荧光定量教程

用于检测细胞基因转录水平的实时定量 PCR的操作流程

（Real Time Quantitative PCR Protocol For Detection of Gene Expression）第一部分原理 real time PCR是普通 PCR的一项改进，使用了针对扩增 DNA的荧光物质，使得 DNA的数量与检测到的荧光强度成线性关系，大致得到 DNA的扩增曲线（如，

图一）。

图一：引自美国应用生物系统中国公司网站——实时荧光定量 PCR ——一种科学准确

的定量方法。名词解释： Rn:一个反应管经 n次热循环后，测得的荧光强度。 Rn+:反应管含有模板 DNA。 Rn-:反应管含有模板 DNA。无模板对照：No template control，Rn-，理想情况下，是一条平线，只具有背景荧光数值。 Threshold: 荧光（Rn）超过本底时的临界数值。 Ct: threshold cycle，临界循环数， threshold 横线与扩增曲线相交，所得交点所对应的循环数。基线：baseline, 是背景曲线的一段，范围——从反应开始不久荧光值开始变得稳定，直到所有反应管的荧光都将要，但是还

未，超出背景。

仪器：热循环仪器（ GeneAmp Thermal Cycler 9600）+电脑（装有 Sequence Detection System软件）+荧光检测系统(GeneAmp

Sequence Detector 5700)（如，图二）。

图二，引自https://www.360docs.net/doc/811456450.html,/。

全部实验包括步骤： 1，类似普通 PCR反应的物品混合于反应管，之外还要添加荧光物质（SYBR染料或 TaqMan探针）。 2，使用 SDS软件标明热循环仪器中放入的所有反应管，设定热循环仪器的温度变化，存储热循环仪器的工作情况，存储荧光信号，分析 DNA的扩增曲线。 3，利用 SDS输出的数据，其他专业数据处理软件，近似计算得到原始 DNA的浓度，做必要的误差分析。SYBR 是一种结合于所有 dsDNA双螺旋小沟区域的具有绿色激发波长的染料。 TaqMan探针是由产荧光基团，荧光淬灭基团，与

扩增子有互补的核苷酸序列组成。

GeneAmp 5700 Sequence Detector 总是在 PCR循环的退火 /延伸时间段依次收集反应馆的激发荧光强度。

Real time PCR 与普通 PCR的细节上的区别还有：使用持家基因作内部参比（ endogenous control/reference，是同一种 cDNA 中的比较，并不是同一反应管中作比较的意思）；推荐使用 ROX(具有红色激发波长的染料)来抵消荧光背景（本底）；用浓度（比较）确定的 DNA来做出标准曲线（Ct——log原始模板/DNA浓度）。具体情况将在操作流程中讲述。

本次实验的具体目的：测出 PTX, LPS刺激不同时间后，DC的基因转录变化，属于“relative quantitation (相对定量)”。

这个结果可以拿来与以前所做的 cDNA Microarray 结果（半定量）作比较，确认或修正之。

第二部分操作流程一仪器，用品，试剂

GeneAmp Thermal Cycler 9600 GeneAmp Sequence Detector 5700

电脑 Sequence Detection System软件数据处理软件（如，Excel）引物设计软件光学管子，optical tube and cap + 架子微量移液器（枪）+ 枪头（tip）离心机 + 螺旋振荡器冰箱冰盒一次性手套

琼脂糖凝胶电泳相关试剂

二前期准备细胞按要求培养，抽 RNA, 反转录为 cDNA。有细胞计数，测 RNA浓度（分光光度计）等环节。

选择反应物，待测样本：0hr, P4, L4, P12, L12, P24, L24, P36, L36 九种阴性对照：即无模板对照， NTC 作为标准的样品：如果有必要做标准曲线的话，选择一种比较容易准确定量的 DNA (如果是进行绝对定量分析，则需要浓度完全已知的 DNA标准品——要求：能够被引物所扩增，比如，其他种类细胞的 cDNA, 或，克隆有 DNA片段的质粒载体)。

选择引物（基因） endogenous control 使用的持家基因：GAPDH(甘油醛脱氢酶)，HPRT（为什么使用之？……）转录水平待测

的基因

因为每个反应管要做 3次重复以上，所以应该准备好充足量的 PCR试剂，推荐——先混合得到 Master Mix, 再分至各个反应

管。

三流程 1 标准曲线

2 待测 cDNA的 PCR扩增

※标准曲线和待测样品其实应该在同一次 real time PCR中做。第一次做的话，试验的成分更多些，所以，重复数应该大一些（ 4），这样就不得不把标准曲线和待测样品分开了。等到扩增曲线能够被完美地，轻松地得到后，就可考虑减少重复数（至

少 3吧），（5+1

）×3×2+（9+1）×3×2=96 非常巧合！96个孔全被使用了。

NTC

内参，待测 2引物标准样

但是，重复数越少，结果的可信性就越小，对实验曲线的完美度要求就更高。

四 SDS软件的使用 1 打开电脑，用户名：administrator 密码：5700 2 开启 5700，9600的电源 3 打开 SDS软件，

在“New Plate Application”中同时选定“5700”和“ 5700 quantitation”,点击“ OK”，建立了一个新文档。

出现“GeneAmp 5700 SDS Software[Plate1]”窗口，从 A-1到 H-12 96个方格代表了 Sample Block 中 96个加热（反应）孔，

位置是对应的。 4 选择样品（反应）类型和取名

选定将要设参数的方格（可多选），点“Type”下拉框，选定正确的样品类型： STND: standard UNKN: unknown NTC: no template control Not In Use:用于取消设定完成以后，样品类型的缩写显示在方格中。

选好方格后，在“Name”文本框中可输入合适的样品名字，如：0hr,P4,L4,……如果每个样品（STND，UNKN，NTC）做 4个重复，

则它们的名字必须相同。

5 设置引物/探针

选定方格（已经取好名字，类型），点击“P”按钮，打开“Primer/Probe Palette”对话框，根据缩写，引物 /探针名称，颜色，选定一栏（点击），于是 Primer/Probe颜色出现在方格底部。

如果“Primer/Probe Palette”中 Primer（可选项）不够或不合适，则可在 Setup菜单/ “Primer/Probe Setup”窗口中增加与修改，比如双击颜色条，弹出“选择颜色”窗口。最后设置完每个方格后，如果有多余（无用）的 Primers的话，在

“ Primer/Probe Setup”中，点击“Remove Unreferenced”。

6 给标准样品设值先确认一下，含样品的方格 Type,Name,Prime/Probe都已设好。然后选 Type=STND的孔，填入 DNA的已知初

始浓度，比如：1.0，0.1，0.01，0.001，0.0001。

7 编辑热学过程点击主界面/Instrument按钮，出现 Stage 1 50℃ 2:00(minute) 目的——激活 UNG酶。 Stage 2 95℃ 10:00目的——失活 UNG,激活 Taq Gold酶。 Stage 3 Step 1 95℃ 0:15(seconds) 目的——模

板变性。

Step 2 60℃ 1:00目的——模板退火，引物延伸。 30-40 cycles.

点击这些温度，时间数字后就可更改之。

8 保存文档（Plate Setup）

9 点击“Run”,real time PCR 整套设备开始自动运行。

10 查看结果，简单分析 PCR结束后，Instrument/Status显示“Idle(机器空闲)”。保存文档（每轮循环，每个反应管的发射

荧光数值）。点击Result/“Amp Plot”选项卡，

出现扩增曲线（半对数坐标显示），

双击纵轴可出现“ Graph-Set Scale”对话框，选定“ Linear”，于是得到线性的扩增曲线（如图一）。在“Reference”中设定 Baseline范围和 Threshold数值，在 Analysis 菜单选择“analyze”,出现对扩增曲线的分析，点击Result/“standard

Curve”选项卡，出现标准曲线（斜直线，如图）

五更为详细的数据处理，包括误差分析 1 根据标准曲线得到待测 cDNA中各种基因（模板）的原始数量Folds= C1(处理样品，待测基因) C3(对照样品，待测基因) ÷ C2(处理样品，持家基因) C4(对照样品，持家基因)

C1-4: 根据标准曲线把 Ct转换为模板原始浓度

还是先得到（ Ct 待测基因－Ct持家基因），再转换为原始模板浓度（处理样品，对照样品， respectively），最后相除？

2 用 Ct比较法来测算转录水平差异。如果做确认实验（Validation Experiment）并得到理想结果，可以不使用标准曲线。

……………………………………… ……………………………………… ………………………………………

….

Xn=X0×(1+Ex

Ex=ER

Folds=2 –ΔΔCt

ΔΔCt=(Ct1-Ct2)-(Ct3-Ct4) Ct1:处理样品待测基因的临界循环数 Ct2: 处理样品持家基因的临界循环数

Ct3: 对照样品待测基因的临界循环数 Ct4: 对照样品持家基因的临界循环数

第三部分如何优化实验条件，得到可信的数据一产物特异性

Real time PCR 使用 SYBR Dye的话，对 PCR产物的特异性要求非常高。 SYBR与所有 dsDNA结合，包括引物二聚体（ Primer Dimers）。理想情况是引物设计非常完美，各种试剂的使用量恰到好处，温度变化与“变性，退火，延伸”完全吻合，使得 PCR 过程中产生极少引物二聚体，极少有偏差的延伸，极少非目的模板的扩增。

移液必须准确。防止污染，如环境中的 DNA进入反应管。引物二聚体，除了寻找合适的序列，还可以改变退火温度，限制引物的浓度。 Mg2+浓度，可以从 2mM到 5mM做梯度实验。退火/延伸温度，可以从60℃到72℃做梯度实验。模板浓度，还有许多其它参数，如与仪器相关的，与实验材料相关的，一般是凭经验来定的。

实时荧光定量PCR(Real-Time-PCR)实验流程

实时荧光定量PCR（Real-Time PCR）实验流程一、RNA的提取(详见RNA提取及反转录) 不同组织样本的RNA提取适用不同的提取方法，因为Real-Time PCR对RNA样品的质量要求较高，所以，正式实验前要选择一款适合自己样品的提取方法，在实验过程中要防止RNA的降解，保持RNA的完整性。在总RNA的提取过程中，注意避免mRNA的断裂；取2ug进行RNA的甲醛变性胶电泳检测，如果存在DNA污染时，要用DNase I进行消化（因为在处理过程中RNA极易降解，建议体系中加入适量RNA酶抑制剂）。二、DNase I 消化样品RNA 中的DNA 用DNase I 消化DNA 组份加量模板(RNA) 10ug RNase Inhibitor 4ul DNase I buffer 10ul DNase I 10ul DEPC处理H2O 至100ul 混匀，37℃ 90min 三、RNA琼脂糖凝胶电泳 1．1%的琼脂糖凝胶电泳凝胶的配制： 1）称取琼脂糖0.45g放入三角瓶中，向其中加入4.5ml的10×MOPS缓冲液和39.5ml 的DEPC水，放微波炉里溶化。 2）待冷却到60摄氏度左右时，加入1ml甲醛，摇匀（避免产生气泡）。倒入凝胶板上凝固30min。 2．取各个RNA样品4μl，加入6×RNA电泳上样缓冲液2μl混匀，加入变性胶加样孔中。3．120V电压下电泳25min。用凝胶紫外分析仪观察，照相保存。 4．RNA电泳结果如下图所示。可见28S和18S两条明亮条带，无DNA条带污染。四．RNA反转录为cDNA 反转录程序(以MBI的M-MLV为例) 组份加量(20ul体系) 加量(40ul体系) 模板(RNA) 0.1~2.5ug(根据条带的亮度适当调整) 3ug(根据条带的亮度适当调整) 引物T18(50uM)(或其他引物) 2.0ul 4.0ul DEPC处理H2O 至12.5ul 至25ul

实时荧光定量PCR原理和实验

实时荧光定量PCR原理和实验陈云地作者单位：200030 美国应用生物系统公司(Applied Biosystems) 无论是对遗传病(如地中海贫血和血友病)、传染病(如肝炎和艾滋病)或肿瘤进行基因诊断，还是研究药物对基因表达水平的影响，或者监控药物和疗法的治疗效果，定量PCR技术都可以发挥很大作用。定量PCR技术的最新进展是实时荧光定量。该技术借助于荧光信号来检测PCR产物，一方面提高了灵敏度，另一方面还可以做到PCR每循环一次就收集一个数据，建立实时扩增曲线，准确地确定CT值，从而根据CT值确定起始DNA拷贝数，做到了真正意义上的DNA定量。这是DNA定量技术的一次飞跃。根据最终得到的数据不同，定量PCR可以分为相对定量和绝对定量两种。典型的相对定量如比较经过不同方式处理的两个样本中基因表达水平的高低变化，得到的结果是百分比；绝对定量则需要使用标准曲线确定样本中基因的拷贝数或浓度。根据所使用的技术不同，荧光定量PCR 又可以分为TaqMan探针和SYBR Green I 荧光染料两种方法。比较而言，探针杂交技术在原理上更为严格，所得数据更为精确；荧光染料技术则成本更为低廉，实验设计更

为简便。在选择实验方案时要根据实验目的和对数据精度的要求来决定。定量实验与定性实验最大的不同，是要考虑统计学要求并对数据进行严格的校正，以消除偶然误差。因此重复实验和设立内对照非常重要。由于各种各样的客观原因，这一点在实践中往往被轻视或忽视，需要着重强调。当然，与定性实验一样，定量PCR也要设立阴性和阳性对照，以监控试剂和实验操作方面可能出现的问题。 1 为什么终点定量不准确？我们都知道理论上PCR是一个指数增长的过程，但是实际的PCR扩增曲线并不是标准的指数曲线，而是S形曲线。这是因为随着PCR循环的增多，扩增规模迅速增大，Taq酶、dNTP、引物，甚至DNA模板等各种PCR要素逐渐不敷需求，PCR的效率越来越低，产物增长的速度就逐渐减缓。当所有的Taq酶都被饱和以后，PCR就进入了平台期。由于各种环境因素的复杂相互作用，不同的PCR反应体系进入平台期的时机和平台期的高低都有很大变化，难以精确控制。所以，即使是重复实验，各种条件基本一致，最后得到的DNA拷贝数也是完全不一样的，波动很大（图1）。

录井技术分类、机理及其应用

录井技术分类、机理及其应用李彬（中国地质大学（武汉）石油与天然气工程专业，湖北武汉，470074）摘要：井场信息化是现代石油勘探与开发的需要。该文从录井技术的角度,探讨了各种录井技术的分类、机理和作用；详细阐述了录井技术及其信息在建立地质剖面、发现油气水层、储集层评价和钻井工程（例如监控方面）油气层保护等方面的的具体应用情况；在此基础上,对录井信息采集、处理及应用前景进行了展望。相信对加速井场信息化建设、提高录井信息的应用程度和水平以及推动录井技术的发展具有重要作用。关键词录井技术信息分类应用意义作用展望 0 引言[1] 随着计算机技术在石油行业的广泛应用和统计地质学等一些边缘学科的创建，极大地提高了录井技术的应用程度,使得获取录井信息的方式和信息量不断增多。随着井场信息的不断丰富和信息化处理手段的提高，对录井信息进行整理和界定，正确认识他们在发现与评价油气层中的作用，不但对录井技术的发展具有重要作用，而且对加速井场信息化建设具有重要意义。 1 录井技术分类方法[2]-[4] 用地球化学、地球物理、岩矿分析等方法，观察、收集、分析、记录随钻过程中的固体、液体、气体等返出物的信息，以此建立录井剖面，发现油气显示，评价油气层，为石油工程（投资方、钻井施工、其他施工）提供钻井信息服务的过程，称为录井。录井工作在石油勘探中普遍存在，本文所讨论的录井特指石油录井。在我国，有石油钻井就有石油录井。录井分为常规录井、特殊录井和综合录井。常规录井技术主要指：岩屑录井、岩心录井、气测录井、钻井工程参数录井（钻时录井、钻井液录井）、荧光录井、井壁取心等。常规录井以其经济实用、方便快捷和获取现场第一手实物资料的优势，在整个油气田的勘探开发中一直发挥着重要的作用；特殊录井主要指非常规地质分析服务或新技术推广应用服务，主要技术有岩石热解地球化学录井、罐顶气轻烃录井、核磁共振录井、定量荧光录井、PK录井等，均属实验室移植技术的推广。其特点是灵敏度高，定量化，获取的资料不仅用于发现和评价油气层，还可以用于生、储盖层的评价。综合录井仪录井技术主要包括随钻检测全烃录井、组分录井、非烃录井、工程录井。其特点是实现了仪器连续自动检测与记录，实现了录取资料的定量化，参数多，有专门的解释方法和软件，油气层的发现和评价自成系统，现已成为录井工作的主体。综合录井技术主要通过岩心录井、岩屑录井、气测和综合录井仪录井等录井方法获取直接反应地下情况和施工情况的多项资料。其显著特点是第一手资料真实可靠，信息量大，便于综合应用。同时，由于录井工作是随钻采集资料，随钻进行评价，具有获取地下信息及时、分析解释快捷的特点，因此综合录井是发现和评价油气层最及时的手段，是任何其他油气勘探方法都望尘莫及的。录井技术与其他勘探技术相比，具有成本低、信息及时、第一手资料多、现场应用快等特点。因此，录井技术作为一项重要的井筒技术，在勘探开发中得到了广泛的应用。

实时荧光定量PCR方法简介

实时荧光定量PCR方法简介一．实时荧光定量PCR的基本原理理论上，PCR过程是按照2n（n代表PCR循环的次数）指数的方式进行模板的扩增。但在实际的PCR反应过程中，随着反应的进行由于体系中各成分的消耗（主要是由于聚合酶活力的衰减）使得靶序列并非按指数方式扩增，而是按线性的方式增长进入平台期。因此在起始模板量与终点的荧光信号强度间没有可靠的相关性。如采用常规的终点检测法（利用EB染色来判断扩增产物的多少，从而间接的判断起始拷贝量），即使起始模板量相同经PCR 扩增、EB染色后也完全有可能得到不同的终点荧光信号强度。为了能准确判断样品中某基因转录产物（mRNA）的起始拷贝数，实时荧光定量PCR采用新的参数——Ct值，定量的根本原理是Ct值与样品中起始模板的拷贝数的对数成线性反比关系。 Ct值是如何得到的在实时荧光定量PCR的过程中，靶序列的扩增与荧光信号的检测同时进行，定量PCR仪全程采集荧光信号，实验结束后分析软件自动按数学算法扣除荧光本底信号并设定阈值从而得到每个样品的Ct值。 Ct值的定义 Ct值中的“C”代表Cycle（循环），“t”代表检测threshhold（阈值），其含义是PCR扩增过程中荧光信号强度达到阈值所需要的循环数；也可以理解为扩增曲线与阈值线交点所对

应的横坐标。 Ct值与样品中模板的对应关系 Ct值与样品中起始模板的拷贝数的对数成线性反比关系（y=ax+b，x代表起始模板拷贝数的对数，y代表Ct值）。与终点法相比利用Ct值的优势由于Ct值是反映实际PCR反应过程中扩增即将进入指数期的参数，该参数几乎不受试剂消耗等因素的影响，因此利用Ct值判断的起始模板拷贝数更加精确，重复性也更好。传统的终点检测法是在PCR扩增经历了指数扩增期进入平台期后利用EB等染料染色来判断扩增产物的多少，从而间接的判断起始拷贝量，这种方法的精确度不高、重复性也不好。下图中是96个复孔的实时扩增曲线（完全相同的反应体系、相同的反应protocol、相同的样品起始浓度），可以看到Ct值具有很好的重复性，而终点的荧光信号强度差异达到300个单位。此外，采用实时荧光定量PCR还能从方法学上有效的防止PCR实验中交叉污染的问题。因为荧光定量PCR中模板的扩增与检测是同时进行的，当实验完成后即可获得定量结果，

荧光定量实验报告(作业)

RT-qPCR比较不同样本中miR-21的相对表达差异一、实验目的 1、掌握实时荧光定量PCR的实验原理。 2、掌握实时荧光定量PCR相对定量的分析方法。二、实验原理实时荧光定量PCR (Quantitative Real-time PCR)是一种在DNA扩增反应中，以荧光化学物质测每次聚合酶链式反应(PCR)循环后产物总量的方法。通过内参或者外参法对待测样品中的特定DNA序列进行定量分析的方法。荧光定量PCR 最常用的方法是 DNA 结合染料 SYBR Green Ⅰ的非特异性方法和 Taqman 水解探针的特异性方法。本实验中采用非特异性 SYBR Green I 染料法，SYBR Green I 是一种结合于所有ds DNA 双螺旋小沟区域的具有绿色激发波长的染料，在游离状态下会发出微弱的荧光，但一旦与双链DNA 结合后，荧光大大增强。因此，SYBR Green I 的荧光信号强度与双链DNA 的数量相关，可以根据荧光信号检测出PCR 体系存在的双链DNA 数量。三、实验仪器、材料和试剂实验仪器：PCR仪、荧光定量PCR仪实验材料：MCF7细胞实验试剂：逆转录试剂盒、SYBR GREEN试剂盒四、实验步骤 4.1 MCF7细胞RNA提取（RNAiso Plus） 1)将生长至80%的MCF细胞消化为单细胞悬液，准备提取RNA； 2)9000g,2min离心，弃掉培养基，加1 ml RNAiso Plus用移液枪反复吹吸直至裂解液中无明显沉淀，室温（15-30℃）静置5分钟； 3)加入氯仿（RNAiso Plus的1/5体积量），盖紧离心管盖，混合至溶液乳化呈乳白色，室温静置5min； 4)12,000 g 4℃离心15分钟。从离心机中小心取出离心管，此时匀浆液分为三层，即：无色的上清液（含RNA）、中间的白色蛋白层（大部分为DNA）及带有颜色的下层有机相。 5)吸取上清液转移至另一新的离心管中（切勿吸出白色中间层）。 6)向上清中加入0.5-1倍RNAiso Plus体积的异丙醇，上下颠倒离心管充分混匀

相对荧光定量PCR的常用方法和注意事项

相对定量方法实际操作（常用方法） 1. Comparative Delta-delta Ct法定量流程（RG6000软件设置） 1).先对样品中的目的基因与看家基因分别做标准曲线，通过标准曲线确定两个基因的扩增效率是否一致或接近；将扩增效率优化为一致。 2).同一样品分别进行看家基因和目的基因的扩增，分列在两页中公式： P1 P2 相同的样品在两页里命名成相同的名称，并定义为unknown 分别分析P1和P2页选delta-delta Ct选项依次填入，并定义对照样品完成分析 F=2— 待检样品看家基因平均 Ct值对照组目的基因平均Ct 值对照组看家基因平均Ct 值 — 待检样品目的基因平均 Ct值 ——

Comparative Delta-delta Ct法的特点、注意事项及实际应用 1). Comparative Delta-delta Ct法是很常用的一种相对定量方法，其最大特点是，当优化的体系已经建立后，在每次实验中无需再对看家基因和目的基因做标准曲线，而只需对待测样品分别进行PCR扩增即可。 2). 其缺点是，每次实验都默认目的基因和看家基因的扩增效率一致，而并非真实扩增情况的反映，这里势必存在一定的误差。 3). Comparative Delta-delta Ct法展开定量实验前，在预实验中，必需对目的基因和看家基因做两组标准曲线。Rotor-Gene 的软件会自动给出两组标准曲线的R值、扩增效率等信息，如果两组标准曲线的斜率，即M值的差小于 0.1，那么后续实验中就可以用Comparative Delta-delta Ct法进行相对定量分析。反之，如果M差值大于0.1，就无法用该方法进行相对定量分析。此时的解决方法有两种，一是优化实验，使两组标准曲线的斜率差值小于0.1，二是换用其它的相对定量方法。应用实例：如上图，将标准品进行梯度稀释后，分别对目的基因（Gene of Interest）和看家基因（Housekeeper Gene）做标准曲线。软件自动绘制标准曲线，并给出相应的参数。从上图可知，两组标准曲线的M值分别为-3.525和-3.467，两者的

实时荧光定量PCR原理

实时荧光定量PCR原理所谓实时荧光定量PCR技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。 1. Ct 值的定义在荧光定量PCR技术中，有一个很重要的概念-- Ct值。C代表Cycle，t代表threshold，Ct值的含义是：每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数（如图1所示）。 2. 荧光域值（threshold）的设定 PCR反应的前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号，荧光域值的缺省设置是3-15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍，即：threshold = 10 ′ SDcycle 3-15 3. Ct值与起始模板的关系研究表明，每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，Ct值越小。利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，其中横坐标代表起始拷贝数的对数，纵坐标代Ct值。因此，只要获得未知样品的Ct值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。 4. 荧光化学荧光定量PCR所使用的荧光化学可分为两种：荧光探针和荧光染料。现将其原理简述如下：1）TaqMan荧光探针：PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的5'－3'外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。而新型TaqMan-MGB探针使该技术既可进行基因定量分析，又可分析基因突变（SNP），有望成为基因诊断和个体化用药分析的首选技术平台。2）SYBR荧光染料：在PCR反应体系中，加入过量SYBR荧光染料，SYBR荧光染料特异性地掺入DNA 双链后，发射荧光信号，而不掺入链中的SYBR染料分子不会发射任何荧光信号，从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步。内标在传统定量中的意义 1．几种传统定量PCR方法简介： 1）内参照法：在不同的PCR反应管中加入已定量的内标和引物，内标用基因工程方法合成。上游引物用荧光标记，下游引物不标记。在模板扩增的同时，内标也被扩增。在PCR 产物中，由于内标与靶模板的长度不同，二者的扩增产物可用电泳或高效液相分离开来，分别测定其荧光强度，以内标为对照定量待检测模板。2）竞争法：选择由突变克隆产生的含有一个新内切位点的外源竞争性模板。在同一反应管中，待测样品与竞争模板用同一对引物同时扩增（其中一个引物为荧光标记）。扩增后用内切酶消化PCR产物，竞争性模板的产物被酶解为两个片段，而待测模板不被酶切，可通过电泳或高效液相将两种产物分开，分别测定荧光强度，根据已知模板推测未知模板的起始拷贝数。3）PCR－ELISA法：利

实时荧光定量PCR仪ViiA7操作步骤

实时荧光定量PCR仪ViiA 7 操作步骤 ——以RNase P示例实验为例一、定义384孔样品模块的实验属性打开电脑访问ViiA 7 软件，然后打开左侧仪器开关。单击Experiment Setup图标。单击Experiment Properties以访问Experiment Properties屏幕。在ViiA 7 软件中设计RNase P实验示例时，请输入：二、使用Define屏幕定义RNase P示例实验的目标基因、样品。 1. 单击Define以访问Define屏幕。 2. 定义目标基因 a. 单击New以增加和定义目标基因。 b. 在目标基因表中，单击Target Name列中的一个单元格，并输入： c. （可选）单击Save以便将新增或原有的正在编辑的目标基因保存到Target Library。 d. 单击Add Saved从目标基因库添加目标基因。 3. 定义样品 a. 单击New以增加和命名样品。 b. 在样品表中，单击Sample Name列中的一个单元格，并输入： c. （可选）单击Save以将新增或原有的正在编辑的样品保存到Sample Library。 d. 单击Add Saved从样品库添加样品。 4. （可选）定义生物学平行测定 a. 在Define Biological Replicates Groups表中，单击New以增加和命名生物学平行测定组。 b. 从下拉菜单选择Color。 c. 单击Comments列，以便为该生物学平行测定组添加注释。注：实验示例不使用生物学平行测定组。保留Biological Replicate Groups空白。 5. 选择用作参比荧光的染料ROX。

imagej荧光定量方法

1、安装后首先打开ImageJ： 2、打开要分析图片：File>open（热键为Ctrl+O） 3、转换成8bit的灰度图：Image>Type>8-bit 4、黑白反转（因为对于光密度（OD）来说越白数值越小，纯白为0；越黑数值越大，纯黑理论上是无限大。因此我们需要将上一步所转换的灰度图进行黑白反转，不然的话测出来的数值就会荧光越亮反而数值越小）：Edit>Invert（热键为Ctrl+Shift+I） 5、校正光密度（软件默认为测量灰度，因此我们要改为更加适用的光密度，其中原理不是一两句话能说得清的，这里忽略）：Analyze>Calibrate 在弹出来的界面的Function选择Uncalibrated OD，并下界面左下方勾选Global calibration，然后点击右下角的OK 点击OK后会跳出校正后的光密度曲线：如不勾选Global calibration，光密度的校正只对这张图片有效，一般分析都要分析多张图片，所以需要勾选，勾选后在打开另一图片时会提示是否将此校正应用于所有图片，不勾选Disable Global Calibration，勾选Disable these Messages

6、选择测量单位（一般选择象素，如有明确的比例，也可以选择相应单位）：Analyze>Set scale 点击后在弹出的界面里点击中间的click to Remove Scale，并勾选下面的Global（同样的，如不选Global这个测量单位的选择只对这张图片有效），最后点击OK 7、选择测量项目：Analyze>Set Measurements 在弹出界面中选择我们需要测量的项目Area、Integrated density，并勾选下面的Limit to threshold （这个选项是指只测量我们选中的范围，如不勾选侧会测量整张图片数据），选择后点击OK 8、选择测量域值：Image>Adjust>Threshold（热键为Ctrl+Shift+T）滑动弹出界面中间的滑块选择适合的域值，以使的你图片中的细胞或待测目标刚好全部被选中，选好之后点击右下角的Set 在弹出来的界面点击OK

定量荧光录井技术

定量荧光录井技术 1.荧光录井技术的产生与发展由于石油具有荧光的特性，国外地质学家于20世纪30年代将荧光检测技术应用于钻井现场，对钻井中返出岩屑进行紫外光照，以了解地层岩屑是否含油，从而判断地层的生油及储藏特性。 50年代，该项荧光检测技术从苏联引入国内，并成功地应用到国内钻井现场。经过方法上的一些改进成为今天仍在大多数钻井现场应用的常规荧光录井技术，它在勘探开发钻井现场录井中能及时地提示人们有效处理重点层段和确定油气显示。常规荧光检测技术作为地质录井技术的一种方法，是在现场将岩屑样品放在暗箱中的紫外灯照射下，通过肉眼观察记录岩屑的荧光现象（颜色和级别），以氯仿或四氯化碳作为萃取剂，制定15个系列的标准样品进行系列对比。其浓度与级别对应关系式如下：B=15-（4-lgC）/0.301 式中：B——荧光显示级别 C——原油浓度 mg/l 然而，常规荧光有着显著的局限性，主要表现在： ①常规荧光灯是用波长365nm的紫外光照射石油，不能充分激发轻质油的荧光。 ②用肉眼观察只能看到波长>410nm的可见光，而轻质油、煤成油、凝析油发出的荧光波长为小于400nm的不可见光，因此常规荧光检测方法观察不到，容易漏掉轻质油、煤成油和凝析油显示层。 ③常规荧光录井用氯仿或四氯化碳浸泡进行系列对比，而氯仿对人体健康有害，四氯化碳则对荧光有猝灭作用，会降低仪器检测的灵敏度，均不是理想的荧光试剂。 ④常规荧光录井不能消除泥浆中荧光类有机添加剂的荧光干扰，在特殊施工井中影响地质资料的准确录取。 ⑤常规荧光用肉眼观察和描述，人为影响因素太大。 80年代，美国TEXACO公司与德克萨斯州A&M大学成功研制了新一代荧光录井仪——QFT数字滤波荧光仪，这是荧光录井技术上的一个跨越式发展，它的诞生为定量荧光录井技术的产生和发展奠定了基础。QFT数字滤波荧光仪是单发单收的定量荧光仪，它是

浅谈定量荧光录井技术

定量荧光录井技术班级：勘工***** 姓名：*** 学号：********* 序号：**

定量荧光录井技术摘要：由于常规荧光录井的局限性：原油激发出的荧光波长分布范围很宽，随着原油密度的减小，荧光波长减小，到凝析油时主要集中在300~400nm 之间。而人眼只能识别400~800nm 之间的光线。在实际工作中对轻质油、凝析油层的荧光录井变得十分困难，经常会不知觉的漏掉油气层。而定量荧光录井技术却能弥补这些不足，由于定量荧光分析仪利用光电元件检测岩样中原油在紫外光照射下激发出的荧光，并与标准样品进行对比，从而定量评价岩石储集的原油密度。仪器采用的光电元件对荧光的波长没有特殊的要求，可以全面检测各波长段的荧光，并特别侧重于小波长轻质油的检测，无论油质轻重都不会漏掉。关键词：定量荧光荧光图谱一、定量荧光检测的的基本理论及影响因素 1.1 定量荧光检测的基本原理荧光强度定量分析的技术应用于地质实验分析领域，主要是利用原油的荧光性，即石油中的不饱和烃和衍生物在激发光的照射下（激发），吸收光能后发生能量跃迁处于不稳定的激发态，处于激发态的分子会放出光子重新回到分子基态（发射），这就是荧光的产生过程。当被测物质浓度不大时，荧光强度与浓度成线性关系，其表达式为： L C Io F ????Φ=ε3.2 对于特定体系在确定实验条件下，激发光强度I0与光程长L 的积为一常数K= I0xL,，因此： C K F ??Φ?=ε3.2

式中：ε——被测物质的摩尔吸光系数 C——被测物质的摩尔浓度 Ф——被测物质的荧光效率不同原油所含分子成份结构不同，所吸收光的波长和发射的荧光波长也不同，由此可定性判别原油性质。同一类型的原油，用同一波长的激发光照射，可发射相同波长的荧光。若浓度不同，则浓度增加，所发射的荧光强度也增强。运用这一基本理论，在石油钻探过程中，根据定量检测岩样中所含石油的荧光强度，再利用邻井相同层位的油所作的标准工作曲线计算出相当的油含量，根据油含量的多少和油质情况来判断地层含油情况。在现代地质分析技术中，荧光检测属于分子光谱分析范畴，由于荧光检测技术有很好的理论基础，因此，这项技术才得以发展和延续。 1.2 荧光分析影响因素：不同的环境因素会对荧光现象产生不同程度的影响，了解和利用这些影响因素，就可以提高荧光分析的灵敏度和选择性。 1.溶剂的影响同一种荧光体在不同的溶剂中，其荧光图谱的位置和强度都可能会有显著的差别。溶剂的影响一般可分为一般的溶剂效应和特殊的溶剂效应，前者指的是溶剂的折射率和介电常数的影响，后者指的是荧光体和溶剂分子间的特殊化学作用，入氢健的生成和配合作用，一般的溶剂效应是普遍存在的，而特殊的溶剂效应则取决于溶剂和荧光体的化学结构。特殊的溶剂效应所引起的荧光图谱的移动值，

荧光定量PCR的原理、方法及结果分析

荧光定量PCR的原理、方法及结果分析而实时荧光定量PCR技术，顾名思义，就是在PCR的基础上加入荧光基团，通过荧光信号的变化的实时监测PCR的反应过程，最后通过对未知模板进行定量分析的方法。目前，实时荧光定量PCR 已成为不同样品间进行基因表达水平定量差异比较的权威性方法。在过去十几年中，该方法迅速流行，涉及科学的多个领域，包括农业、环境、工业和医学研究。实时荧光定量PCR的应用目前，qPCR技术已经广泛应用于生物医药食品等行业，应用于疾病的早期诊断、遗传病的早期诊断、药物研究、肿瘤的诊断与研究、食品病原微生物的检测、转基因食品检测、动物疫病检测等，除此之外，还包括： ● 基因扩增 ● 扩增特异性分析 ● 基因定量分析 ● 基因检测 ● 基因分型 ● SNP分析

● RFLP多态性分析 ● 单/多基因表达研究 ● 高通量基因表达谱研究 …… 实时荧光定量PCR的常用方法染料法荧光染料可与双链DNA结合，每个循环的延伸阶段，染料掺入双链DNA 中，其荧光信号强度与PCR产物的数量呈正相关。同时，其缺点也在于其非特异性。当PCR反应中有引物二聚体或者非特异性扩增时，该染料也可以和这些非特异性扩增产物结合，发出荧光，从而干扰对特异性产物的准确定量。常用的染料为SYBR Green I，各公司针对荧光信号强度、抑制作用等进行改进，也推出了很多新的染料供大家选择。 Promega采用新型荧光染料BRYT Green? Dye，对qPCR反应没有抑制作用，与双链DNA结合后荧光信号更强. 探针法在PCR扩增时加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸：5’端标记一个报告荧光基团，3’端标记一个淬灭荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收;PCR扩增时，Taq酶的

实时荧光定量PCR全方位解析

实时荧光定量PCR全方位解析实时荧光定量PCR技术于1996年由美国Applied Biosystems公司推出，所谓实时荧光定量PCR技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。 PCR原理所谓实时荧光定量PCR技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。 1. Ct 值的定义在荧光定量PCR技术中，有一个很重要的概念-- Ct值。C代表Cycle，t代表threshold，Ct值的含义是：每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数。 2. 荧光域值（threshold）的设定 PCR反应的前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号，荧光域值的缺省设置是3-15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍，即：threshold = 10 ′ SDcycle 6-15 3. Ct值与起始模板的关系研究表明，每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系〔1〕，起始拷贝数越多，Ct值越小。利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，其中横坐标代表起始拷贝数的对数，纵坐标代Ct值。因此，只要获得未知样品的Ct值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。 4. 荧光化学荧光定量PCR所使用的荧光化学可分为两种：荧光探针和荧光染料。现将其原理简述如下： 1）TaqMan荧光探针：PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的5'－3'外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧

定量荧光录井技术的回顾与展望

定量荧光录井技术的回顾与展望任中启（胜利石油管理局黄河钻井总公司钻井三公司，山东东营）捕要利用常规荧光检测仪进行荧光录井是识别油气层最方便易行的方法。以荧光检测仪为主线．系统回顾了定量荧光录井技术的发展历程．重点彳卜绍７不同发展阶段定量荧光桂测仪的结构原理、功能特点和应用情况．指出三维荧光检测仪将成为定量荧光录井的主流仪器，加强定量荧光录井资料的综合应用，开发定量荧光录井配套软件是定量荧光录井技术的发展趋势和今后努力的方向．关键词：荧光检谢仪油气藏评价综台录井综述录井技术是油气勘探开发中，发现和评价油气藏最及时、最直接的手段口］。目前已发展成为地质录井、气测录井、钻井液录井、地化录井、钻井工程监测和随钻监测为一体的现代化综合录井技术ｏ］。荧光录井是初步寻找、判断油气显示层的有效手段．它在勘探开发中对现场旅工有重要的指导作用，能及时提示人们有效处理重点层段和确定油气显示。发展历程ｌ’常规荧光检测仪目测分析技术利用常规荧光检测仪进行荧光录井是识别油气层最方便易行的方法。因此该检测仪一直是现场必不可少的设备。该方法最早始于１９３３年，现已发展成为包括湿照（或喷照）、干照（又称直照）、普照、选照、滴照、浸泡照和加热照对比等荧光分析的系统方法“］。通常根据荧光亮度估算油气含量，依据发光颜色确定油气组分。由于常规荧光检测仪的主要部件是装在铁皮暗箱中的紫外灯，该紫外灯发射的紫外光波长一般为３６５ｎｍ左右，激发光能量较低。根据荧光红移原理，待测样品受到该波长的紫外光照射激发后所发射的荧光波长至少大于激发波长（３６５ｎｍ），无法激发小于３６５ｎｍ波长的荧光。另外，肉眼所能观察到的光线（即可见光）波长为４１０～８００ｎｍ，而大部分原油荧光特征主峰在３００～４００ｎｍ波长内，因此，通过紫外灯照射样品所观测到的荧光，只是荧光光谱延续到可见光范围的少量（约ｌｏ％左右）荧光。其荧光强度远小于４００ｎｍ波长的荧光主峰强度。因此，紫外灯目测法存在原油荧光的激发、?５０?拈井液与宅井瘫－２００３年弟２０卷茅６期发射率低、发现率低（３００～４１０ｎｍ波长内的原油荧光肉眼观测不到）和分辨率低、无法准确定量等缺点。对于轻质油，该问题更加突出，因为轻质油的整个荧光光谱波长范围低于４００ｎｍ，属于不可见荧光，这时必须借助高灵敏度分析仪器才能检测到，仅靠肉眼观测很难发现和辨别。其次利用常规荧光检测仪进行肉眼观测，在技术上很难准确分辨７级以下的荧光。另外，由于不同的地质技术员受自身现场经验、颜色敏感度等人为因素，以及环境温度、井场电压波动、紫外灯发光效率等不同因素的影响，对同一个样品目测定级的误差较大，因此，该种方法主观而且不可靠，容易漏掉轻质油层。２．固定激发和发射波长的定量荧光分析技术——一维荧光检测仪（即数字滤波荧光检测仪）（１）结构原理该仪器由紫外光源、初级滤波器、样品室、次级滤波器、检测器、信号放大及处理电路和显示记录系统等组成。①紫外光源使用汞灯，用以产生连续的紫外光对样品进行激发。狭缝是选择光束的带宽，一般为１０ｎｍ，其它部分的狭缝作用与此相同。②初级滤波器主要是从混合光源中分离出窄谱带光束的一种干涉滤光片。③样品室为用于盛放样品溶液的石英比色皿，分为内置式和开放式两种；内置式结构的样品室为全封闭，分析样品时需要用注射器注样；开放式结构的样品室可人工换样。 ④次级滤波器也是一种干涉滤光片，主要对样品溶液发射的荧光进行滤波。⑤检测器通常采用高灵敏度的光电倍增管，将光信号转换为电信号。＠信号放大及处理电路，通常检测器输出的电信号都很微弱，需要进行放大才能提供显示记录系统使用。⑦显示记录系统是对荧光分析结果进行显示和记录。（２）功能特点该仪器简单、适应性强，适合现场作业，能够实现样品荧光的数字定量分析，发现凝析油、轻质油和部分中质油发出的肉眼不可见的荧光。用标准原油样品进行测量做出校正曲线后，可以确定提取液的含油量，由于荧光矿物不溶解，能消除矿物荧光对石油荧光的干扰。　万方数据万方数据

荧光定量PCR实验指南(一)

荧光定量PCR实验指南（一）一、基本步骤： 1、目的基因（DNA和mRNA）的查找和比对； 2、引物、探针的设计； 3、引物探针的合成； 4、反应体系的配制； 5、反应条件的设定； 6、反应体系和条件的优化； 7、荧光曲线和数据分析； 8、标准品的制备；二、技术关键： 1、目的基因（DNA和mRNA）的查找和比对；从https://www.360docs.net/doc/811456450.html,/网点的genbank中下载所需要的序列。下载的方式有两种：一为打开某个序列后，直接点击“save”，保存格式为“.txt”文件。保存的名称中要包括序列的物种、序列的亚型、序列的注册号。然后，再打开DNAstar软件中的Editseq 软件，点击“file”菜单中的“import”，打开后点击“save”，保存为“.seq”文件。另一种直接用DNAstar软件中的Editseq软件，点击“file”菜单中的“open entrez sequence”，导入后保存为“.seq”文件，保存的名称中要包括序列的物种、序列的亚型、序列的注册号。然后要对所有的序列进行排序。用DNAstar软件中的Seqman软件，点击“sequence”菜单中的“add”，选择要比较的“.seq”的所有文件，点击“add”或“add all”，然后点击“Done”导入要比较的序列，再点击“assemble”进行比较。横线的上列为一致性序列，所有红色的碱基是不同的序列，一致的序列用黑色碱基表示。有时要设定

比较序列的开始与结尾。有时因为参数设置的原因，可能分为几组(contig)，若想全部放在一组中进行比较，就调整“project”菜单下的“parameter”，在“assembling”内的“minimum math percentage”默认设置为80，可调低即可。再选择几个组，点击“contig”菜单下的“reassemble contig”即可。选择高低的原则是在保证所分析的序列在一个“contig”内的前提下，尽量提高“minimum math percentage”的值。有时因此个别序列原因，会出现重复序列，碱基的缺失或插入，要对“contig”的序列的排列进行修改，确保排列是每个序列的真实且排列同源性最好的排列。然后，点击“save”保存即可。分析时，主要是观察是否全部为一致性的黑色或红色，对于弥散性的红色是不可用的。 2、引物和探针设计 2.1引物设计细心地进行引物设计是PCR中最重要的一步。理想的引物对只同目的序列两侧的单一序列而非其他序列退火。设计糟糕的引物可能会同扩增其他的非目的序列。下面的指导描述了一个可以增加特异性的引物所具有的令人满意的特点：序列选取应在基因的保守区段；扩增片段长度根据技术的不同有所分别： sybr green I技术对片段长度没有特殊要求； Taqman探针技术要求片段长度在50bp－150bp；避免引物自身或与引物之间形成4个或4个以上连续配对；避免引物自身形成环状发卡结构；典型的引物18到24个核苷长。引物需要足够长，保证序列独特性，并降低序列存在于非目的序列位点的可能性。但是长度大于24核苷的引物并不意味着更高的特异性。较长的序列可能会与错误配对序列杂交，降低了特异性，而且比短序列杂交慢，从而降低了产量。

GUS荧光定量分析方法

GUS荧光定量分析方法一、GUS 粗蛋白的提取 1、取拟南芥组织100mg，用液氮研磨成粉。 2、加入1ml的GUS提取液（pmsf<蛋白抑制剂>），剧烈震荡。 3、12000rpm离心10分钟，收集上清液，得到GUS粗酶提取液。二、考马斯亮蓝法测定总蛋白含量按上表加入不同量的BSA标准蛋白溶液，测定OD595的吸光值，并得出曲线方程。 2、样品总蛋白的测定自定合适的比例的稀释GUS蛋白溶液，要求稀释后的待测样品颜色介于1中的0到6之间。例如：稀释40倍，5ul样品+195ulGus提取液，取40ul +200ulG-250混匀，室温放置2分钟，测定OD595光吸收值，根据标准曲线计算蛋白含量。三、GUS活性的测定用终止液将MU储备液B按上表稀释成0-250nM,用荧光计在激发波长为350nm,发射波长455nm下测定他们的荧光强度做出一条标准曲线，并得出曲线方程。 2荧光定量 1）取两支Ep离心管，各加入1.8mL反应终止液，并编号. 2）在Ep管中加入200提取液，加入50uLGUS粗酶提取液，再加入250ul预热的反应液，混匀。立即取出200ul加入到1号管中，此反应为0时的样品，荧光测定时以此为空白，并开始计时。 3）将反应管放入37摄氏度温箱中进行酶反应，60分钟后，取200ul反应液，加入到2号管中混匀，为反应60分钟时的样品，测定荧光值。主要溶液的配制：

1、GUS提取缓冲液： 1)0.1M磷酸钠缓冲液（pH7.0）50mL: 0.1M磷酸钠缓冲液（pH7.0）：557mL0.1mol/LNa2HPO4+42.3mL1mol/L NaH2PO4定容到1000mL (35.814gNaHPO4.12H2O(358.14)定容到1000mL;15.6g NaH2PO4.2H2O（156.01）定容到100Ml) 2) 0.5M Na2EDTA (pH8.0) 2.00mL: 9.31gEDTA加水剧烈搅拌，加入约1g NaOH, 定容到50 mL. 3) 30% 十二烷基肌氨酸钠0.33 mL：1.5g加水定容到50 4）10% Triton X-100 1 mL: 1 mL Triton X-100 加9 mL水混匀 5）β-巯基乙醇0.07-0.10 mL（马琳论文里面有） 6）甲醇 20ml（网上有的文献里有）蒸馏水定容至100mL。 2、考马斯亮蓝溶液G-250的配制： 100mg考马斯亮蓝溶液G-250 溶于50 mL95%中，加100 mL85%磷酸，定容到1 mL，过滤后保存于4°C，最终试剂0.01%考马斯亮蓝溶液G-250,4.7%（w/v）乙醇,8.5%（w/v）磷酸. 3、标准蛋白溶液： 50mg牛血清白蛋白（BSA），溶于50 mL0.15M的氯化钠中。配制成1 mg/mL的标准蛋白溶液。 4、0.15M的氯化钠溶液 0.876g氯化钠定容到100 mL 5、4-MU储备液A（4-MU 1 mM）：19.8mg4-MU溶于避光保存 4-MU储备液B（4-MU 1 μM）：10μL4-MU储备液A定容到10 mL 6、终止缓冲液（0.2M Na2CO3） 10.6g Na2CO3 溶于500 mL水。 7、GUS反应缓冲液： 25mg4-MUG溶于25 mL提取缓冲液中 1) 1mol/L Na2HPO4溶液：35.814g Na2HPO4溶于100ml水。 2) 1mol/L NaH2PO4 溶液：15.601g NaH2PO4 溶于100ml水。 3) 0.1M 磷酸缓冲液(PH7.0)：1mol/L Na2HPO4取5.77ml，1mol/L NaH2PO4取4.23ml，定容至100ml。 4) 10％SDS溶液：将90ml水稍微加热，加10g SDS，搅拌溶解，加入几滴浓盐酸调节PH至7.2，然后加水定容至100ml。 5) 0.5 M EDTA (PH8.0)：在80ml水中加入18.61g Na2EDTA?2H2O，用NaOH调PH至8.0（约需2g左右的固体NaOH），溶解后定容至100ml。 6) GUS酶提取液：0.1M 磷酸缓冲液（PH7.0）取50ml；10% SDS取1ml；0.5M EDTA(PH8.0)取2ml；Triton X-100取100ul；β-巯基乙醇100ul；用水定容至100ml。 7) MUG底物：称8.8mg MUG，溶于10ml GUS酶提取液中，配制成2mmol/L的工作浓度。 8) 反应终止液（0.2 mol/L Na2CO3 ）：称2.12Na2CO3 ，用水定容到100ml。 9) 考马斯亮蓝G250溶液：考马斯亮蓝G250 10mg, 95%乙醇5m1, H3PO4 10ml，定容至l00ml，过滤后4℃保存。 10) １mg/ml BSA：20mg BSA，用GUS提取缓冲液定容至20ml。

荧光定量PCR之绝对定量分析标准曲线的绘制

荧光定量P C R 之绝对定量分析——标准曲线的绘制 1. 绝对定量定义绝对定量是用已知浓度的标准品绘制标准曲线来推算未知样品的量。将标准品稀释至不同浓度，作为模板进行PCR反应。以标准品拷贝数的对数值为横坐标，以测得的CT值为纵坐标，绘制标准曲线，对未知样品进行定量时，根据未知样品的CT 值，即可在标准曲线中得到样品的拷贝数。 * Log（起始浓度）与循环数呈线性关系，通过已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，即得到该扩增反应存在的线性关系 *由样品CT值，就可以计算出样品中所含的模板量 2. 绝对定量标准品标准品的一些标准 * 必须用与扩增目的基因相同的引物进行扩增，并且扩增效率相同 *标准品必须是经过准确定量的（我们通常用的是ASP-3700紫外光/可见光微量分光光度计）* 标准品必须是标准化的（例如，同一化的细胞数） *在每组实验时，必须用相同的阈值设定来确定CT值标准品可以是含有目的基因的线性化的质粒DNA也可以是比扩增片段长的纯化后的PCR产物，当然也可以是基因组DNA甚至cDNA但前提是所有的作为标准品的核酸

都必须保证稳定。 3. 标准品的制备一般一条标准曲线取四到五个点，浓度范围要能覆盖样品的浓度区间，以保证定量的准确性。一般一个点重复三至五次，对于常期稳定使用的标准品可以适当减少重复的次数。倍比梯度稀释方法： 1v 原液(标准品i ) +9v 稀释缓冲液，得标准品ii 1v 标准品ii+9v 稀释缓冲液，得标准品iii 1v 标准品iii+9v 稀释缓冲液，得标准品iv 1v 标准品iv+9v 稀释缓冲液，得标准品v 依次倍比稀释拷贝数的计算：详见核酸拷贝数的计算 4. 实例标准品的制作：将标准品依次进行10倍稀释，ASP-3700测得其拷贝数1.55 X 108copy /ul 标准曲线的绘制( 1cycle=1min ) 设置对照：浓度为 1.55X107、1.55X106、1.55X105、1.55X104、1.55X103、1.55X102、1.55 X 101的标准样品各一个，设空白对照