重组人促红细胞生成素的生产与应用
重组人促红细胞生成素的生产与应用
任雅怡3090102202
摘要重组人促红细胞生成素是成功应用于生物医药领域的重组蛋白药物产品。科研领域
对其性质和合成方法已有了成熟的了解。工业生产者也早已开始大量生产重组人促红细胞生成素，并且取得了不俗的市场成效。
关键词重组人促红细胞生成素生产工艺应用市场开发
一、重组人促红细胞生成素的性质
促红细胞生成素（erythropoietin,简称EPO）最早于1906年被发现。EPO属唾液糖蛋白激素，由165个氨基酸组成，为人体内源性化合物，糖基化位点为Asn24、Asn28、Asn83和Ser126,有2对半胱氨酸组成的二硫键(Cys7-Cys61和Cys29-Cys33)，分子量为34～36 ku (SDS-PAGE)、30.4 ku(超滤)或60 ku（凝胶电泳），疏水性极强,pI为3.75~4.15。它主要来源于肾脏（少量来源于肝脏），由皮质管周围的间质细胞合成。
由基因重组技术合成的rhEPO相对分子质量为30400道尔顿，为含165个氨基酸糖的酸性糖蛋白，由哺乳动物细胞培养产生，结构与天然EPO极为相似，其理化性质和生物学活性与天然内源性红细胞生成素相同。其不同点是基因位点在7号染色体。在基因重组技术诞生前，EPO主要从贫血患者的尿和绵羊血中提取，提取率非常低，且极不稳定，理化和生物性质难以测定。1985年，人EPO基因克隆和表达的成功，使rh-EPO的制备成为现实。
二、重组菌构建过程
重组人红细胞生成素，是以重组DNA技术生产的红细胞生成素，将红细胞生成素的基因连接到表达载体上，转化CHO细胞，从细胞培养上清液中纯化得到红细胞生成素。重组人红细胞生成素与天然人红细胞生成素具有相同的体内、体外活性，比活基本相当。
Jacob等人从基因文库中克隆并测序了编码红细胞生成素的DNA片段，同时，以核酸探针从λ噬菌体cDNA文库中筛选得到了编码红细胞生成素的cDNA片段，以此构建了SV40病毒启动子驱动表达的载体，在猴肾纤维母细胞COS-1中进行瞬时表达，测得了红细胞生成素的生物活性。Lin等人(1985)由人基因组中获得编码红细胞生成素的基因，将其转入中国仓鼠卵巢细胞系（CHO）中，获得稳定的表达。Quelle等人利用昆虫SF9细胞中的杆状病毒系统表达rhEPO。虽然经转化的SF9细胞生产的rhEPO的产率有所改善，但是目标产物rhEPO的糖基化程度较天然红细胞生成素为小，因而其分子量亦较小。Mori等人构建了一个含有干扰素-α基因启动子的rhEPO表达载体，并利用该rhEPO表达载体转化B 细胞白血病BALL-1细胞。经以仙台病毒转染后，转化的B细胞白血病BALL-1细胞比现有技术所得的转化株能产生较高量的rhEPO。重组红细胞生成素在大肠杆菌中也得到表达，但所得rhEPO仅具有体外抗原结合活性。至于家蚕体内的表达系统，也存在糖基化简单，药物在体内稳定性较低、活性较差等问题。在哺乳动物细胞CHO、BHK细胞系统中表达，
获得的重组红细胞生成素与天然红细胞生成素相似。故现在工业生产中多采用动物细胞培养表达红细胞生成素进行大规模生产。
三、重组人促红细胞生成素的生产工艺
1、表达红细胞生成素的细胞系
①构建红细胞生成素表达载体
有两种方式获得编码人红细胞生成素基因。一种是提取胎肝染色体DNA，然后以特异性寡核苷酸为引物，经聚合酶链式反应扩增出人红细胞生成素的基因片段，然后与克隆载体连接，克隆基因。另一种是提取人胎肝mRNA，逆转录合成cDNA文库，进行文库筛选，得到人红细胞生成素基因。
将人红细胞生成素基因与表达质粒重组，导入哺乳动物细胞，经筛选得到表达人红细胞生成素的细胞株。常用的表达载体有这两种质粒带有二氢叶酸还原酶（dhfr）基因，也可以用不含dhfr基因的表达载体。常用的宿主细胞为CHO细胞。构建载体经过筛选后，必须通过测序，确证红细胞生成素的DNA序列及其推导的氨基酸序列是正确的。
②构建表达红细胞生成素的细胞株
以二氢叶酸还原酶缺陷型的中国仓鼠卵巢细胞系（CHO dhfr-）为宿主细胞。将此细胞培养于100 mm培养皿中，待细胞长满至50%～60%时，用无血清细胞培养基淋洗细胞，加入由无血清培养基、表达载体和共转化载体，以及lipofectin组成的共转染混合液，37℃培养4小时。吸出培养基，加入含10%胎牛血清的F12培养基，37℃培养过夜。随后在含青霉素、链霉素及10%胎牛血清的DEME中培养，获得抗性克隆。逐步提高MTX终浓度，筛选抗性克隆。利用酶联免疫分析法确认所得到的细胞表达人红细胞生成素。
2、CHO细胞培养工艺过程
在获得了能够高效表达目的蛋白的重组细胞株以后，需要解决的问题就是通过培养而大量生产出目的蛋白。常规动物细胞培养的方法是将细胞放在不同的容器中进行培养。如利用转瓶大量培养贴壁细胞或用生物反应器培养贴壁或悬浮细胞。
转瓶培养细胞工艺简单，规模易于扩大，污染易于控制，一直用于疫苗工业的生产，是传统的细胞培养生产工艺。美国Amgen公司是世界上最早获得人红细胞生成素生产和上市的企业，采用的生产工艺即是转瓶培养生产工艺。以下介绍生物反应器培养工艺。
①种子细胞制备
（1）冻存的细胞株37℃水浴复苏，无菌离心，弃去冻存液。
（2）加入适量DMEM培养基（含10%小牛血清）。
（3）37℃二氧化碳培养箱培养，连续传三代。
（4）细胞消化后接种，接种的细胞浓度约为2.5×106个/ml。
②反应器连续培养
（1）加入纤维素载体片及pH7.0的PBS缓冲液，5L细胞反应器高压灭菌1.5小时。（2）将反应器接入主机，连接气体，校正电极，排出PBS缓冲液。加含有小牛血清的DMEM 培养基，接种。控制条件pH7.0，搅拌转速<50 r/min，37℃，DO 50%～80%，进行贴壁培养。
（3）转速提高到80~100 r/min，继续扩增培养10天。
（4）更换为无血清合成培养基，由软件控制温度、溶氧、pH值等培养条件，进行连续灌流培养。
（5）收获培养物，4℃~8℃保存。
③培养工艺控制
生物反应器由于各种辅助配件比较完善、因此具有许多优点，如无菌操作安全可靠、保温和气体交换可靠，能保持pH值稳定，监视控制自动化，产物的收集和新液的补充持续进行以及载体有足够的表面积等，非常适于基因工程细胞的高密度、高表达连续培养。但不同的细胞，其最适生长和表达条件不完全相同，必须摸索出最适培养条件。
在刚接种后细胞稀少时，搅拌速度缓慢，使细胞牢固地贴附于载体上，随着细胞数量的增加逐渐提高搅拌速度，以便使细胞周围的微环境中代谢产物和营养物质都在较短的时间内达到平衡。
动物细胞培养对温度波动的敏感性很大。因此，对温度的控制应较为严格。恒定的温度(37℃)及pH值(7.2)也是较为理想的条件。
pH值也是细胞培养的关键性参数，它能影响细胞的存活力、生长及代谢。细胞生长的最适pH值因细胞类型不同而异，应先通过实验寻找出最适pH值，再通过输入CO2和碳酸氢盐溶液维持其恒定。细胞生长与表达的pH值为7.0~7.2。
氧是细胞代谢中最重要的养分之一。它可以直接和间接地影响细胞的生长与代谢。溶解氧应在10％~100％的范围内。可根据需要向培养液内加入氧气、空气或氮气按比例的混合气体以控制溶氧。
葡萄糖是细胞生长与表达过程中必不可少的碳源之一，其消耗程度直接反映出细胞代谢旺盛程度，细胞生长、表达旺盛时，需大量消耗，而缺乏时细胞生长速度与产物表达量均降低，故应及时充分地予以补充。此外还应监测氨、乳酸盐类等代谢废物在培养基中的含量，维持在较低的浓度，减少对细胞损害。
虽然采用有血清培养基有效刺激细胞的分化和增殖，但无血清的合成培养基用于生产，可降低纯化过程中杂蛋白质的含量，减少纯化的负载，并延长层析色谱柱使用寿命，有效提高产品的纯度。
3、红细胞生成素的分离纯化工艺过程
①红细胞生成素的初级分离
（1）CM－Sephrose亲和层析柱预先用Na-HAc-异丙醇活化，并用20 mmol/L TrisHCl平衡缓冲液平衡。
（2）收获培养基滤膜过滤后上CM亲和层析柱，平衡缓冲液平衡。
（3）0～2 mol/L NaCl，20 mmol/L Tris洗脱液梯度洗脱。
（4）收集活性洗脱峰10 mmol/L Tris透析液透析过夜。
②红细胞生成素的精制
（1）透析后的活性组分上预先平衡的DEAE离子交换柱。
（2）0～1 mol/L NaCl- Tris洗脱液梯度洗脱，收集活性洗脱峰。
（3）上10%乙腈平衡的RP-HPLC柱（C4填料），10%～70%的乙腈溶液梯度洗脱，收集活性洗脱峰。
（4）上凝胶柱（预先用20 mmol/L柠檬酸盐缓冲液平衡），20 mmol/L柠檬酸盐缓冲液平衡并洗脱，收集活性洗脱峰（红细胞生成素）。
在透析过程中，透析液的体积为蛋白液的15倍体积，过夜，并分四次换液。在上离子交换柱前用0.22 μm滤膜过滤。在上RP-HPLC柱前样品蛋白含量为0.37 mg/ml，经无菌过滤后制成粗品再进一步纯化。在上凝胶柱前蛋白含量约为1.0 mg/ml，最后得到产品蛋白含量为1.2 mg/ml，其比活>1.2×105 IU/mg。
四、重组人促红细胞生成素的应用
1、应用情况概述
重组人红细胞生成素（rhuEPO）是最早用于临床的重组基因工程药物之一，可促进骨髓内原始血细胞加速分化，促进有核红细胞加快成熟及血红蛋白合成，刺激网织红细胞和成熟红细胞释放，并稳定红细胞膜，提高红细胞膜抗氧化酶功能。rhuEPO最初主要用于治疗慢性肾性贫血，之后随着对众多疾病相关性贫血的病理生理过程以及EPO、铁和红细胞生成三者间相互关系的深入认识，EPO的临床应用逐步扩展。
EPO现阶段的临床应用主要有治疗慢性肾病、获得性免疫缺陷综合征（AIDS）、肿瘤、充血性心力衰竭、中枢神经系统疾病、认知功能受损、丙型肝炎病毒（HCV）感染等疾病患中、治疗中或恢复期的贫血和组织缺氧症状。
2、临床试验效用
以下结论来自一些具体相关临床试验的研究文献：
①rhuEPO明显促进红细胞生成，安全、可靠地改善妊娠期贫血。
②大剂量治疗多发性骨髓瘤患者相关性贫血优于数学，其起效快、疗效好，患者生活幸福
感改善明显，费用成本低，安全性好。
③应用重组人促红细胞生成素可以明显改善肝移植受者术前存在的贫血状态，减少术中异
体血液的输注量和术后继续需要输注异体血液的可能。
④恶性血液病完全缓解的患者巩固化疗中，应用rhEPO2万U每周1次疗法治疗化疗相关
性贫血可以减少输血量和相关治疗费用，并减少输血相关副作用和患者的痛苦。
⑤rhuEPO预处理（皮下注射）能减轻二尖瓣置换术患者的血清心肌酶及肌钙蛋白表达，具
有显著的保护心肌作用。
⑥ rhEPO治疗能促进新生儿缺氧缺血性脑病（HIE）患儿神经功能的早期回复，除对红细胞
增生有促进作用外，对其他系统无不良反应。
⑦重组人促红细胞生成素不仅能改善慢性肾功能衰竭维持性血液透析患者的贫血状态，而
且可改善患者的营养状况和红细胞免疫功能。
⑧EPO能改善急性病毒性心肌炎临床症状，减轻心肌损伤，降低心律失常、急性左心衰发
生率。
五、重组人促红细胞生成素的市场开发状况
1985年科学家应用基因重组技术，在实验室获得重组人促红细胞生成素（rhEPO）。自从1989年FDA批准红细胞生成素[Amgen公司Epogen、Ortho Biotech公司Procrit] 用于临床连续治疗需要透析的慢性肾衰病人以来，很多国家也已经批准红细胞生成素上市和生产，并且市场表现不俗。重组红细胞生成素(EPO)目前的销售额一直排在生物医药类产品的前三名，每年的增长率在10％以上。
Amgen公司开发的用于治疗恶性贫血症的第二代促红细胞生成素新产品Arnesp2001年得到FDA的批准，Arnesp2002年初正式上市。Arnesp是一种“高糖基化”促红素产品，其促进红细胞生成的能力大大优于第一代EPO（促红细胞生成素）产品。第一年上市即大获全胜，赢得开们红，Aranesp2002年全年销售额为4.2亿美元，2003年全年销售额为15.4亿美元,市场前景不可估量。同时，强生（Johnson&Johnson）公司的促红细胞生成素Procrit/Eprex更是表现不俗，2001年销售额34.42亿美元，2002年销售额42.69亿美元，2003年销售收入达到39.84亿美元。
2001年，EPO（包括Arnesp）的全球销售额达21.1亿美元，2002年达26.8亿美元，2003年全世界EPO的年销售额超过50亿美元。2005年全球EPO市场比上一年
的119.2亿美元增长5.2%，达到120多亿美元，一举成为世界医药市场上首个单品突破百亿美元的药品，从而占据了全球生物基因工程药品的份额的五分之一，创下生物工程药品单个品种之最，是当今最成功的基因工程药物。
目前，国内已有10多家单位获准生产红细胞生成素。沈阳三生和上海麒麟鲲鹏（中国）生物药业的产品在国内医院的销售额独领风骚，2001年EPO的国内医院销售总额约为47449万元，2002年为49508万元，2003年上半年为28606万元。
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重组人促红细胞生成素在肾性贫血中合理应用的专家共识
重组人促红细胞生成素在肾性贫血中合理应用的专家共识 （2010修订本版） 中华医学会肾脏病学分会（2010修订本版2010年1月22日三亚） 肾性贫血是慢性肾脏病的重要临床表现，是慢性肾脏病患者合并心血管并发症的独立危险因素，有效治疗肾性贫血是慢性肾脏病一体化治疗的重要组成部分。重组人促红细胞生成素（rHuEPO）是临床上治疗肾性贫血的主要药物，在我国临床应用已经10余年，不仅应用于血液净化维持透析治疗的患者，而且也应用于非透析的慢性肾脏病患者。近年来rHuEPO治疗肾性贫血的循证医学证据进一步完善，加之出现rHuEPO新剂型；为适应我国rHuEPO临床应用的变化，指导临床医生合理应用rHuEPO，中华肾脏病学分会对2007年版的“重组人促红细胞生成素在肾性贫血中合理应用的专家共识”进行了修订。 一、rHuEPO 在慢性肾脏病患者治疗中的意义 众多国内外资料显示：合理应用rHuEPO，不仅能有效纠正慢性肾脏病患者贫血，减少慢性肾脏病患者的左心室肥大等心血管合并症发生，改善患者脑功能和认知能力，提高生活质量和机体活动能力；而且能降低慢性肾脏病患者的住院率和死亡率。因此，rHuEPO在慢性肾脏病治疗中，目前是不可缺少和替代的。 二、贫血定义和检查 1、贫血定义 WHO的贫血诊断标准：成人女性血红蛋白（Hb）<120 g/L，成人男性Hb<130g/L。但应考虑患者年龄、种族、居住地的海拔高度和生理需求对Hb 的影响。 2、贫血检查时机所有慢性肾脏病患者，不论其分期和病因，都应该定期检查Hb。女性Hb<110 g/L，男性Hb<120 g/L时应实施贫血检查。贫血检查和评估应该在EPO治疗前实施。 3、贫血实验室检查内容贫血检查应包括：血红蛋白/红细胞压积（Hb/Hct），红细胞指标（红细胞计数、平均红细胞体积、平均红细胞血红蛋白量、平均红细胞血红蛋白浓度等），网织红细胞计数（有条件提倡检测网织红细胞血红蛋白量），铁参数（血清铁、总铁结合力、转铁蛋白饱和度、血清铁蛋白），大便粪隐血试验。 4、对于慢性肾脏病患者，如未发现有其它贫血原因，且血清肌酐>2mg/dl，则贫血最可能的原因是EPO缺乏。但如上述贫血检查提示存在EPO缺乏或缺铁之外的异常，则需要进一步的评估，以除外其它贫血原因（见附录：EPO抵抗原因）。 附图肾性贫血的检查流程
重组人促红细胞生成素的生产与应用
重组人促红细胞生成素的生产与应用 任雅怡3090102202 摘要重组人促红细胞生成素是成功应用于生物医药领域的重组蛋白药物产品。科研领域 对其性质和合成方法已有了成熟的了解。工业生产者也早已开始大量生产重组人促红细胞生成素，并且取得了不俗的市场成效。 关键词重组人促红细胞生成素生产工艺应用市场开发 一、重组人促红细胞生成素的性质 促红细胞生成素（erythropoietin,简称EPO）最早于1906年被发现。EPO属唾液糖蛋白激素，由165个氨基酸组成，为人体内源性化合物，糖基化位点为Asn24、Asn28、Asn83和Ser126,有2对半胱氨酸组成的二硫键(Cys7-Cys61和Cys29-Cys33)，分子量为34～36 ku (SDS-PAGE)、30.4 ku(超滤)或60 ku（凝胶电泳），疏水性极强,pI为3.75~4.15。它主要来源于肾脏（少量来源于肝脏），由皮质管周围的间质细胞合成。 由基因重组技术合成的rhEPO相对分子质量为30400道尔顿，为含165个氨基酸糖的酸性糖蛋白，由哺乳动物细胞培养产生，结构与天然EPO极为相似，其理化性质和生物学活性与天然内源性红细胞生成素相同。其不同点是基因位点在7号染色体。在基因重组技术诞生前，EPO主要从贫血患者的尿和绵羊血中提取，提取率非常低，且极不稳定，理化和生物性质难以测定。1985年，人EPO基因克隆和表达的成功，使rh-EPO的制备成为现实。 二、重组菌构建过程 重组人红细胞生成素，是以重组DNA技术生产的红细胞生成素，将红细胞生成素的基因连接到表达载体上，转化CHO细胞，从细胞培养上清液中纯化得到红细胞生成素。重组人红细胞生成素与天然人红细胞生成素具有相同的体内、体外活性，比活基本相当。 Jacob等人从基因文库中克隆并测序了编码红细胞生成素的DNA片段，同时，以核酸探针从λ噬菌体cDNA文库中筛选得到了编码红细胞生成素的cDNA片段，以此构建了SV40病毒启动子驱动表达的载体，在猴肾纤维母细胞COS-1中进行瞬时表达，测得了红细胞生成素的生物活性。Lin等人(1985)由人基因组中获得编码红细胞生成素的基因，将其转入中国仓鼠卵巢细胞系（CHO）中，获得稳定的表达。Quelle等人利用昆虫SF9细胞中的杆状病毒系统表达rhEPO。虽然经转化的SF9细胞生产的rhEPO的产率有所改善，但是目标产物rhEPO的糖基化程度较天然红细胞生成素为小，因而其分子量亦较小。Mori等人构建了一个含有干扰素-α基因启动子的rhEPO表达载体，并利用该rhEPO表达载体转化B 细胞白血病BALL-1细胞。经以仙台病毒转染后，转化的B细胞白血病BALL-1细胞比现有技术所得的转化株能产生较高量的rhEPO。重组红细胞生成素在大肠杆菌中也得到表达，但所得rhEPO仅具有体外抗原结合活性。至于家蚕体内的表达系统，也存在糖基化简单，药物在体内稳定性较低、活性较差等问题。在哺乳动物细胞CHO、BHK细胞系统中表达，
重组人促红细胞生成素的用药禁忌
如对您有帮助，可购买打赏，谢谢 重组人促红细胞生成素的用药禁忌 导语：在药物使用的时候，如果不注意一些药物的药物用量，使用方法，以及一些用药禁忌，反而不会达到治疗疾病的目的，还会影响我们的身体健康，像 在药物使用的时候，如果不注意一些药物的药物用量，使用方法，以及一些用药禁忌，反而不会达到治疗疾病的目的，还会影响我们的身体健康，像是重组人促进红细胞生长素，它的药物禁忌就是很重要的，下面我们就了解一下，该种药物的用药禁忌。 重组人红细胞生成素(rhuEPO)是最早用于临床的重组基因工程药物之一，可促进骨髓内原始血细胞加速分化，促进有核红细胞加快成熟及血红蛋白合成，刺激网织红细胞和成熟红细胞释放，并稳定红细胞膜，提高红细胞膜抗氧化酶功能。rhuEPO最初主要用于治疗慢性肾性贫血，之后随着对众多疾病相关性贫血的病理生理过程以及促红细胞生成素(EPO)、铁和红细胞生成三者间相互关系的深入认识，EPO的临床应用逐步扩展。促红细胞生成素(EPO)现阶段的临床应用主要有治疗慢性肾病、获得性免疫缺陷综合征(AIDS)、肿瘤、充血性心力衰竭、中枢神经系统疾病、认知功能受损、丙型肝炎病毒(HCV)感染等疾病患中、治疗中或恢复期的贫血和组织缺氧症状。 注射重组人红细胞生成素主要有三大用药禁忌： 1.未控制的重度高血压患者。 2.对本品或其他红细胞生成素制剂过敏者。 3.合并感染者，宜控制感染后再使用注射用重组人红细胞生成素。注射用重组人红细胞生成素应在相关医师或执业药师的指导下服用，期间应定期检查红细胞压积(用药初期每星期1次，维持期每两星期1次);使用注射用重组人红细胞生成素有时会引起血清钾轻度升高，应适 预防疾病常识分享，对您有帮助可购买打赏
促红细胞生成素的作用
促红细胞生成素的作用 良好的血液循环是组织细胞获得充足的氧和营养物质供应并排除代谢产物基本保证。各种原因引起组织器官血液灌注量减少时常发生缺血性损伤，而缺血的组织、器官经恢复血流灌注后不但不能使其功能和结构恢复，反而加重其功能障碍和结构损伤的现象称为缺血-再灌注损伤（ischemi-a-reperfusion injury）。肝缺血再灌注损伤(Hepatic ischemia reperfusion injury HIRI)是肝脏外科手术期间非常重要的并发症，一些长时间的肝脏大手术尤其是肝脏移植手术往往会存在肝脏缺血的过程[1]，同时肝缺血再灌注损伤还可以影响肝切除后肝脏的再生及肝功能的恢复，因此，如何进行围术期的肝脏保护研究，合理用药，防治肝脏缺血再灌注损伤将具有重要的临床意义。 肝缺血再灌注损伤主要产生机制主要为（1）氧自由基生成：（2）钙超载的损伤作用；（3）细胞凋亡；（4）炎性介质的释放；（4）kupffer细胞激活及中性粒细胞的聚集、黏附并活化，增强与内皮细胞黏附[2] ；（5）内皮素（ET）和一氧化氮（NO）浓度的失衡；（6）血小板激活因子的作用；（7）微循环功能障碍等。HIRI是由于各种机制相互影响，综合作用的结果。 促红细胞生成素（erythropoietin,EPO）是一种刺激骨髓造血的糖蛋白类激素，是一种含唾液酸的酸性蛋白。人类EPO基因位于7号染色体长臂22区，相对分子量为34，000，有4个糖基化位
点。自从1989年美国Amgen公司[3]在国际上首次研制成功重组人红细胞生成素（recombinant human erythropoietin, rHuEPO）, 其理化性质和生物学活性与天然内源性红细胞生成素相同。EPO 通过与靶细胞上特异性的EPO 受体(erythropoietin receptor，EPO-R)结合发挥生物效应。传统认识中，EPO 是一种作用于骨髓造血细胞，促进红系祖细胞增生、分化和成熟的内分泌激素，对机体供氧状况发挥重要的调控作用。随着近年来研究不断深入，对于EPO 的认识产生了一次革命性的飞跃，EPO 还可表现出非促红细胞生成作用。最近的研究[4]认为EPO是一种由缺氧诱导因子( hypoxia-inducibh factor, HIF)家族诱导产生的多功能细胞因子超家族成员,对于多种器官均有保护作用[5]。 研究已经发现，EPO 不仅在肾脏和肝脏中分泌，而且在脑、卵巢、输卵管、子宫和睾丸都有 EPO 的分泌，而 EPO 受体在骨髓的红细胞的前体细胞（erythroidprecursors）、巨核细胞（megakar -yocytes）、内皮细胞、脑的一些区域培养的神经元细胞以及胎盘、肾脏、心脏、肝脏均有表达。现有研究显示：rHuEPO 可与机体各处的 EPO-R 受体结合，发挥器官保护作用。目前，国内外研究报道，rHuEPO 对心、脑、肾等的 IRI 有保护作用，尤其对心、脑缺血再灌注损伤研究较多，而对肝脏的IRI的保护作用研究较少。研究表明促红细胞生成素除能调节红细胞生成以增加组织供氧外，还具有抗氧化、抗凋亡、抗炎及促进血管生成的作用，在对肝脏缺血再灌注损伤的保护具有一定的生物学机制。
促红细胞生成素EPO
浅析促红细胞生成素——兴奋剂 摘要：促红细胞生成素是由肾脏分泌产生的一种特异性糖蛋白，能够促进骨髓红细胞的增殖与成熟。其最早用来治疗遗传、癌症、慢性肾衰以及其他一些炎症引起的的贫血症，但是随着经济的发展和技术的更新，促红细胞生成素被作为一种兴奋剂逐渐应用于竞技比赛中，造成运动员身体的损伤以及比赛的不公平。笔者通过查阅相关文献，从促红细胞生成素的起源，解剖，功能及检测几个方面系统的整合促红细胞生成素的相关知识，为后续读者提供一个较为全面而清晰地学习框架。 关键词：EPO；兴奋剂；运动医学 EPO是促红细胞生成素（Erythropoietin）的英文简称，自从发现以来被广泛应用于耐力运动项目中。人体中的促红细胞生成素能够促进红细胞生成，明显提高人体的红细胞数量及血红蛋白的含量, 从而提高人体运输氧气的能力,提高人体的最大摄氧量, 所以EPO 与运动尤其是耐力运动关系十分密切。应用基因重组技术成功制造人重组促红细胞生成素( rhEPO) 后, 有些运动员试图通过服用rhEPO提高运动成绩, 但却忽略了服用rhEPO 的副作用,服用红细胞生成素可以使患肾病贫血的病人增加血流比溶度（即增加血液中红细胞百分比）。人体缺氧时，此种激素生成增加，并导致红细胞增生。EPO兴奋剂正是根据促红细胞生成素的原理人工合成，它能促进肌肉中氧气生成，从而使肌肉更有劲、工作时间更长。 一、EPO历史来源 （一）EPO简介 促红细胞生成素(EPO，Erythropoietin)也称为红细胞集落形成刺激物(ECSA)和红细胞生成刺激因子(ESF)，为哺乳动物调节红细胞生成的主要调控因子，1948 年Bonsdor 与Jalsvisto 首次发现，并于1977年由Migake从尿中分离纯化出来的。 人体内的EPO 为一种糖蛋白激素，大部分是肾脏中的酶样物质红细胞生成酶(Erythrogenin)作用于肝脏所生成的促红细胞生成素原(Erythropoietinogen)在血浆中转变而成的。一方面经血液运输到骨髓造血组织，可促进A LA 合成酶的生成。( r—酮基—8—氨基戊酸) ，促进血红素的合成，血红素生成后迅即与球蛋白结合成为血红蛋白( Hb) ，并
罗可曼Recormon(重组人红细胞生成素-β注射液)说明书
核准日期：2006年12月08日 修改日期：2010年06月13日 重组人红细胞生成素重组人红细胞生成素--β注射液说明书注射液说明书 请仔细阅读说明书并在医生指导下使用 【药品名称】 通用名称: 重组人红细胞生成素-β注射液 商品名称: 罗可曼? Recormon? 英文名称: Recombinant Human Erythropoietin β Injection 汉语拼音: Chongzu Ren Hongxibao Shengchengsu Beta Zhusheye 【成份】 主要组成成份: 重组人红细胞生成素-β 辅料包括：尿素，氯化钠，聚山梨醇酯-20，二水合磷酸二氢钠，十二水合磷酸氢二钠,二水合氯化钙，甘氨酸，左旋亮氨酸，左旋异亮氨酸，左旋苏氨酸，左旋谷氨酸，左旋苯丙氨酸，注射用水 【性状】 本品为无色、澄清或呈轻微乳状注射液。 【适应症】 本品适用于因慢性肾衰竭所致贫血，包括行血液透析、腹膜透析和非透析治疗者。 治疗接受化疗的非髓性恶性肿瘤成人患者的症状性贫血。 本品用于治疗贫血时,仅在出现贫血症状时方可使用。 【规格】 2000IU/0.3ml/支：每支预充式注射器内含2000IU 重组人红细胞生成素-?，装量为0.3 ml。 4000IU/0.3ml/支：每支预充式注射器内含4000IU 重组人红细胞生成素-?，装量为0.3 ml。
5000IU/0.3ml/支：每支预充式注射器内含5000IU重组人红细胞生成素-?，装量为0.3 ml。 6000IU/0.3ml/支：每支预充式注射器内含6000IU重组人红细胞生成素-?，装量为0.3 ml。 10000IU/0.6ml/支：每支预充式注射器内含10000IU重组人红细胞生成素-?，装量为0.6 ml。 【用法用量】 应由在上述适应症领域中有丰富经验的医生指导下进行罗可曼治疗。由于在个别的病例中观察到过敏样反应，建议在医学监护下进行首次给药。 应注意本品只有在溶液澄清或呈轻微乳状，无色且几乎无可见颗粒时方可用于注射。 预充式注射器中的药品是无菌的，但未做防腐处理。在任何情况下，每支注射器都不可以多次注射。 治疗成人和儿童慢性肾功能衰竭患者的症状性贫血。 患者贫血的症状和后遗症随着年龄，性别和疾病总负荷的不同而有所不同；医生有必要对个体患者的临床病程和状态进行评价。可以通过皮下或静脉注射罗可曼来升高血红蛋白的水平，使其不超过12g/dl (7.5mmol/l)。对于未进行血液透析的患者，首选皮下注射给药以避免刺穿外周静脉。 如果静脉注射给药，应在约2分钟内完成，例如，对于血液透析患者在透析结束时经动静脉瘘管注入。 因为病人的个体差异，临床上可以观察到个别患者的血红蛋白值偶尔超过或低于预期的血红蛋白水平。考虑到血红蛋白靶浓度在10g/dl（6.2mmol/l）到12g/dl（7.5mmol/l）之间，可以通过剂量管理达到不同的血红蛋白水平。应该避免出现持续的血红蛋白水平超过12g/dl (7.5mmol/l)；当血红蛋白值超过12g/dl (7.5mmol/l)时，可根据以下指导原则调整剂量： 应当避免出现用药4周后血红蛋白水平升高幅度超过2g/dl(1.25mmol/l)。如果出现上述情况，应按照如下原则调整剂量。如果一个月后血红蛋白升高幅度超过2g/dl (1.25mmol/l)或血红蛋白水平正在升高并接近12g/dl(7.45mmol/l)，剂量应减少25％。如果血红蛋白水平持续升高，应该停止治疗直到血红蛋白水平开始降低，然后以低于前次给药剂量25％的剂量重新开始治疗。 应密切监测患者，确保采用最低剂量的罗可曼能够足够控制患者的贫血症状。 当出现高血压或心血管，脑血管或外周血管疾病时，应按患者的个体状况来确定血红蛋白每周升高的幅度和治疗靶浓度。 罗可曼的治疗分为两个阶段： 1．纠正期： — 皮下注射给药：
重组人促红细胞生成素
临床上EPO不仅用于治疗肾性贫血，而且已经被应贫血的治疗8]。尽管输血由于起效快、价格低等有利因素在临床治疗中被广泛应用，但是它也存在诸多潜在危险，如感染、输血反应，严重时甚至引起死亡。而注射EPO则能有效地避免这些输血并发症。 1985年，人们运用重组技术[9表达了重组人红细胞生成素(rHuEPO)。 rHuEPO 生产细胞株CHO2EPO C2 重组人红细胞生成素( rHuEPO) 是利用基因工程技术,将人的红细胞生成素基因转入哺乳动物细胞内,高效表达的能刺激红细胞生成的糖蛋白激素,用于治疗慢性肾功能衰竭和癌症化疗产生的贫血[122 ] [1 ] Oh J H ,Ha H , Yu M R ,et al . Sequential effects of high glucose on mesangial cell TGF2β1 and fibronectin synthesis[J ] . Kidney Int ,1998 , 54 :187221878. [2 ] Border WA ,Noble N A. TGF2beta in kidney fibrosis :A target for gene therapy[J ] . Kidney Int ,1997 ,51 (5) :138821396. 重组EPO(rHuEPO) 由于EPO在体内的作用巨大而天然来源却十分有限(主要从贫血患者的尿中提取)，人们便开始利用基因重组的分子，它由不同的糖化体构成，各种糖化体的区别主要表现在糖基在整个分子中所占的比例不同，而这个比例也的作用极为相似，它一方面能够刺激骨髓造血功能，及时有效地增加红细胞的数量；另一方面能够增强机体对氧的结合、运输和供应能力，有利于在高强度竞技时改善缺氧状态，促进肌肉中氧生成，使肌肉更有力、工作时间更长，从而增强运动能力。长期使用rHuEPO，对运动员来说，可能会带来一时的荣誉，但给其健康带来的却是永久的危量过度增加，当血红蛋白含量超过55％时，血液粘滞度就会增高，同时血流也会变慢。加上外界因素如运动脱水、环境压力和不合理医务监督等，当血红蛋白含量升高至65％甚至70％以上时，血流速度过慢，引起工作肌缺氧，有可能导致静脉微血栓形成，从而引起肺栓塞、中风和死亡。 目前市场销售的促红细胞生成索制剂中，虽然厂家及产品名称不同(如益比奥、生血素、利血宝等)，但其结构、功能及代谢规律均非常相似。2002年盐湖城冬奥会后，NESP作为一种新型的rHuEPO类兴奋出现。 重组技术生产的rHuEPO是一种酸性糖蛋白，分子量为29．8士0．3kDa，于1985年问世并成为注册药物。它来启动子构建成表达载体后，以不同的细胞株[有中国仓鼠卵细胞(CH0)、幼仓鼠肾细胞(BHK)及C127小鼠纤维细3]作为受体进行表达，获取rHuEPO，所以rHuEPO 的氨基酸序列与正常EPO完全相同，仅糖基部分有微小差别。由此可见，rHuEPO与EPO 在结构上的不同是N-端唾液酸含量的差异[10。 Ca q-Darbepoetin也称新红细胞生成刺激蛋白(novel e—rythropoiesis stimulating protein，NESP)，其商品名为Aranesp，是一种高糖基化的rHuEPO类似物口1,123。Darbepoetin 同样能够促进红细胞的产生，并且其不良反应发生率和死亡率都与rHuEPO相似，但Darbepoetin可能引起的高血压和凝血事件比rHuEPO少。由于它与禁药目录中的EP0有同样的功效，所以同样也属于禁用药物。Darbepoetin含有5个N一糖链和比rHuEPO多的唾液酸残基这两个额外的、包含硅酸的N一多糖链按顺序被放在EP0肽链主干的氨基酸位置上，既不改变蛋白质的结构，也不影响与受体的结合。Darbepoetin的分子量(36．8±0．4kDa)比rHuEPO 大，其糖基含量也由40％增加到52％[13J“。由于糖基含量的增加，它的半衰期(t。／2)比rHuEP0延长2倍，体内的药效作用时间更长久。并且，Darbepoetin有较好的代谢稳定性和较长的半衰期，持续时间比10倍剂量的rHuEPO还要长，所以可以延长给药的时间间隔，减少给药次数口“，是临床用药的又一重大突破。 检测