土霉素

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土霉素生产工艺实训实验报

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姓 名： 徐泽波 班 级： 生物07-1 学 号： 200710513065 指导教师： 张欣

学校代码： 10128

专 业： 生物工程

目录

第一章绪论 (3)

1.1 土霉素简介 (3)

1.2 实验的目的、要求与过程 (3)

第二章设备型号 (4)

第三章实验过程 (5)

3.1种子培养基的制备与灭菌 (5)

3.2发酵培养基的制备与灭菌 (5)

3.3发酵 (6)

3.4测定前发酵样品预处理： (6)

3.5土霉素发酵液的酸化提取 (6)

3.6树脂预处理方法： (7)

3.7结晶与干燥 (7)

3.8标准曲线的绘制： (8)

3.9．标准曲线的绘制： (9)

第四章讨论 (10)

4.1实验数据 (10)

4.2实验心得 (10)

参考文献 (11)

第一章 绪论

一、土霉素的简介

土霉素是四环类抗生素，其在结构上含有四并苯的基本母核，随环上取代基的不同或位置的不同而构成不同种类的四环素类抗生素。其结构和命名如图。

土霉素是由龟裂链丝菌产生的，属于放线菌中的链霉菌属，他们具有发育零号的菌丝体，菌丝体分枝捂隔膜，直径约为0.4~1.0米，长短不一，多核。菌丝体有营养菌丝、气生菌丝和孢子丝之分，孢子丝分化成为分生孢子，而龟裂链丝菌的菌落为灰白色，后期生褶皱，成龟裂状。

土霉素是典型的次级代谢产物，其发酵的特点之一就是分批过程分为菌体的生长期、产物期和菌体期三个阶段。龟裂链丝菌的生长和土霉素的生物合成受到许多发酵条件的影响：温度、发酵PH 值、溶氧、接种量、泡沫等。同时还受到一些代谢调控机制的控制，磷酸盐的的调节作用、ATP 的调节和产生菌生长速率的调节等。

二、实验的目的、要求与过程

通过专业实训的综合训练我们了解了一种生物产品从上游的菌种培养、发酵工段到下游的提取纯化等工段的完整的生产过程。实训过程中锻炼了学生的动手与思考能力，同时让学生对土霉素这一生产过程有了充分的认识，为后续的课程设计以及毕业设计打下了良好的基础，减少不必要的错误，是实验更加完善。 实训要求我们掌握土霉素生产的工艺流程，掌握分批发酵的原理，熟悉发

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酵罐的灭菌与使用方法；观察并记录上罐发酵过程中菌体的生长变化；掌握土霉素提取结晶等工艺的原理及操作步骤；掌握土霉素效价的测定原理及方法。

实训按照土霉素的生产工艺流程进行，先进行培养基的配制及灭菌，然后菌种培养并开始发酵，最后对发酵液处理以及测定产品的效价。由于实训时间需要很长，并且实验设备有限，所以我们分组分批进行实验，彼此合作，相互协调。发酵过程中需要在一定时间内进行OD值的测定以及观察发酵罐的工作情况，此时我们小组每个人都很积极参与，使实训顺利完成。

第二章设备型号

主要使用的设备有：

①空气恒温振荡器 HZQ-C 型

②电子天平型号-MP2002; цax—200g; e—0.1g ; d—0.01g.

③分管光度计721 单位：上海精密科学仪器有限公司

④发酵罐编号：20051829 ；单位：0303 BICF-2002型

⑤空气压缩机储气罐型号：CW120C 编号 F0407303 单位：台州市寓芳压缩机

⑥静音式全无忧空压机单位：鞍山佳朋压缩机有限公司

⑦离心机 LG10-2.4A 北京医用离心机厂

⑧树脂柱上海亚荣生化仪器厂

⑨电热复空干燥箱编号：20041041 型号：2K-82BB型单位：上海实验仪器有限公司

⑩自动压力蒸汽灭菌机型号：GI54DW

磁力搅拌器型号：JB-1

第三章实验过程

3.1、种子培养基的制备与灭菌

无菌条件下，从冷藏的产生菌的斜面孢子中，刮取适量孢子涂在高氏斜面上，然后置36.5～37℃的恒温箱培养3天，再置30℃的恒温室培养1天。按母瓶培

，冷却后调pH 养基成分配比，配制培养基，并加淀粉酶液化后，再加入CaCO

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值，分装，包装灭菌。接种在超净工作台上，将长好的斜面孢子用无菌接种铲挖块约2cm2，接种于灭过菌的摇瓶种子培养基中。

灭菌条件：在高压蒸汽灭菌锅内保持121℃,0,14MPa下，20分钟即可。3.2、发酵培养基的制备与灭菌

种子培养基配方表

成分配比

淀粉15%

黄豆饼粉2%

硫酸铵 1.4%

碳酸钙 1.4%

玉米浆0．4%

氯化钠0.4%

磷酸二氢钾0.01%

氯化钴10μg/ml

淀粉酶0.1%-0.2% 按发酵瓶培养基成分配比，配制培养基，并加淀粉酶液化后，在加入CaCO3，冷却后调pH值7.0-7.2分装，包装灭菌。

灭菌条件：在高压蒸汽灭菌锅内保持121℃,0,14MPa下，20分钟即可。

3.3 发酵

发酵液2.5升装入发酵罐，离座灭菌。接入电源，将已灭菌的发酵培养基通入无菌空气，调整好发酵罐的各类初始参数：温度为30℃、pH6.5、搅拌100r/min、泡沫和消泡剂自动调节等。12小时后观察是否生长杂菌，再将无水乙醇倒入接种口的环槽内，点燃后，进行无菌接种操作，接种量一般为10%。通气量为1:0.5～1.0vvm,全程用消泡剂消泡，发酵过程过程通氨，当接种后，发酵pH低于 6.5时就可以开始通氨，通氨量的多少参考pH值。要求72小时前pH在6.3～6.6,72～120小时pH在6.2～6.4,120～144小时pH在6.0～6.2。土霉素发酵周期约为七天，每隔24小时测一次龟裂链霉菌的菌丝浓度，采用721分光光度计在620nm 下测发酵液OD值，在菌丝接近自溶前放罐，得到土霉素发酵液。

3.4 测定前发酵样品预处理：

发酵瓶摇匀，将少量导入小烧杯，测pH、用9mol/l的盐酸溶液酸化pH至1.7～2.0搅拌10分钟。取5ml酸化液至7ml离心管，6000转离心4分钟，取上清液，备测。

3.5 土霉素发酵液的酸化提取

酸化过程采用草酸酸化，加入草酸的目的是释放菌丝中的单位，同时要保证土霉素的稳定性、成品的质量和提炼成本。目前，工业提炼的pH控制在1.6-2.0范围内，pH值过高对单位的释放不利，pH值过低会影响产品的质量，发酵中存在着许多有机和无机的物质，加入净化剂黄血盐和硫酸锌除去铁离子和蛋白质。

取一定体积发酵液，边搅拌，边加黄血盐，硫酸锌，并加草酸酸化发酵液，调到所需pH=1.75值后，搅拌30分钟。酸化后，要将酸化液进行适当稀释，一般稀释2-3倍，有利于过滤脱色过程。

3.6．树脂预处理方法：

将准备装柱使用的新树脂，先用热水反复清洗，阳离子交换树脂可用70℃-80℃的热水，开始浸洗时，每隔约15分钟换水一次，浸洗时不要搅动，换水4-5次后，每隔约30分钟换水一次，总共换水7-8次，浸洗值浸洗水不带褐色，泡沫很少时为止。水洗后，在经酸碱处理，阳离子交换树脂按以下步骤处理：

①用1N盐酸浸泡树脂，盐酸用量为树脂自身体积的3-5倍，浸泡2-3.5

小时。

②用自来水冲洗至出水pH为5左右，用3倍树脂体积5%的Nacl浸泡2小时。

③用1N氢氧化钠浸泡树脂，用量约为树脂本身体积的3-5倍，浸泡2-3.5小时。

④用水冲洗至出水pH为9左右。

⑤用1N盐酸浸泡树脂，盐酸用量为树脂自身体积的3-5倍，浸泡2-3.5小时。

⑥用酸浸泡完后用去离子水冲洗至出水pH为6以上即可投入使用。

⑦．对于阴离子交换树脂水洗后的酸碱处理次序，可采用酸-碱-酸的次序。

树脂处理过程中，用碱浸泡树脂，颜色由本身的橘黄色变为棕黑色，再用酸浸泡，树脂颜色又由原来棕黑色变为橘黄色。将树脂填好后用恒速泵将酸化液0.7ml/min泵入树脂柱，进行酸化液脱色。脱色时恒速泵流速不能太大，以免造成脱色不充分。然后将一定量脱色液放入烧杯，用碱化剂调pH值到土霉素等电点附近，恒温28-30℃用磁力搅拌器搅拌结晶，搅拌转数为70rpm/min。

3.7．结晶与干燥：

取一定量脱色液放入4个锥形瓶中，用氨水调pH值为4.6，恒温30℃用磁力搅拌器搅拌，结晶，搅拌转数为70rpm，结晶一小时。

将结晶液离心，取上清液测定其在500nm下透光率和效价，计算出结晶收率。湿晶体经过冲洗后,放入水分测定仪中进行干燥，测定干粉的质量，然后将干粉溶解于1000ml酸水中，测定其效价，计算干粉的效价及离心干燥收率。

3.8．相关数据的测定：

pH的测定

（1）测样品不宜在室温下放置时间过长，应当在取样2分钟之内测定完，不能直接测定的样品应收样放入冰箱，如需测定时提前从冰箱中取出放至室温测定。

（2）打开酸度计，调节温度补偿旋钮至室温。

（3）用pH=6.86和pH=4.0的缓冲液校准pH计。

（4）校准后，纯净水冲洗电极，将电极放入被测样中，待读数稳定后读数。

（5）测定样品后应该用纯净水冲洗电极，不用时应将电极放置在饱和氯化钾溶液中。

发酵液效价的测定：

（1）取样品加9mol/L的盐酸溶液，先酸化至pH=1.5-1.7, 用酸度计测量，放置5分钟，过滤至5ml以上，吸取滤液稀释适宜倍数（使稀释后效价在标准曲线范围内），用移液管取1ml稀释液于试管中，准确加入0.01mol/L的盐酸，使全量为20ml，再加入0.05%g/ml的三氯化铁溶液10ml，使全量为20ml，摇匀，放置20分钟，另取1ml稀释液，加入0.01mol/L的盐酸19ml，使全量为20ml，摇匀，放置20分钟，作为空白，在480nm的波长下测两种液体的吸光度。

（2）提取过程中间样效价的测定：

取中间样，稀释至适宜倍数（使稀释后效价在标准曲线范围内），以下操作同发酵液效价的测定方法。

（3）效价计算：将测定的吸光度值代入标准曲线方程，再乘以稀释倍数即得各步效价。

3.9．标准曲线的绘制：

标准称取土碱标品25mg，置于三角瓶内，加0.1mol/L盐酸，4mol使之完全

溶解，再用0.01mol/L盐酸按下列公式稀释成标准液，其中，w为土碱标准品称样量。

0.01mol/L盐酸加入量（ml）=土霉素效价*w(mg)/500—4ml

精密量取标液0.5ml，1.0ml，1.5ml，2.0ml，2.5ml，3.0ml，分别放入50ml 三角瓶中，分别加入0.025%Fecl3溶液至总体积20ml，放入38±1℃水浴中，放置3min，冷却至室温测定吸收度，测定波长500nm，同时做空白试验，不加Fecl3溶液其他相同，总体积20ml。

以吸收度为纵坐标，土霉素效价单位为横坐标，绘制曲线并计算回归方程及相关系数。Y为测吸收值，x为曲线中土霉素浓度，r应在0.9990—1.001之间。

b=∑xy-nxy/zx2-nx2 a=y-bx

r=zxy-nxy/[(zx2-nx2)(zy2-ny2)]1/2

第四章讨论

一、实验数据

组别第一次测量第二次测量第三次测量平均

1 0.125 0.150 0.195 0.157

2 0.085 0.090 0.08

3 0.086

3 0.26

4 0.22

5 0.234 0.241

4 0.271 0.289 0.309 0.290

5 0.124 0.139 0.149 0.137

6 0.348 0.369 0.384 0.367

7 0.334 0.312 0.332 0.326

8 0.293 0.341 0.345 0.326

9 0.321 0.329 0.338 0.329

10 0.229 0.314 0.325 0.289

最终测的效价为0.0005。

二、实验心得

很明显我们的最终结果数据偏低，分析原因可能是因为之前的酸化过程中草酸的量过多导致的，由于分光光度计的原因，OD值测的数据偏差比较明显，应快速侧量，避免因沉积而造成吸收度的提高。虽然效价很低，但是最终做出来的产品还是很不错的。

本次实验由于人数过多，所以采用团队协调的方法进行实验，这使我们了解到团队合作的重要性，我们各小组之间的相互配合不够好也是我们实验失败的原

因之一。

实验虽然失败了，但是我们从中获益良多。通过这次实训，我们对土霉素的工艺流程到下游的提取工段有了一个清晰的认识。掌握了高压蒸汽灭菌锅的操作，掌握了接种的步骤及发酵罐过程的控制，掌握了树脂分离的方法，并利用自己的专业知识解决了实验中面临的各种问题，为将来的工作学习打下良好的基础。

参考文献

?周德庆微生物学教程北京：高等教育出版社2002

?https://www.360docs.net/doc/8217984321.html,/forum/dispbbs.asp?BoardID=19﹠ID=315

?https://www.360docs.net/doc/8217984321.html,

?李永利土霉素酸化提取工艺研究内蒙古石油化工 2009年第11期 CNKI

?田彩霞，赵建强，土霉素结晶工艺改进研究中国抗生素杂志 2006?：178-180 ?马永林，王晋，梁存珍，杨敏。土霉素结晶母液酸化水解过程的研究环境科学。https://www.360docs.net/doc/8217984321.html,KI