性。大量的证据强有力的表明PTPA与PP2A 之间紧密的相互作用，PTPA通过对PP2A结构的影响，使PP2A发挥各种酯酶作用的能力发生改变29,30,31,32；PTPA还能通过改变PP2A甲基化的作用，在功能上影响PP2A活性31，因此PTPA更名为PP2A活化因子。而PTPA对PP2A Y307位点磷酸化水平是否影响，目前还未见报道。
因此，本次研究探讨PTPA对PP2A Y307位点磷酸化水平的作用及其机制，从而为PTPA作为AD治疗的新靶点提供理论基础。
材料和方法
一、主要仪器
二氧化碳培养箱1815TC（SHEL-LAB，美国），超净工作台（YJ-1450，江苏苏州净化设备公司），倒置显微镜（XSZ-D2，重庆光学仪器厂），高压蒸汽灭菌器（YXQ-SG41-280，上海医用仪器厂），紫外分光光度仪（Pharmacia Biotech，美国），-80℃低温冰箱（Nuarie，德国），凝胶成像系统（北京赛智创工科技有限公司）凝胶电泳分析系统（Hoefle），离心机（LXJ-11，上海医用分析仪器厂），图象分析系统（Image pro-plus kodak，美国），微波炉（National，日本），酶标仪（DG-3022型，Pharmacia Biotech，美国），台式高速离心机（Sigma），恒温水浴箱（武汉科学仪器厂），低温高速离心机（Sigma），恒温振荡培养摇床（武汉科学仪器厂），电泳仪(DF-C型,东方特力科贸中心)；DY-CI型转移仪，电泳槽（Hofer，美国），转膜仪（Bio-Rad），旋涡混匀仪，TP-200振荡器，脑立体定位仪（SR-6N; Narishige Scientific Instrument Laboratory, Tokyo, Japan）。超声仪，扫描仪。旋涡混匀仪，奥林巴斯光学显微镜（日本）。磁力加热搅拌器（79-1，江苏省金坛市荣华仪器制造有限公司），PCR仪（Eppendorf，德国）
二、主要试剂
DMEM 、Opti-MEM、胎牛血清（fetal bovine serum, FBS）购自Gibico公司；转染试剂Lipofectamine 2000购自Invitrogen公司，丙烯酰胺/N, N-二甲基甲叉双丙烯酰胺（Acrylamide/Bis-Acrylamide, Acr/Bis）、四甲基乙二胺（tetramethylethylenediamine, TEMED）、十二烷基磺酸钠（sodium dodecylsulphate, SDS）、甘氨酸（Glycine, Gly）、小牛血清白蛋白（bovine serum albumin, BSA）、三羟甲基氨基甲烷（trishydroxymethylaminomethane, Tris）、脱氧胆酸钠（sodium deoxycholate, DOC）、二甲基亚砜（Dimethyl Sulfoxide, DMSO）、苯甲磺酰氟（phenylmethylsulfonyl fluoride, PMSF均为Sigma公司产品。二喹啉甲酸（Bicinchoninic acid, BCA）和过硫酸铵（ammonium persulfate, AP）蛋白测定试剂盒从Pierce公司购买。用于免疫印迹的抗体稀释液为含0.02% NaN3的3% BSA。
三、抗体
表1 所用抗体性质、稀释比例和来源
抗体识别位点类型稀释比例
(WB) 稀释比例
(IF)
来源
PTPA Total PTPA mAb 1:1000 1:200 Upstate pS396 Phosphorylated tau
at Ser396
pAb 1:1000 1:200 SAB
pS404 Phosphorylated tau
at Ser404
pAb 1:1000 1:200 SAB pS262 Phosphorylated tau
at Ser262
pAb 1:1000 SAB Tau-5 Total tau mAb 1:1000 SAB Tau-1 mAb 1:1000 SAB PP2A C Total PP2A C pAb 1:1000 Cell Signaling
P-PP2A C （Tyr307）
Phosphorylated
PP2A C at Tyr307
pAb 1:200 Santa Cruz
Demethyled PP2A C demethyled PP2A C
at Leu309
mAb 1:2500 Upstate
Src PP60src mAb 1:1000 Upstate DM1A a-tubulin mAb 1:1000 Sigma
四、细胞培养
本研究采用的细胞株是稳定转染最长人tau (tau411) 异构体cDNA的人胚胎肾细胞株（HEK293/tau）。
1．细胞冻存保种
（1）冻存前一天，更换新鲜完全培养基，准备高压灭菌冻存管（规格2 ml）、枪头等；
（2）冻存时，弃去旧培养基，加入新鲜完全培养基，用滴管吹打混匀细胞；
（3）用移液器吸取细胞悬液1.8 ml到2 ml冻存管中；
（4）用移液器吸取10％DMSO，缓慢加入冻存管，并不停的摇动混匀后，
密封冻存管口，标记日期，细胞名称和传代次数；
（5）放入４°C冰箱，1个小时；
（6）转入-20°C冰箱，半个小时；
（7）迅速转入-80°C冰箱或液氮中以长期保存。
2．细胞复苏
（1）准备39°C恒温水浴锅，超净工作台，灭菌培养瓶，灭菌滴管，完全培养基；
（2）快速将冻存的细胞冻存管放入39°C恒温水中，一分钟内解冻细胞；
（3）3000 g离心3分钟；
（4）丢弃上清，加入适量完全培养基，吹散细胞，转入培养瓶中，加入完全培养基约5-15 ml，混匀细胞；
（5）放入5% CO2、37°C培养箱内培养，6～12小时内观察细胞状态，更换培养基。
3．细胞培养及处理
（1）HEK293/tau441细胞株使用选择培养基：90% DMEM、10% FBS和200 μg G418，其中DMEM用蔡氏滤器真空负压过滤除菌；
（2）在5% CO2、37°C培养箱内培养，每2~3天更换培养液一次，细胞约达70%~80%丰度时，传代或用于实验；
（3）细胞转染前，传板于6孔板或者12孔板，细胞达到70-80％丰度时，转染。
五、质粒
质粒wtPTPA由武汉大学医学院分子生物学系构建，pcDNA3.1质粒作为对照；pSUPER-siPTPA(pSUP-siPTPA)质粒为自己构建，pSUPER(pSUP)、pSUPER-siCon(pSUP-siC)作为对照。
1.质粒构建
（1）在Pubmed上搜索相关pSUP-siPTPA的有意义序列，通过在线网站设计，在https://www.360docs.net/doc/80839485.html,/BLAST对siRNA的目的基因片段进行同源性分析，最终选择以下序列：
siPTPA sense
AGCTTCGTTCCCTGTGATCCAGCACTTCAAGAGAGTGCTGGATCACAG GGAACTTTTTTGGAAC
siPTPA antisense
TCGAGTTCCAAAAAAGTTCCCTGTGATCCAGCACTCTCTTGAAGTGCT GGATCACAGGGAACGA
（2）invitrogen公司（上海）生物工程技术服务有限公司合成以上DNA单链；（3）单链DNA的退火磷酸化和连接反应
以上两条单链经退火及磷酸化反应形成dsRNA：分别加无菌去离子水稀释正向和反向模板序列。各取2 μg于oligo DNA annealing buffer，使总体积为50 μl，95°C反应5min，冷却到37温育1h, 4°C冷藏，使dsRNA模板线性化，最后进行磷酸化。具体反应如下：
1）每管siRNA oligo nucleotide 按照引物合成单稀释成10 mM的工作浓度；
2）用分光光度计测出浓度约为2.0 μg/μl；
3）正向和反向模板序列单链经退火反应形成dsRNA
Component amount
Sense hairpin SiRNA template oligo nucleotide 2.0 μg
Antisense hairpin SiRNA template oligo nucleotide 2.0 μg
Annealing buffer 46 μl
Total volume 50 μl
将混合物震荡混匀后，置于PCR仪中，先在95℃反应5分钟，然后在37°C 反应1小时后放4°C保存；
4）磷酸化
ddH2O 6.9 μl
10*T4 ligase buffer 1.0 μl
Annealing template 1.0 μl
T4PNK 0.1 μl
Total volume 10 μl
将混合物置于PCR仪先37°C反应30分钟，然后70°C反应10分钟后保存于-20°C冰箱；
（4）将载体质粒pSUPER (pSUP)进行酶切反应：
ddH2O 36 μl
10*M buffer 5.0 μl
Vector psuppress 6 μl
Xho I 1.5 μl
HindIII 1.5 μl
Total volume 50 μl
37°C反应2-3小时后，配制1%琼脂糖凝胶，上样，在5 V/cm条件下进行琼脂糖凝胶电泳，然后使用胶回收试剂盒进行凝胶回收，-20°C储存备用；（5）将载体质粒pSUP和siRNA发夹状双链结构进行连接反应：Target ligation
ddH2O 15 μl
10*T4 ligase buffer 2.5 μl
Phosphorylated siRNA template 5 μl
Vector psups(XhoI/Hiii) 1 μl
T4 ligase 0.5 μl
Total volume 25 μl
4°C反应过夜后，-20°C储存备用。
2、质粒的扩增，
（1）质粒的转化
1) 将2 μl上述连接产物加入500 μl感受态细胞中，冰浴30分钟；
2) 42°C水浴热休克90秒；
3) 加1 ml 37°C预热的LB培养基，37°C振摇1小时，使细菌复苏；
4) 取100 μl均匀涂于含有抗生素的LB平板上；
5) 37°C培养12-16小时可出现菌落；
6) 挑取单菌落于接种于含有抗生素的LB培养基中，37°C、350 rpm培养12-14小
时；
7) 取4.5 ml菌液利用Tiangen公司的小提试剂盒小量抽提；
8) 质粒测序由英峻公司（上海）完成，确定无误后开始大量制备。
（2）质粒的大量制备
用TIANGEN公司的无内毒素质粒大提试剂盒进行提取，具体操作步骤如下：1) 从LB平板中挑取单菌落接种于5 ml含抗生素的LB培养基中，37°C、300rpm
振摇8小时；
2) 取1-2 ml的菌液加到100 ml含抗生素的LB培养基中，37°C、300 rpm振摇培养
12-16小时；
3) 柱平衡步骤：向吸附柱CB5中（吸附柱放入50ml收集管中）加入2.5 ml的平
衡液BL，10,000 rpm离心2分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管内；
4) 取100 ml培养过夜的菌液加入离心管，室温10,000 rpm离心3分钟收集细菌，
尽量吸除上清，用干净的吸水纸吸去瓶壁上的水珠；
5) 向留有菌体沉淀的离心管中加入7 ml P1溶液，使用漩涡振荡器彻底悬浮细菌
细胞沉淀；
6) 向离心管中加入7 ml P2溶液，立即温和地上下翻转6-8次，室温放置5分钟；
7) 向离心管中加入7 ml P4溶液，立即温和地上下翻转6-8次，充分混匀，此时
会出现白色絮状沉淀。然后室温放置10分钟左右，10,000 rpm离心5-10分钟，将溶液全部倒入过滤器CS中，慢慢推动推柄过滤，滤液收集在干净的50 ml 的收集管中；
8) 向滤液中加入为滤液体积0.3倍的异丙醇，上下颠倒混匀后转移到吸附柱CP5
中；
9) 室温10,000 g离心2分钟，倒掉收集管内的废液，将吸附柱重新放回收集管中；
10) 向吸附柱中加入10 ml PW漂洗液，10,000 rpm离心2分钟，弃掉收集管内的废
液，将吸附柱重新放回收集管中；
11) 重复步骤9；
12) 向吸附柱内加入3 ml无水乙醇，室温10,000 rpm离心2分钟，倒掉废液；
13) 将吸附柱CP5重新放回收集管内，10,000 rpm离心5分钟；
14) 将吸附柱CP5置于一个干净的50 ml收集管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加
1-2 ml洗脱缓冲液TB，室温放置5分钟，室温10,000 g离心3分钟，将50 ml离心管内的洗脱液全部移入一个干净的1.5 ml离心管，-20°C保存。
六、细胞质粒转染
在HEK293/tau细胞中瞬时转染质粒，具体分组如下：转染野生型PTPA （wtPTPA）质粒三孔，pcDNA3.1质粒三孔作为野生型的对照；转染pSUP-siPTPA 三孔，pSUP、pSUP-siC质粒作为pSUPC-siPTPA的对照。
具体方法如下：将培养瓶中细胞接种入六孔板中，细胞生长至70%-80%丰度时转染，转染方法参照Lipofectamine TM 2000试剂盒说明书上进行，操作如下：1) 取出已接种了细胞的六孔板，吸弃旧培养基，加入800 μl不含血清和抗生素
的DMEM；
2) 取二只EP管，分别将1 μg的质粒和2μl Lipofectamine TM 2000稀释到100 μl
Opti-MEM，轻柔摇动混匀，室温下静置5分钟；
3) 将这两管已稀释的 Lipofectamine TM 2000和已稀释的DNA试剂在室温下混
匀，孵育20分钟，得到DNA－Lipofectamine TM 2000复合体；
4) 向已接种了细胞的六孔板每孔缓慢滴入200 μl DNA－Lipofectamine TM 2000
复合体，轻摇培养板混匀，37°C孵育6小时，换含有血清的培养基；
5) 5% CO2、37°C培养箱中培养24-48小时，提取细胞蛋白。
七、免疫印迹技术
（1）样品的制备
1) 弃去给予相应处理后六孔板细胞的培养基，用1ml预冷的PBS洗两次；
2) 弃净板内液体，每孔加入100 μl 1×上样buffer（0.1 M Tris, pH 6.8, 4% SDS,
20%甘油），用细胞刮匙刮下细胞并转移至EP管中，沸水浴10分钟；
3) 超声10次、2秒后进行蛋白质含量测定。
（2）BCA法测定样品蛋白质含量
1) 用BSA配置6个标准蛋白，浓度分别为：0 μg/μl、1 μg/μl、2 μg/μl、4 μg/μl、8
μg/μl、16 μg/μl；
2) 将蛋白样品和6个标准蛋白分别加入96孔板内（2 μl/孔），各设3个平行孔；
3) 按50:1比例将试剂盒中A液和B液进行混合，将混合液加入96孔板中，每孔加98μl；
4) 避光37°C孵育30分钟；
5) 用酶标仪检测各个孔的OD562；
6) 根据标准蛋白的浓度和相应的OD值计算直线回归方程，根据蛋白样品OD 值，利用回归方程计算出样品蛋白的浓度。
（3）免疫印迹法
1) 微型电泳胶的制备
10 %的聚丙烯酰胺分离胶和4%的聚丙烯酰胺浓缩胶配方如下表2：
表2 分离胶和浓缩胶配方
10%分离胶（μl）4%分离胶（μl）40% arc/bis 1000 200
1.5 M Tris pH 8.8 1000 ------
0.5 M Tris pH 6.8 ----- 250
H2O 1966 1500
20% SDS 20 10
TEMED 4 2
10% AP 10 28
总体积 4 000 2 000
2）样品的处理及上样
BCA法测定蛋白浓度后，剩余的样品加入3%溴酚蓝和6% ?-巯基乙醇，10０°C沸水浴10 min。在振荡器上振荡10秒钟，稍离心后用微量加样
器取样品加入各个泳道，加样体积由蛋白样品浓度算出，保证各组上样量一致；
3）蛋白的电泳分离
加样后恒流（20 mA）电泳约30 min，待指示剂溴酚蓝电泳至浓缩胶与分离胶交界处时，改为恒压（100 V）电泳约90 min 至溴酚蓝至凝胶底
部。电泳缓冲液为：250 mM 甘氨酸，50 mM Tris-Cl（pH 8.3），0.1% SDS；4）转膜
将蛋白质从SDS-PAGE凝胶转移至NC膜上，转移电流为恒流275 mA, 电压一般在80-120 V，转移时间为1 h。转移缓冲液：192 mM 甘氨酸，25 mM Tris-Cl （pH8.3），20%甲醇（临用前加入）
2 将NC膜用含3-5%脱脂奶粉的TBS封闭液于室温缓慢振荡封闭1小时；
2 取出NC膜，加入适当稀释过的一抗（一抗稀释液为含3% BSA的TBS，加入
0.02% NaN3，所用抗体的特性和稀释度见表1），4°C孵育过夜；
2 TBS缓冲液（100 mM NaCl ，50 mM Tris-Cl, PH 7.4）洗膜3次，每次10分钟；2 滴加近红外荧光染料标记的羊抗兔或羊抗鼠二抗（稀释倍数1:20000），37°C 避光孵育1小时；
2 TBS缓冲液洗膜3-5次，每次10分钟；
2 用odyssey红外双色激光成像分析系统检测灰度值。
八．细胞免疫荧光双标
（1）将HEK293/tau细胞接种于放有盖玻片（免洗盖玻片泡75%酒精，高压灭菌后用消毒镊子铺于培养板）的12孔板内（细胞密度不要太高，控制在40-50%丰度，以防影响细胞形态）；
（2）细胞处理完毕后用1*PBS（过滤PBS可使背景干净）液洗二次；加洗涤液时应沿孔壁缓慢加入，防止速度过快或者垂直打入是贴壁细胞悬浮，脱离盖玻片，同时也应避免细胞干涸，死亡；
（3）加现配的甲醛固定15-20分钟；
（4）用含1%TritonX-100 的1×PBS冲洗3次，每次5分钟；
（5）含0.5%TritonX-100 的1×PBS破膜10-20分钟；
（6）用含1%TritonX-100 的1×PBS冲洗3次，每次5分钟；
（7）用5%BSA（用1×PBS稀释）于室温下封闭30-60分钟（或4°C封闭过夜）；
倾去封闭液，加入适当稀释的一抗，过夜；
（8）回收一抗，加入另一种稀释过的一抗，过夜；
（9）按之前加一抗的时间顺序分别加入二抗，分别37°C避光孵育1小时；（10）1×PBS漂洗3次，每次10分钟；
（11）将盖玻片细胞面朝下盖在滴有50%甘油-1×PBS的载玻片上，贴片后应避光平放10-15分钟防止马上放在盒片中时滑脱，在双光子共聚焦显微镜下观察照相。
九、磷酸酯酶-2A（PP2A）活性测定
采用Serine/Threonine Phosphatase Assay System
（1）样品的制备及柱子的预处理
1）往培养板每孔加入100 μl 磷酸酯酶储存缓冲液，在冰上用细胞刮子刮取蛋白；
冰上消化30分钟；
2）4°C15,000 g离心10分钟；小心取出上清；
3）10 ml去离子水过柱子；
4）重悬Sephadex G-25 resin，动作轻柔，切忌用涡旋或磁力搅拌器重悬；
5）取10 ml重悬液到柱子通过重力的作用过滤到50 ml管内，弃掉过滤液；
6）柱子加10 ml预冷磷酸酯酶储备液；
7）弃掉滤出液，4°C，600 g，离心5分钟使液体排干净；
8）将柱子连接到配套的50 ml收集管上，加250 μl细胞裂解液；
9）4°C，600 g,离心5分钟收集滤出液。
（2）酯酶活性测试
1）用去磷酸盐水溶解1 mM 的磷酸盐标准品生成合适的磷酸盐标准品溶液（1: 20稀释标准品生成的溶液为含５×１０－６ mM的磷酸盐溶液），在孔中分别加入0，100，200，500，1000和2000 pM的去磷酸盐溶液和1×反应缓冲溶液，定容至50 μl用于制作标准曲线；
2）在96孔板中制备不含样品的反应预溶液，此溶液的配方如下：10 μl的磷酸酶5*反应溶液，5 μl 1 mM 的磷肽，避免产生气泡；
3）将96孔板置于合适的反应温度中孵育3分钟；
4）将1-35 μl的酶样品和适当的反应溶液加于孔中开始反应并孵育合适的时间。
对照包括不含酶样品或不含底物的溶液，反应在步骤5所描述的零点终止；5）用预先配好的50ul Molybdate Dye/Additive mixture 终止反应溶液，此混合溶液具有强酸性，因此能够终止酶反应并观察到精确的零点；
6）将96孔板置于室温孵育15分钟（若蛋白大于5 μg，应孵育30分钟，因为高浓度蛋白会延迟显色）；
7）用酶标仪于630 nm测吸光值。
十、细胞总RNA的提取及反转录聚合酶链式扩增技术（RT-PCR）
（1）用Trizol试剂从细胞内提取总RNA
1) 去掉六孔板培养基，用1 ml DEPC?生理盐水洗三次，加入1 ml Trizol将帖
壁细胞吹下转入1.5 ml EP管中；
2) 颠倒混匀，冰上静置5分钟使其充分裂解；
3) 加入200 μl氯仿，上下剧烈震荡约15秒，冰上静置5分钟，4°C、12，000 rpm
离心15分钟；
4) 小心吸取上层水相约400 μl至1.5 ml EP管内，加入500 μl异丙醇，轻柔翻
转混匀，-20°C静置2小时；
5) 4°C、12,000 g离心15分钟，此时管底可见白色絮状沉淀；
6) 弃上清，沉淀用预冷的75%乙醇200 μl洗一次，10,000 g离心5分钟，弃上
清，沉淀在通风橱中室温下干燥，加入30 μl DEPC?ddH2O，55~60°C水浴5~10分钟溶解沉淀；
7) 取2 μl提取的总RNA溶于200 μl DEPC?ddH2O中，用紫外分光光度计测定
其纯度与浓度。
（2）逆转录（RT）
逆转录体系（25 μl）：
10 mM dNTPs 4.0 μl
RNase inhibitor 0.5 μl
Oligo dT/Random Primer 0.5 μl
Total RNA 3.0 μg
PCR管稍离心，集液于管底，在PCR仪上70℃孵育5分钟，冰浴迅速冷却，接着加入：
5×逆转录buffer 5.0 μl
M-MLV（最后加） 1.0 μl
DEPC？ddH2O 加至总体积 25 μl
PCR管稍离心，在PCR仪上37℃孵育60分钟，90°C孵育5分钟，冰浴迅速冷却，-20°C保存
（3）PCR扩增
磷酸化是最重要的蛋白质翻译后修饰之一, 白质磷酸化和去磷酸化为...
摘要 磷酸化是最重要的蛋白质翻译后修饰之一，蛋白质磷酸化和去磷酸化为真核细胞提供了调节机制。随着高通量鉴定磷酸化蛋白质技术的发展，尤其是质谱技术在蛋白质组学中的应用，磷酸化修饰数据不断积累，从现有数据中挖掘规律从而对未知蛋白质进行磷酸化修饰位点预测的条件日益成熟。将计算方法引入磷酸化蛋白质组学的研究中，将有利于发现新的磷酸化修饰规律并为生物学实验提供验证信息，从而推动磷酸化蛋白质组学的发展。 计算智能领域的方法可以很好地应用于位点预测问题。但对于生物信息学来说，除了给出较为准确的预测结果外，还需要给出对判断结果易于理解的解释才能够增加预测方法的可信度。规则抽取不但可以提供合理的解释来指导生物学实验，而且可以从现有数据中发现新的具有生物学意义的磷酸化修饰规律为磷酸化蛋白质的进一步研究提供有价值的参考信息。 本文深入分析了磷酸化修饰位点数据的特点，采用支持向量机分类方法试验和比较了多种特征构造提取、特征选择和分类方法的有效性；提出用AdaBoost 方法对筛选后的氨基酸性质和邻近序列位置进行特征选择并进行分类器训练，形成了新的磷酸化位点预测算法AproPhos，该算法在特异性高于已有预测算法（约2个百分点）的基础上，大大提高了预测的灵敏度（约10个百分点）。同时设计了一种新的基于AdaBoost方法的规则抽取方法，可以给出可理解的修饰位点邻近序列上氨基酸性质分布规律，并对分类结果进行解释。AproPhos及其规则抽取算法扩展了磷酸化位点预测方法在实际中的应用范围，既可以用于提供充分信息的位点预测，又可以用来提高磷酸化蛋白质质谱鉴定效率。 最后本文提出了一种利用串联质谱同位素信息进行分子式预测的算法和系统FFP(Fragment ion Formula Prediction)，无论从计算效率上还是预测精度上较以前的方法都有了很大的提高。使分子式预测可以广泛用于质谱的预处理和蛋白质（包括磷酸化蛋白质）的鉴定，提高鉴定效率。 关键词：磷酸化，位点预测，规则抽取，SVM，AdaBoost
蛋白质磷酸化概述
蛋白质磷酸化概述 蛋白质磷酸化是敏感而可逆地调节蛋白质功能的一种最常见和最重要的机制，是调节细胞增值的基础。很多多肽生长因子(血小板来源的生长因子和表皮生长因子)和细胞因子(白细胞介素-2、集落刺激因子-2和γ-干扰素)在与其受体结合后均激发磷酸化作用，而这些被诱导的磷酸化反过来激活细胞质内的蛋白激酶如raf、MEK和MAP。此外，在所以有核生物中，细胞周期中G1/S期和G2/M期的转换均受依赖细胞周期蛋白的蛋白激酶(CDK)的调节。磷酸化作用也控制着分化和发育，如果蝇视网膜的R7细胞和秀丽新小杆线虫(Caenorhabditis elegans)的阴门发育受控于受体蛋白激酶和胞内蛋白激酶。最后，新陈代谢受磷酸化作用的调节控制，尤其是葡萄糖和糖元的相互转换及葡萄糖的转运的代谢作用。因而，形形色色的生物学家为了弄清楚他们最感兴趣的基因及其编码产物的调控和功能，他们常常不约而同，有时还是不由自主地必须蛋白质地磷酸化。 研究蛋白质磷酸化最常用地方法是利用32P标记的无机磷酸盐（32Pi）进行生物合成标记。这种方法非常简单，而只将标记物中加入到培养基中。在节中描述了用32Pi进行生物成标记的一般方法。该方法能达到最大限度的提高掺入效率和降低放射性对工作人员的伤害及对设备的污染。 大多数蛋白质是在丝氨酸和苏氨酸残基上磷酸化，而许多与信号传导有关的蛋白质还在酪氨酸位置上被磷酸化。这三种羟基磷酸氨基酸在
酸性PH条件下化学性质稳定，酸水解后它们可被回收并被直接鉴定出来。在节中介绍了通过酸水解和双向薄层电泳鉴定磷酸丝氨酸、磷酸苏氨酸和磷酸酪氨酸的技术。蛋白质也可在组氨酸、半胱氨酸和天冬氨酸位置上与磷酸共价键合，它们可以是以磷酸－酶的中间体或稳定修饰物的形式存在，这些磷酸氨基酸在酸性条件下不稳定，不能用对酸稳定磷酸氨基酸的标准技术来研究，它们只能通过排除法或演绎法来鉴定。研究这些酸不稳定的氨基酸已超出本书的范围，读者可以参考《酶学方法》（Methods in Enzymolcgy）第200卷有关鉴定这些新磷酸氨基酸的技术。 磷酸酪氨酸不是含量丰富的磷酸氨基酸，因而一般很难在用32Pi标记的样品中检出，尤其是当样品中含有大量在丝氨酸残基上磷酸化的蛋白质或有RNA污染时则更难。凝胶电泳分级后的样品以碱处理，使RNA水解并使磷酸丝氨酸脱磷酸，可以大大提高磷酸酪氨酸和磷酸苏氨酸的检出率，在节中描述一种碱处理的简单方法。 如果蛋白质被磷酸化，无需借助生物合成标记方法也可鉴定磷酸氨基酸。例如，蛋白质中所含的稀有的磷酸酪氨酸可用抗磷酸酪氨酸的抗体来检测，其特异性和敏感性相当高。更普遍的是，蛋白质的磷酸化常常使蛋白质在SDS－聚丙烯酰氨凝胶电泳中的迁移率发生变化，而且几乎总是改变它的等电点。将蛋白质和磷酸酶共同温育后，从凝胶迁移率的变动可以推论出非标记蛋白质存在磷酸化残基。这种方法在内源性ATP以[γ-32P]ATP进行标记的效率很差时很实用，如目的蛋白是来源于某些难以进行生物合成标记的组织或来源于体外翻译的情
蛋白质磷酸化1
浅谈蛋白质磷酸化 摘要：蛋白质翻译后修饰几乎在所有的蛋白质上都会发生，被修饰后的蛋白质功能将会发生显著的变化。而蛋白质磷酸化是最常见、最重要的一种蛋白质翻译后修饰方式，在蛋白质翻译后修饰研究中有着重要地位，它参与和调控生物体内的许多生命活动。随着蛋白质组学技术的发展和应用，蛋白质磷酸化的研究越来越受到广泛的重视。本文主要介绍了蛋白质磷酸化的主要知识，主要类型与功能，以及研究蛋白质磷酸化的主要目的，最后简单了提到了预测蛋白质磷酸化位点的方法。 关键词：蛋白质修饰；蛋白质磷酸化；磷酸化位点预测 随着基因组计划基本完成，生命科学研究已进入后基因时代，主要研究对象是功能基因组学，包括结构基因组研究和蛋白质组研究等。蛋白质组研究的开展不仅是生命科学研究进入后基因组时代的里程碑，也是生命科学研究的核心内容。传统的蛋白质研究注重研究单一蛋白质，而蛋白质组学注重研究参与特定生理或病理状态的所有的蛋白质种类及其与周围环境（分子）的关系。它的研究内容包括：（1）蛋白质鉴定；（2）蛋白质翻译后修饰的研究；（3）蛋白质结构研究；（4）蛋白质细胞内定位及功能确定；（5）发现药物靶分子及制药等。 早期蛋白质组学的研究范围主要是指蛋白质的表达模式，随着学科的发展，蛋白质组学的研究范围也在不断完善和扩充。蛋白质翻译后修饰研究已成为蛋白质组研究中的重要部分和巨大挑战。所谓蛋白质翻译后修饰指的是蛋白质折叠过程中和折叠过程后再多肽链上发生的共价反应，使蛋白质质量发生改变并且赋予蛋白质各种功能。 一、蛋白质磷酸化的概述 蛋白质的磷酸化反应是指通过酶促反应把磷酸基团从一个化合物转移到另一个化合物上的过程,是生物体内存在的一种普遍的调节方式，在细胞信号的传递过程中占有极其重要的地位。已经发现在人体内有多达2000个左右的蛋白质激酶和1000个左右的蛋白质磷酸酶基因。蛋白质的磷酸化是指由蛋白质激酶催化的把ATP或GTP上γ位的磷酸基转移到底物蛋白质氨基酸残基上的过程，其逆转过程是由蛋白质磷酸酶催化的，称为蛋白质脱磷酸化。蛋白质的磷酸化修饰是生物体内重要的共价修饰方式之一。其磷酸化和去磷酸化这一可逆过程,受蛋白激酶和磷酸酶的协同作用控制.酶蛋白的磷
论述蛋白质磷酸化与去磷酸化在细胞信号系统传导中的作用及研究进展
论述蛋白质磷酸化与去磷酸化在细胞信号系统传导中的作用及研究进展 病毒所梁晓声200628012415030 细胞信号传导过程中磷酸酶/磷酸激酶对蛋白磷酸化程度的调控控制了细胞信号传递与否，信号强度等等细胞信号传导的过程从某种程度上说就是信号传导相关分子磷酸化水平的调节过程。 磷酸酶/磷酸激酶作为胞内信号直接或间接的靶酶通过磷酸化程度控制其它酶类或蛋白质的活性，一般情况下被磷酸化的酶有活性，脱磷酸后的酶没有活性。通过这种方式可以在不改变细胞内酶或相关蛋白的浓度的情况下将部分酶活冻结或解冻。在有外界信号刺激的时候可以迅速解冻酶活而不必合成新的酶。 由于酶反应具有高度专一性，使得蛋白质磷酸化与去磷酸化这种方式在胞内介导胞外信号时具有专一应答的特点。这就使得细胞信号传导途径的上游成分只能针对一个或几个的下游成分起作用,使信号传递具有很强的专一性。同时对信号的灭活也不会由于识别的错误而影响其他信号传导途径。 磷酸化与去磷酸化在细胞对外界信号的持续反应中具有重要的作用。信号引起的细胞生理学效应中，有许多是相当持久的，如细胞的分裂、分化等。虽然胞内信号分子的寿命可以很短，但蛋白激酶一旦激活，其活性却可以通过某些方式（如自身磷酸化）维持较长时间；更重要的是被它磷酸化所调节的蛋白质和酶类，其效应可以维持更长时间，直到被蛋白磷酸酶脱磷酸化为止。 蛋白磷酸化对外界信号具有放大作用，由于是酶促反应，一个酶分子可以催化成百上千个底物分子，即使只有很弱的胞外信号也可以通过酶促反应得到充分的放大。 蛋白质激酶 蛋白质激酶是一类磷酸转移酶，其作用是将ATP的磷酸基转移到它们的底物上特定氨基酸残基上去。依据这些氨基酸残基的特异性，将这些激酶分为4类。其中主要的两类是蛋白质丝氨酸/苏氨酸激酶(STK),和蛋白质酪氨酸激酶(PTK)。这两类酶的蛋白质激酶结构域的大小约为250-300个氨基酸残基。二者的催化域在进化上是密切相关的，并认为它们有共同的祖先。因此，它们的催化域的氨基酸残基序列在很大程度上也是一致的。更重要的是，这些序列表现为一组组高度保守的，甚至是完全保守的氨基酸模体，这些模体却嵌埋在氨基酸残基序列保守性很差的区域之内。一共有11种这类高度保守的短氨基酸残基序列模体。它们都以罗马数字命名，从最N-端的I开始,到最C-端的XI。对这些酶的结晶进行X-射线结构分析，发现这些模体对这些蛋白质激酶催化结构域的磷酸转移酶活性十分重要。据以为，亚域I,II和VII在结合ATP中起重要作用；而亚域VIII则在识别肽底物中起主要作用。对酪氨酸激酶家族来说，在亚域VIII中，紧靠关键模体上游的氨基酸残基有十分有趣的差异，它们是-KWTAPE- 或-KWMAPE-，看来这些序列造成了激酶家族的这个分支的底物专一性。 蛋白磷酸酯酶 丝氨酸／苏氨酸蛋白磷酸酯酶，选择性地作用于含磷酸丝氨酸或磷酸苏氨酸残基的肽链，使之脱去磷酸基团并改变生物活性。主要成员：PPl，PP2A，PP2B，PP2C等。 酪氨酸蛋白磷酸酯酶(PTPase)分胞质型(非受体型)和受体型(PTPR)
磷酸化蛋白质组学常用分析和定量方法
蛋白质的磷酸化修饰是生物体内重要的共价修饰方式之一。蛋白质的磷酸化和去磷酸化这一可逆过程几乎调节着包括细胞的增殖、发育、分化、信号转导、细胞凋亡、神经活动、肌肉收缩及肿瘤发生等过程在内的所有生命活动。目前已知有许多人类疾病是由于某些异常的磷酸化修饰所引起，而有些磷酸化修饰却是某种疾病所导致的后果。在哺乳动物细胞生命周期中，大约有1/3的蛋白质发生过磷酸化修饰；在脊椎动物基因组中，有5%的基因编码的蛋白质是参与磷酸化和去磷酸化过程的蛋白激酶和磷酸（酯）酶。磷酸化修饰本身所具有的简单、灵活、可逆的特性以及磷酸基团的供体ATP的易得性，使得磷酸化修饰被真核细胞所选择接受而成为一种最普遍的调控手段。鉴于磷酸化修饰在生命活动中所具有的重要意义，探索磷酸化修饰过程的奥秘及其对细胞功能的影响已成为众多生物化学家及蛋白组学家所关心的内容。用蛋白质组学的理念和分析方法研究蛋白质磷酸化修饰，可以从整体上观察细胞或组织中磷酸化修饰的状态及其变化，这对以某一种或几种激酶及其产物为研究对象的经典分析方法是一个重要的补充，同时提供了一个全新的研究视角，并由此派生出磷酸化蛋白质组学（phosphoproteomics）这一新概念。在蛋白质组学水平进行磷酸化蛋白质的分析定量研究已引起人们广泛关注，各种技术也相应地发展起来. 1.1 免疫亲和色谱 富集磷酸化蛋白质最简单的方法就是用识别磷酸化氨基酸残基的特异抗体进行免疫共沉淀，从复杂混合物中免疫沉淀出目标蛋白质。目前，仅有酪氨酸磷酸化蛋白质的单克隆抗体可以用来进行有效的免疫共沉淀。这是因为该抗体具有较强的亲和力和特异性，可以有效地免疫沉淀酪氨酸磷酸化的蛋白质。Imam-Sghiouar等人从B-淋巴细胞中通过免疫沉淀获得酪氨酸磷酸化的蛋白质，然后再用二维电泳分离技术并结合质谱分析方法，鉴定出多个与斯科特综合症相关的酪氨酸磷酸化的蛋白质。由于抗磷酸化丝氨酸和苏氨酸抗体的抗原决定簇较小，所以令抗原抗体的结合位点存在空间障碍，特异性较差。因此，目前采用磷酸化丝氨酸/苏氨酸的抗体来富集磷酸化蛋白质的研究相对较 少。 1.2 固相金属亲和色谱（IMAC） 固相金属亲和色谱（immobilized metal affinity chromatography, IMAC）是一项较为成熟的磷酸化多肽分离富集技术。它是利用磷酸基团与固相化的Fe3+、Ga2+和Cu2+等金属离子的高亲和力来富集磷酸肽。目前发展的高通量磷酸化蛋白质组分析途径主要采用IMAC亲和色谱-反相液相色谱-串联质谱-数据库检索联用的方法。Ficarro等人最先将IMAC富集技术应用到细胞系大规模磷酸化蛋白质组学的分析中，并从啤酒酵母中鉴定出了216个磷酸化肽段和383个磷酸化位点。该方法的优点在于对每个可溶磷酸肽，不管其长度如何，都有富集作用，而且IMAC柱洗脱下的样品可直接用于RP-HPLC分析，但有可能丢失一些与IMAC柱结合能力较弱的磷酸肽或某些因有多个磷酸化位点而难以洗脱的磷酸肽。另外，那些富含酸性氨基酸的非磷酸化肽段与固相金属离子也有结合能力，也可能被富集。为了解决IMAC柱的非特异性吸附的问题，可以采用对羧基进行酯化反应以及改变洗脱液的体系等方法来提高IMAC 柱的特异性。此外，自动化IMAC- capillary RP HPLC-ESI MS/MS技术平台的研究开发，使磷酸肽的富集、反相分离和质谱检测都能自动在线进行，为IMAC在蛋白质组学中的高通量应用开辟了道路。 1.3 TiO2色谱 近期金属氧化物亲和富集技术得到了人们极大的关注。2004年，Pinkse等人将二氧化钛（TiO2）技术引进磷酸化蛋白质组学领域，利用TiO2与磷酸肽上磷酸基团的亲和能力实现对磷酸肽的相对富集，并建立了通过TiO2作为预分离的2D-NanoLCESI-MS/MS 技术平台。虽然该技术在对磷酸化肽段富集时的选择性和灵敏度方面都优于IMAC技术，但仍然存在非特异性吸附等问题。后来，人们又利用纳米材料比表面积大的特点，对TiO2纳米级材料进行了开发
分子生物学---11蛋白质磷酸化和信号转导
蛋白质磷酸化和信号转导 一、蛋白质磷酸化过程和功能 1、蛋白质磷酸化p r o t e i n p h o s p h o r y l a t i o n （1）过程： P r o t e i n k i n a s e(蛋白激酶) P r o t e i n p h o s p h o r y l a t e d p r o t e i n A T P A D P P h o s p h a t a s e（磷酸酶） P i （2）主要磷酸化位点（对有-O H的氨基酸进行磷酸化） 丝氨酸（S e r）/苏氨酸（T h r）:磷酸化之后电荷发生变化使蛋白质活性改变 酪氨酸（T y r）:磷酸化之后通常招募其他蛋白因子，使下游蛋白质活性改变 （3）蛋白质磷酸化的功能 生物热力学；蛋白质降解；酶活性的调控（激活o r抑制）；蛋白质相互作用 2、重要的蛋白激酶 （1）C D K s：c y c l i n-d e p e n d e n t k i n a s e周期蛋白依赖性蛋白激酶，属于一组调控细胞周期的S e r/T h r蛋白激酶，和周期蛋白c y c l i n协同作用发挥激酶活性，作用于细胞周期的不同阶段 （2）R T K s：R e c e p t o r T y r o s i n K i n a s e受体酪氨酸激酶，是具有酪氨酸激酶活性的受体，如E G F R（表皮生长因子受体） （3）C y t o p l a s m i c P r o t e i n-T y r o s i n e K i n a s e s：非受体酪氨酸激酶，存在于细胞质中，大部分结构中存在S H2、S H3结构域，是磷酸化的结合位点。如S r c、J A K、 F A K等 二、信号转导 1、信号转导的种类 E n d o c r i n e（内分泌）：激素 P a r a c r i n e（旁分泌）：神经递质 A u t o c r i n e（自分泌）：生长因子 2、信号转导的步骤 （1）信号分子的合成 （2）信号分子释放 （3）信号分子传导 （4）信号分子与受体结合 （5）激活细胞内信号通路 （6）细胞内信号传导
磷酸化蛋白质组学常用定量方法介绍
磷酸化蛋白质组学常用定量方法介绍 蛋白质的磷酸化修饰是生物体内重要的共价修饰方式之一。蛋白质的磷酸化和去磷酸化这一可逆过程几乎调节着包括细胞的增殖、发育、分化、信号转导、细胞凋亡、神经活动、肌肉收缩及肿瘤发生等过程在内的所有生命活动。目前已知有许多人类疾病是由于某些异常的磷酸化修饰所引起，而有些磷酸化修饰却是某种疾病所导致的后果。在哺乳动物细胞生命周期中，大约有1/3的蛋白质发生过磷酸化修饰；在脊椎动物基因组中，有5%的基因编码的蛋白质是参与磷酸化和去磷酸化过程的蛋白激酶和磷酸（酯）酶。磷酸化修饰本身所具有的简单、灵活、可逆的特性以及磷酸基团的供体ATP的易得性，使得磷酸化修饰被真核细胞所选择接受而成为一种最普遍的调控手段。鉴于磷酸化修饰在生命活动中所具有的重要意义，探索磷酸化修饰过程的奥秘及其对细胞功能的影响已成为众多生物化学家及蛋白组学家所关心的内容。用蛋白质组学的理念和分析方法研究蛋白质磷酸化修饰，可以从整体上观察细胞或组织中磷酸化修饰的状态及其变化，这对以某一种或几种激酶及其产物为研究对象的经典分析方法是一个重要的补充，同时提供了一个全新的研究视角，并由此派生出磷酸化蛋白质组学（phosphoproteomics）这一新概念。在蛋白质组学水平进行磷酸化蛋白质的分析定量研究已引起人们广泛关注，各种技术也相应地发展起来。 1. 磷酸化蛋白质和磷酸肽的富集 1.1 免疫亲和色谱 富集磷酸化蛋白质最简单的方法就是用识别磷酸化氨基酸残基的特异抗体进行免疫共沉淀，从复杂混合物中免疫沉淀出目标蛋白质。目前，仅有酪氨酸磷酸化蛋白质的单克隆抗体可以用来进行有效的免疫共沉淀。这是因为该抗体具有较强的亲和力和特异性，可以有效地免疫沉淀酪氨酸磷酸化的蛋白质。Imam-Sghiouar等人从B-淋巴细胞中通过免疫沉淀获得酪氨酸磷酸化的蛋白质，然后再用二维电泳分离技术并结合质谱分析方法，鉴定出多个与斯科特综合症相关的酪氨酸磷酸化的蛋白质。由于抗磷酸化丝氨酸和苏氨酸抗体的抗原决定簇较小，所以令抗原抗体的结合位点存在空间障碍，特异性较差。因此，目前采用磷酸化丝氨酸/苏氨酸的抗体来富集磷酸化蛋白质的研究相对较 少。 1.2 固相金属亲和色谱（IMAC） 固相金属亲和色谱（immobilized metal affinity chromatography, IMAC）是一项较为成熟的磷酸化多肽分离富集技术。它是利用磷酸基团与固相化的Fe3+、Ga2+和Cu2+等金属离子的高亲和力来富集磷酸肽。目前发展的高通量磷酸化蛋白质组分析途径主要采用IMAC亲和色谱-反相液相色谱-串联质谱-数据库检索联用的方法。Ficarro等人最先将IMAC 富集技术应用到细胞系大规模磷酸化蛋白质组学的分析中，并从啤酒酵母中鉴定出了216个磷酸化肽段和383个磷酸化位点。该方法的优点在于对每个可溶磷酸肽，不管其长度如何，都有富集作用，而且IMAC柱洗脱下的样品可直接用于RP-HPLC分析，但有可能丢失一些与IMAC柱结合能力较弱的磷酸肽或某些因有多个磷酸化位点而难以洗脱的磷酸肽。另外，那些富含酸性氨基酸的非磷酸化肽段与固相金属离子也有结合能力，也可能被富集。为了解决IMAC柱的非特异性吸附的问题，可以采用对羧基进行酯化反应以及改变洗脱液的体系等方法来提高IMAC柱的特异性。此外，自动化IMAC- capillary RP HPLC-ESI MS/MS技术平台的研究开发，使磷酸肽的富集、反相分离和质谱检测都能自动在线进行，为IMAC在蛋白质组学中的高通量应用开辟了道路。
磷酸化
磷酸化（phosphorylation ）：生物分子结合磷酸基团的过程。 磷酸化是将磷酸基团加在中间代谢产物上或加在蛋白质（protein）上的过程。磷酸基团的添加或除去（去磷酸化）对许多反应起着生物“开/关”作用。磷酸基团的添加或除去能使酶（enzyme）活化或失活，控制诸如细胞分裂这样的过程。添加磷酸基团的酶称为激酶（kinases）；除去磷酸基团的酶称为磷酸酶。 磷酸化就是通过磷酸转移酶在底物上加上一个磷酸基团。 光合磷酸化（photophosphorylation）：在光照条件下，叶绿体将ADP和 无机磷(Pi)结合形成ATP的生物学过程。是光合细胞吸收光能后转换成化学 能的一种贮存形式。 氧化磷酸化（oxidative phosphorylation）：物质在体内氧化时释放的能量供给ADP与无机磷合成ATP的偶联反应。主要在线粒体中进行。 底物水平磷酸化（substrate level phosphorlation）：物质在生物氧化过程中，常生成一些含有高能键的化合物，而这些化合物可直接偶联ATP或GTP的合成，这种产生ATP等高能分子的方式称为底物水平磷酸化 底物水平磷酸化不同于：氧化磷酸化（电子传递水平磷酸化） 1. 氧化磷酸化偶联在生物氧化过程中，代谢物脱下的氢经呼吸链氧化生成水时，所释放出的能量用于ADP磷酸化生成A TP。氧化是放能反应，而ADP生成ATP是吸能反应，这两个过程同时进行，即氧化时偶联磷酸化的过程称为氧化磷酸化。这种方式生成的ATP 约占ATP生成总数的80%，是维持生命活动所需能量的主要来源。 2. 电子传递链中A TP形成的部位 3. 影响氧化磷酸化的因素 （1）ATP与ADP的调节作用：ADP/ATP比值下降，说明细胞储备ATP较多，所以氧化磷酸化速度缓慢甚至停止。反之这个比值升高说明细胞需要ATP，于是氧化磷酸化加速进行。 （2）甲状腺素的调节作用：导致氧化磷酸化增强，促进物质氧化分解代谢，结果耗氧量和产热量均增加。故甲状腺机能亢进的病人常出现基础代谢率（BMR）增高、怕热，易出汗等症状。 （3）氧化磷酸化的抑制剂：氧化磷酸化的抑制剂主要有两类：一是抑制电子传递的抑制剂（呼吸链抑制剂）；另一类是使氧化磷酸化拆离的解偶联剂。呼吸链抑制剂的作用与一定部位的电子传递体结合而阻碍其电子传递。 氧化磷酸化解偶联剂不影响呼吸链的电子传递，但能减弱或停止ATP合成的磷酸化反应。最常见的解偶联剂是2，4-二硝基苯酚（DNP）。
磷酸化蛋白的研究进展
多学科的相互渗透和研究技术手段的高速发展，生命科学在20世纪取得了巨大的进步。特别是在基因组研究方面已取得了许多的成果，包括人类基因组在内的多种生物的基因组全序列测定已陆续完成，面对庞大的遗传信息，人们开始关注这些序列信息与生命活动之间的直接或间接的联系。基因的功能是什么？它们又是如何发挥这些功能的？ 蛋白质的磷酸化修饰是生物体内重要的共价修饰方式之一。蛋白质磷酸化是一种重要的翻译后修饰,它参与和调控生物体内的许多生命活动。随着蛋白质组技术的不断发展,蛋白质磷酸化的研究越来越受到广泛的重视。本文介绍了蛋白质磷酸化定义、修饰的主要类型与功能、磷酸化蛋白质鉴定技术、检测方法并综述了近年来国内外的主要研究进展。 蛋白质磷酸化：指由蛋白质激酶催化的把ATP或GTP上的磷酸基转移到底物蛋白质氨基酸残基上的过程，是生物体内一种普通的调节方式，在细胞信号转导的过程中起重要作用。
磷酸化蛋白质根据其磷酸氨基酸残基的不同大致可分为四类，即:O-磷酸盐、N-磷酸盐、酰基磷酸盐和S-磷酸盐。O-磷酸盐是通过羟氨基酸的磷酸化形成的,如丝氨酸、苏氨酸或酪氨酸,羟脯氨酸或羟赖氨酸磷酸化仍不清楚；N-磷酸盐是通过精氨酸、赖氨酸或组氨酸的磷酸化形成的；酰基磷酸盐是通过天冬氨酸或谷氨酸的磷酸化形成；而S-磷酸盐通过半胱氨酸磷酸化形成。 蛋白质磷酸化具有以下功能: (1) 磷酸化参与酶作用机制,在此过程磷酸化为反应性中间产物(多为S-或N-磷酸盐) ,如在磷酸烯醇型丙酮酸羧激酶依赖的磷酸转移酶系统( PTR) 的组氨酸蛋白激酶(HPr) 。 (2) 磷酸化介导蛋白活性,蛋白分子通过蛋白激酶发生磷酸化,如蛋白激酶A(丝氨酸和苏氨酸残基) 或不同的受体酪氨酸激酶(酪氨酸残基) 。 (3) 天冬氨酸、谷氨酸和组氨酸的磷酸化在细菌趋化反应的感觉性传导中发生解离。 [32 P]放射性标记法是最经典的磷酸化蛋白质检测方法。体内代谢培养用[32P]标记磷酸盐作为磷酸基团供体,被[32P]标记的蛋白质进行一维或二维凝胶电泳分离,用放射自显影或磷储屏检测磷酸化蛋白质。磷蛋白酸水解产物用二维磷酸肽作图法分析可以确定蛋白质的磷酸化氨基酸类型。磷蛋白水解肽段经HPLC分离,通过监测放射性活度收集到磷酸肽,用Edman测序或串联质谱分析都可以确定磷酸化位点,当然这需要有足够量的磷蛋白用于分析。早在1991年, Arrigo等就采用[32P]代谢标记和二维凝胶电泳分析的方法观察了细胞在耐热处理后再经热刺激和肿瘤坏死因子刺激后热休克蛋白hsp28磷酸化程度的变化,发现耐热处理后细胞在热刺激和肿瘤坏死因子刺激下所引起的hsp28的磷酸化程度会显著降低。[32P]放射性标记可以非常灵敏、直观地检测磷蛋白,尤其是与二维凝胶电泳结合后可以从蛋白质组的角度整体观察细胞内蛋白质磷酸化程度的变化,它的缺点是不能标记组织样本,并且存在放射性污染的问题。
蛋白质磷酸化对于许多生物现象的引发是很必要的,包括细胞
蛋白质磷酸化对于许多生物现象的引发是很必要的，包括细胞生长、增殖、泛素（ubiquitin）介导的蛋白降解等过程。特别是酪氨酸磷酸化，作为细胞信号转导和酶活性调控的一种主要方式，通常通过引发蛋白质之间的相互作用，进而介导生长因子、荷尔蒙和细胞因子等对细胞膜上受体的信号调控。 然而，酪氨酸磷酸化在细胞的所有磷酸化修饰中所占的比例却非常低。大概10%的细胞蛋白会受到磷酸化共价修饰，但每100次蛋白的磷酸化修饰中仅有1次酪氨酸基团的修饰。与大部分细胞中的丝氨酸和苏氨酸磷酸化水平相比，酪氨酸磷酸化的水平估计要低2000倍。正是由于细胞中酪氨酸磷酸化的水平相当低，才能保证细胞在内外信号的刺激下，作出灵敏的反应，所以研究酪氨酸的磷酸化对于细胞信号的调控和许多重要生物现象的研究具有极为重要的意义，而对发生酪氨酸磷酸化的蛋白质的识别及磷酸化位点的鉴定对揭示细胞过程的调控和药物的作用位点起到非常重要的作用。 研究蛋白质磷酸化的相关方法： 磷酸化Western Blot 对于信号转导科研来说，抗酪氨酸磷酸化抗体的出现是一个意义重大的事件。在没有抗酪氨酸磷酸化抗体之前，蛋白质和酶的酪氨酸磷酸化只能通过非常危险的并且很费时的放射性实验来检测。而利用抗酪氨酸磷酸化抗体，则可以通过Western Blot或其它免疫学方法轻松地检测到磷酸化信号。常规的检测方法包括：用抗酪氨酸磷酸化抗体在Western Blot上检测内源或外源表达的磷酸化蛋白。如果目标蛋白的含量较低，也可利用免疫沉淀的方法先富集发生磷酸化的酪氨酸蛋白，再检测目标蛋白的水平。抗酪氨酸磷酸化抗体也常用于检测在不同处理的条件下，细胞内总的酪氨酸磷酸化水平的变化情况，作为许多细胞生物现象的一个重要指标。 我们都知道如果需要检测某一个目标蛋白的某一特定位点的磷酸化状态，可以选用该蛋白特定位点的磷酸化特异性抗体。但由于我们研究的通常是新的磷酸化位点，或者这些蛋白特定位点的磷酸化抗体效果不够好，我们不得不自己制备磷酸化抗体。如果大家自己制备过磷酸化抗体，就会知道磷酸化抗体的制备比一般抗体的制备更加困难，而且浪费大量宝贵时间。现在国外的科学家发现可以使用通用型的磷酸化抗体，只要巧妙的设计实验，也可以达到同样的检测目的。以Yuan的文章为例，他们需要检测BCR-ABL的磷酸化，但他们没有特异性的磷酸化抗体。他们首先使用了抗c-ABL的抗体和蛋白G-琼脂糖珠子来免疫沉淀富集BCR-ABL蛋白，然后再通过Western-Blot和4G10通用型酪氨酸磷酸化抗体（pan-phosphotyrosine）来鉴定BCR-ABL蛋白的酪氨酸磷酸化水平。另外一组以Clemens 为首的科学家，则利用抗Dock蛋白抗体先免疫共沉淀了DACK蛋白，再用4G10酪氨酸磷酸化抗体来检测DACK蛋白和DSH3PX1蛋白的酪氨酸磷酸化水平，通过区分这些蛋白的分子量大小，来确认相应的磷酸化条带的蛋白身份。 与做普通的Western Blot相比，磷酸化Western Blot有一些要额外需要注意的事项： 首先，由于蛋白的磷酸化是可逆的，会被磷酸酶去磷酸化，所以在样品制备和整个免疫检测过程中，需要抑制或避免细胞内源性和外源性的磷酸酶的干扰。针对细胞内源性的磷酸酶，我们在样品制备时，需要在细胞裂解液中加入足量的并且是新鲜的磷酸酶抑制剂，如
综述蛋白质磷酸化在信号转导过程中的作用
蛋白质磷酸化在细胞内信号传导中的意义 摘要：生物体对环境(包括外环境和内环境)信号变化有极高的反应性。细胞对外界刺激的感受和反应都是通过信号转导系统的介导实现的。该系统由受体、酶、通道和调节蛋白等构成。通过信号转导系统、细胞能感受、放大和整合各种外界信号。蛋白质的可逆磷酸化在这一过程中起着至关重要的作用。 关键词：蛋白质磷酸化，细胞信号转导 Abstract：The organisms are very sensible to the changes of environmental signals(both external or internal) .The the feelings and reactions of the cells to the external stimulation are all dependent on the signal transduction system. The system consists of receptors, enzymes, channels and regulatory proteins. Acording to the signal transduction system, cells can feel, amplify and integrate a variety of external signals. Reversible protein phosphorylation plays an very important role in this progress. Key words: protein phosphorylation; cells signal transduction 生物体对环境(包括外环境和内环境)信号变化有极高的反应性。如精子获能的过程中精子周围环境因子以及活性氧的诱导作用等[1][2]。细胞对外界刺激的感受和反应都是通过信号转导系统(signal transduction system)的介导实现的。该系统由受体、酶、通道和调节蛋白等构成。通过信号转导系统、细胞能感受、放大和整合各种外界信号。蛋白质的可逆磷酸化在这一过程中起着至关重要的作用。 一细胞信号转导的概念和类型 1细胞信号转导的概念 细胞信号转导系统由能接受信号的特定受体( recep tor) 、受体后的信号转导通路以及其作用的终端所组成。细胞信号通过受体或类似于受体的物质激活细胞内的信号转导通路,触发离子通道的开放、蛋白质( p rotein) 可逆磷酸化反应以及基因( gene)表达改变等变化,进而导致一系列生物效应。不同的信号转导通路间具有相互的联系和作用,形成极其复杂的网络,主要包括物理信号、化学信号和生物信号[3][4]。
生物氧化与氧化磷酸化答案
生物氧化与氧化磷酸化 （一）名词解释 1．生物氧化（biological oxidation）物体内有机物质氧化而产生大量能量的过程称为生物氧化。生物氧化在细胞内进行，氧化过程消耗氧放出二氧化碳和水，所以有时也称之为“细胞呼吸”或“细胞氧化”。生物氧化包括：有机碳氧化变成CO2；底物氧化脱氢、氢及 电子通过呼吸链传递、分子氧与传递的氢结成水；在有机物被氧化成CO2 和H2O 的同时，释放的能量使ADP 转变成ATP。 2．呼吸链（respiratory chain）有机物在生物体内氧化过程中所脱下的氢原子，经过一系列有严格排列顺序的传递体组成的传递体系进行传递，最终与氧结合生成水，这样的电子或氢原子的传递体系称为呼吸链或电子传递链。电子在逐步的传递过程中释放出能量被用于合成ATP，以作为生物体的能量来源。 3．氧化磷酸化（oxidative phosphorylation）在底物脱氢被氧化时，电子或氢原子在呼吸链上的传递过程中伴随ADP 磷酸化生成ATP 的作用，称为氧化磷酸化。氧化磷酸化是生物体内的糖、脂肪、蛋白质氧化分解合成ATP 的主要方式。 4．三羧酸循环: 在线粒体内乙酰辅酶A与草酰乙酸缩合为柠檬酸，进行一系列反应又生成草酰乙酸，同时乙酰基被彻底氧化为CO2 和H2O，并产生大量能量的过程。 5．底物水平磷酸化（substrate level phosphorylation）在底物被氧化的过程中，底物分子内部能量重新分布产生高能磷酸键（或高能硫酯键），由此高能键提供能量使ADP（或GDP）磷酸化生成ATP（或GTP）的过程称为底物水平磷酸化。此过程与呼吸链的作用无关，以底物水平磷酸化方式只产生少量ATP。如在糖酵解（EMP）的过程中，3-磷酸甘油醛脱氢后产生的1,3-二磷酸甘油酸，在磷酸甘油激酶催化下形成ATP 的反应，以及在2-磷酸甘油酸脱水后产生的磷酸烯醇式丙酮酸，在丙酮酸激酶催化形成ATP 的反应均属底物水平的磷酸化反应。另外，在三羧酸环（TCA）中，也有一步反应属底物水平磷酸化反应，如α-酮戊二酸经氧化脱羧后生成高能化合物琥珀酰～CoA，其高能硫酯键在琥珀酰CoA 合成酶的催化下转移给GDP 生成GTP。然后在核苷二磷酸激酶作用下，GTP 又将末端的高能磷酸根转给ADP 生成ATP。 6．能荷（energy charge）能荷是细胞中高能磷酸状态的一种数量上的衡量，能荷大小可以说明生物体中ATP-ADP-AMP 系统的能量状态。能荷=([ATP]+ 1/2[ADP])/([ATP]+[ADP]+[AMP]) 7．糖异生:非糖物质（如丙酮酸乳酸甘油生糖氨基酸等）转变为葡萄糖的过程。 8．乳酸循环: 乳酸循环是指肌肉缺氧时产生大量乳酸，大部分经血液运到肝脏，通过 糖异生作用肝糖原或葡萄糖补充血糖，血糖可再被肌肉利用，这样形成的循环称乳 酸循环。 9．发酵: 厌氧有机体把糖酵解生成NADH 中的氢交给丙酮酸脱羧后的产物乙醛，使之 生成乙醇的过程称之为酒精发酵。如果将氢交给病酮酸丙生成乳酸则叫乳酸发酵。 10．糖酵解途径: 糖酵解途径指糖原或葡萄糖分子分解至生成丙酮酸的阶段，是体内糖 代谢最主要途径。 11．糖的有氧氧化: 糖的有氧氧化指葡萄糖或糖原在有氧条件下氧化成水和二氧化碳的 过程。是糖氧化的主要方式。 12．肝糖原分解: 肝糖原分解指肝糖原分解为葡萄糖的过程。 13．磷酸戊糖途径: 磷酸戊糖途径指机体某些组织（如肝、脂肪组织等）以6-磷酸葡萄 糖为起始物在6-磷酸葡萄糖脱氢酶催化下形成6-磷酸葡萄糖酸进而代谢生成磷酸 戊糖为中间代谢物的过程，又称为磷酸已糖旁路。
蛋白质可逆磷酸化
蛋白可逆磷酸化 ——1992年诺贝尔生理和医学奖简介 龚祖埙（中科院上海生物化学研究所）由于在蛋白质可逆磷酸化研究方面的贡献，1992年诺贝尔生理和医学奖授予美国西雅图华盛顿大学的两位生物化学家——克雷布斯（Edwin Krebs）和费歇尔（Edmon Fisher），诺贝尔奖委员会在宣布授予他们诺贝尔奖时宣称:“我们现在已确定在整个基因组内大约有1%的基因编码蛋白质激酶，这些激酶调节至细胞内成千上万蛋白质的功能”。的确，蛋白质可逆磷酸化及其有关的第二信使调控，蛋白质激酶和磷酸脂酶的研究已经成为当代生物化学、生理学、细胞生物学、分子生物学研究的一个最活跃最吸引人的研究领域。蛋白质可逆磷酸化和如此众多的生命过程相联系，诸如细胞生长，组织分化，基因表达，肌肉收缩，能量利用和肿瘤转化等，可以毫不夸张的说，它参与了每一个生物的“生”和“死”的过程。 50年代初，克雷布斯从事肌肉代谢的研究，当时对肌肉收缩的能量代谢很感兴趣，因此对肌肉内糖原酵解过程的调节给以特别注意。费歇尔博士当时在瑞士日内瓦大学从事植物酶学的研究。从1953年开始，由于共同的兴趣，他们在美国西雅图华盛顿大学开始携手合作，并且很快发现，磷酸酶在从高能化合物——腺苷三磷酸（ATP）处获得无机磷后，由非活性转化为火星状态。如果该酶在去磷酸化后，即蛋白质分子失去与其共价键结合的无机磷后，酶的活性又消失。正如细胞内其它所有的生物化学反应一样，蛋白质的可逆磷酸化反应也是由酶来调控的。因此他们的下不宜目标是寻找相应的酶，他们两人发现了第一个这样的酶，并称之为激酶（kinase）。激酶是负责蛋白质磷酸化的酶，以后他们又发现了去磷酸化的酶，并称之为磷酸酯酶。 回顾历史，在同一个研究方向或领域内，先后获得三次诺贝尔奖的可以说是绝无仅有的，而糖原酵解和蛋白质磷酸化的研究则是唯一的例外克雷布斯在40年代末期曾在美国圣路易斯的华盛顿大学医学院科里（Gerty Cori）实验室工作。而科里由于在糖原酵解研究中发现磷酸化酶的活性和非活性两种形式，于1947年获诺贝尔奖。尽管在当时尚不知这有两种形式的酶在结构上的差异。这一结构上的差异——即蛋白质可逆磷酸化正是在45年后授予克雷布斯和费歇尔诺贝尔奖的主题。在这长达近半个世纪的过程中，我们还应提起和磷酸化酶研究有关的另一个诺贝尔奖获得者——萨瑟兰（Earl Sutherland）。他也在颗粒实验室进行过研究，由于发现环腺苷酸（cAMP）作用而获得1971年的诺贝尔奖，这是和磷酸化酶有关的第二个诺贝尔奖，目前cAMP被广泛称为“第二信使”，在细胞功能的调控中，它的重要性是显而易见的。 1.蛋白质的可逆磷酸化 细胞内每时每刻进行着成千上万的生物化学过程，细胞又能够迅速对细胞内环境和外界刺激产生响应，这些过程都有一个复杂的调控机制，大多数是直接或间接地由蛋白质构象变化介导的，而蛋白质本身构想的变化则是由变构效应或各种修饰来实现的，如二硫键的配对，蛋白水解酶的加工，蛋白质的可逆磷酸化则是一种最常见，也是最重要的共价修饰方式。 蛋白质的磷酸化和去磷酸化常伴随着这一蛋白质生理活性的激活和失活，因此这是一个动态的过程。蛋白质的可逆磷酸化需有两种专一的酶来协助完成，磷
磷酸化
第二节蛋白质磷酸化 字体[大][中][小]蛋白质翻译后修饰是蛋白质化学研究的重要领域，对蛋白质结构的细节了解得越多，对蛋白质翻译后修饰的分类范围了解得也就越广。蛋白质修饰包括糖类、脂类、核酸、磷酸、硫酸、羧基、甲基、乙酰基、羟基等功能基团以共价键与蛋白质的连接。蛋白质经过修饰，在结合、催化、调节及物理性质等方面都被赋予了新的功能。蛋白质磷酸化是蛋白质翻译后修饰的重要内容，在酶和其它重要功能分子活性的发挥、第二信使传递和酶的级联作用中起到重要的作用。蛋白质磷酸化是在一系列蛋白激酶的作用下完成的，本节主要介绍蛋白磷酸激酶的分离与分析和磷酸化蛋白质的分析方法。 一、蛋白磷酸激酶的纯化与活性分析 蛋白磷酸激酶是能催化磷酸基团从磷酸供体转移到受体蛋白的酶，通常ATP的γ位磷酸(或其它三磷酸核苷)为供体。国际生物化学联合会根据受体氨基酸的特异性，将蛋白激酶分为以下几类：①以蛋白乙醇基作为受体的磷酸转移酶称为蛋白丝氨酸或苏氨酸激酶;②以苯基为磷酸受体的磷酸转移酶称为蛋白酪氨酸激酶;③以His，Arg或Lys为受体的磷酸转移酶称蛋白His激酶;④以Cys残基作为受体的磷酸转移酶称蛋白Cys激酶;⑤以乙酰基作为受体的磷酸转移酶称天冬或谷氨酰胺激酶。前两类酶最常见，许多蛋白丝/苏氨酸或酪氨酸激酶已被纯化。利用分子生物学技术，已克隆出100多个蛋白激酶的基因。有些已通过测定其核苷酸序列而推出其相应的氨基酸序列。在很多情况下，克隆的酶基因产物氨基酸受体特异性不能被直接测定，一般是通过序列分析与已知特异性的蛋白激酶比较而得出。所有已知的丝/苏和酪氨酸蛋白激酶都有一个共同的催化结构域(约270个氨基酸)，通过催化结构域的序列同源性比较，可将蛋白酪氨酸激酶家族分成若干亚家族。蛋白丝/苏氨酸激酶家族较酪氨酸激酶家族大。此外，还有许多有关His，Lys和Arg特异性磷酸化酶活性的报道，但这些酶未被纯化，其分子结构也不清楚。 (一)蛋白磷酸激酶的纯化蛋白激酶的纯化分微量纯化和大量纯化两种，前者通常应用在特殊条件下培养的细胞，后者一般应用于特殊的组织器官。微量纯化的优点是克隆化的细胞株具有均一的细胞类型并处于同步的细胞周期，细胞内成分可被放射性同位素特异标记，在细胞培养时加特殊因素可研究细胞内某些感兴趣的途径。缺点是原料少，纯化出的蛋白量有限。 对某种新的蛋白激酶的物理特性一般并不清楚，因此对未知蛋白激酶的纯化没有一个固定的程序。为了从有限的原材料中纯化蛋白激酶，通常采用的策略是：①在进行高效的亲和纯化以前采用传统的色谱方法去除含量最多的杂蛋白;②在纯化早期去除抑制剂和失活剂; ③处理体积应尽快减小并避免透析;④纯化步骤尽量快并避免冷冻。用于去除大量杂蛋白的传统色谱技术包括阳离子和阴离子交换、疏水和凝胶排阻色谱。这些技术在许多有关蛋白质纯化的书籍中都有详细介绍，酶纯化的理想方案应在各步骤间不经透析即能进行顺利过渡。如离子交换步骤以后进行疏水色谱;凝胶排阻色谱放在最后使蛋白质和盐分子分开，但要注意在凝胶排阻介质中加入0.2～0.5mol/L盐以防酶非特异地与介质结合或聚合。检查酶在离子交换和疏水柱上的结合和洗脱行为的最简单方法是根据酶的理化特性将少量介质与少部分蛋白激酶在合适的pH下混合，然后变化离子强度后分析上清中酶的活性。完成以上纯