丙烯酰胺凝胶电泳原理
丙烯酰胺凝胶电泳
聚丙烯酰胺凝胶电泳适宜分离鉴定低分子量蛋白质、小于1Kb的DNA片段和DNA 序列分析.其装载的样品量大，回收DNA纯度高.长度仅相差0.2%(即500bp中的1bp)的核苷酸分子即能分离.
聚丙烯酰胺凝胶有以下特点：
①聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺和N，N'甲叉双丙烯酰胺聚合而成的大分子。凝胶是带有酰胺侧链的碳-碳聚合物，没有或很少带有离子的侧基，因而电渗作用比较小，不易和样品相互作用。
②由于聚丙烯酰胺凝胶是一种人工合成的物质，在聚合前可调节单体的浓度比，形成不同程度交链结构，其空隙度可在一个较广的范围内变化，可以根据要分离物质分子的大小，选择合适的凝胶成分，使之既有适宜的空隙度，又有比较好的机械性质。
③在一定浓度范围聚丙烯酰胺对热稳定。凝胶无色透明，易观察，可用检测仪直接测定。
④丙烯酰胺是比较纯的化合物，可以精制，减少污染。合成聚丙烯酰胺凝胶的原料是丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺。丙烯酰胺称单体，甲叉双丙烯酰胺称交联剂，在水溶液中，单体和交联剂通过自由基引发的聚合反应形成凝胶。
聚丙烯酰胺凝胶电泳可分为连续的和不连续的两类，前者指整个电泳系统中所用缓冲液，pH值和凝胶网孔都是相同的，后者是指在电泳系统中采用了两种或两种以上的缓冲液，pH值和孔径，不连续电泳能使稀的样品在电泳过程中浓缩成层，从而提高分辨能力。
在聚丙烯酰胺凝胶形成的反应过程中，需要有催化剂参加，催化剂包括引发剂和另速剂两部分。引发剂在凝胶形成中提供始自由基，通过自由基的传递，使丙烯酰胺成为自由基，发动聚合反应，加速剂则可加快引发剂放自由基的速度。常用的引发剂和加速剂的配伍如下表：
聚合反应催化剂配伍
注：(NH4)2S2O8，过硫酸胺；TEMED：N，N，N，N'；四甲基乙二胺； DMAPN：β-二甲基胺基丙腈
用过硫酸铵引发的反应称化学聚合反应；用核黄素引发，需要强光照射反应液，称光聚合反应。聚丙烯酰胺聚合反应可受下列因素影响： 1、大气中氧能淬灭自由基，使聚合反应终止，所以在聚合过程中要使反应液与空气隔绝。 2、某些材料如有机玻璃，能抑制聚合反应。 3、某些化学药物可以减慢反应速度，如赤血盐。 4、温度高聚合快，温度低聚合慢。以上几点在制备凝胶时必须加以注意。
聚丙烯酰胺凝胶孔径的大小是由丙烯酰胺的浓度决定的，不同浓度丙烯酰胺和DNA的有效分离范围见下表.
*表中给出的数字为与指示剂迁移率相等的双链DNA分子所含碱基对数目(bp).
双向凝胶电泳(2-DE)_百替生物
双向凝胶电泳（2-DE） 双向凝胶电泳的原理是第一向基于蛋白质的等电点不同用等电聚焦分离，第二向则按分子量的不同用SDS-PAGE分离，把复杂蛋白混合物中的蛋白质在二维平面上分开。近年来经过多方面改进已成为研究蛋白质组的最有使用价值的核心方法。 分离蛋白质组所有蛋白的两个关键参数是其分辨率和可重复性。在目前情况下，双向凝胶电泳的一块胶板（16cm×20cm）可分出3～4千个，甚至1万个可检测的蛋白斑点，这与10万个基因可表达的蛋白数目相比还是太少了。80年代开始采用固定化pH梯度胶，克服了载体两性电解质阴极漂移等许多缺点而得以建立非常稳定的可以随意精确设定的pH梯度。由于可以建立很窄的pH范围（如0.05U/cm)，对特别感兴趣的区域可在较窄的pH范围内做第二轮分析，从而大大提高了分辨率。此种胶条已有商品生产，因此基本上解决了双向凝胶电泳重复性的问题。这是双向凝胶电泳技术上的一个非常重要的突破。第二向SDS-PAGE有垂直板电泳和水平超薄胶电泳两种做法，可分离10～100kD分子量的蛋白质。 其中灵敏度较高的银染色法可检测到4ng蛋白，最灵敏的还是用同位素标记，20ppm的标记蛋白就可通过其荧光或磷光的强度而测定。用图像扫描仪、莱赛密度仪、电荷组合装置可把用上述方法得到的蛋白图谱数字化，再经过计算机处理，去除纵向和横向的曳尾以及背景底色，就可以给出所有蛋白斑点的准确位置和强度，得到布满蛋白斑点的图像，即所谓“参考胶图谱”。蛋白质组研究的主要困难是对用双向凝胶电泳分离出来的蛋白，进行定性和定量的分析。最常用的方法是先把胶上的蛋白印迹到PVDF(polyvinylidene difluoride)膜上后再进行分析，确定它们是已知还是未知蛋白。现在的分级分析法是先做快速的氨基酸组成分析，也可先做4～5个循环的N末端微量测序，再做氨基酸组成分析；结合在电泳胶板上估计的等点电和分子量，查对数据库中已知蛋白的数据，即可作出判断。有文献报道，N末端4个残基序列的数据就可以给出很多的信息而得到相当准确的结果。如再结合C末端序列，判断结果的准确性会更高。对分离得到的蛋白质作进一步的确切鉴定需要有足够数量的纯蛋白，电泳时蛋白质已经过了高度纯化。现在一块胶板可允许上到高达mg数量级的样品，因此每个分离的蛋白斑点可有μg数量的蛋白，这样使本来是微量的蛋白也可希冀被鉴定。 蛋白质的翻译后修饰和加工，是指在肽链合成完成后进行的化学反应，如磷酸化、羟基化、糖基化、二硫键形成，以及最近发现的蛋白质自剪接等等，可能有一百种以上。翻译后修饰和加工对蛋白质的正常生理功能是必需的，它们的变化往往和疾病的发生有关。用双向凝胶电泳可以进行翻译后修饰的研究，如用32P标记可以研究磷酸化蛋白的变化。双向凝胶电泳中常可发现的蛋白质拖曳现象，很可能是一个蛋白的不同翻译后修饰产物所造成的。拖曳图像变化在疾病诊断上可能提供重要的信息。 双向凝胶电泳技术当前面临的挑战是：(1)低拷贝蛋白的鉴定。人体的微量蛋白往往还是重要的调节蛋白。除增加双向凝胶电泳灵敏度的方法外，最有希望的还是把介质辅助的激光解吸/离子化质谱用到PVDF膜上，但当前的技术还不足以检出拷贝数低于1000的蛋白质。(2)极酸或极碱蛋白的分离。(3)极大（＞200kD）或极小（＜10kD＝蛋白的分离。(4)难溶蛋白的检测，这类蛋白中包括一些重要的膜蛋白。(5)得到高质量的双向凝胶电泳需要精湛的技术，因此迫切需要自动二维电泳仪的出现。 双向电泳操作方法 1蛋白质样品制备 秧苗蛋白质样品的提取按Davermal等（1986）的方法进行。100mg材料剪碎后加入10mgPVP-40(聚
双向电泳笔记
1.当你在首次对未知样品进实验时，建议你使用以下的样品溶液： 将蛋白溶解在： ·8M尿素，4%CHAPS, 60 mM DTT, 2% Pharmalyte 3-10, 0.002%溴酚蓝。 溶解大蛋白或疏水蛋白量更难溶的蛋白可以使用以下方法： ·7M尿素，2M硫脲，4%CHAPS, 60M DTT, 2% Pharmalyte pH 3-10, 0.002%溴酚 蓝。 2.为了从蛋白含量很低并且含有大量干扰物质的组织（如植物组织）中制备样品，你可以使用以下推荐方法。该方法产生的蛋白溶液中不包含盐，核酸及其它污染物。 ·将组织在研钵中用液氮研碎。将粉末悬浮在含有10%TCA，0.3%DTT的丙酮中。 在-18?C 条件下过夜并离心。用丙酮清洗沉淀，干燥沉淀并将沉淀溶于9M尿素， 2%CHAPS,1%DTT,2% Pharmalyte 3-10(52,63)中。 3.等电聚焦在变性条件下进行，能产生高分辩率和高清晰度的结果。利用尿素和去污剂的混合液，能达到完全的变性和溶解，确保各种蛋白质以单一形态存在，并且减少凝集和分子间的相互作用。 尿素（Urea）:使蛋白质溶解和变性，通常使用浓度为8mol/L，但为了使蛋白质完全溶解的需要，尿素的浓度往往增加到9或9.8mol/L。 CHAPS :促使疏水蛋白质溶解并减少蛋白质间的结合 还原剂：打断二硫键使蛋白质完全展开，往往使用DTT或DTE 载体两性电解质混合物：载体两性电解质的混合物在等电聚焦过程中不影响梯度，还能促进样品的溶解度，并且等电聚焦过程中在整个梯度范围内能产生更一致性的导电性。 经典的再水化液组成：8 M urea, 0.5% (w/v)CHAPS, 0.2%(w/v)DTT, 0.5% IPG缓冲液或Pharmalyte, 0.002%溴酚蓝。 ***不要让干燥的IPG胶条在室温下存留时间超过10分钟，胶条会从空气中吸收水分，将IPG 胶条密封好在-20℃以下温度保存。再水化至少需要十个小时。 矿物油加入：利用微量移液器从槽的一端逐滴加入，直至一半条胶被覆盖，然后从另一端逐滴加入，直至整条胶被覆盖。 ****聚焦时间过长会发生过聚焦，导致产生水平的条纹,可以在双向电泳的最后结果中见到。 4.可选操作：加入分子量标准蛋白。
琼脂糖凝胶电泳及其影响因素
琼脂糖凝胶电泳及其影响因素 琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳是分离鉴定和纯化DNA片段的标准方法。该技术操作简便快速，可以分辨用其它方法（如密度梯度离心法）所无法分离的DNA片段。当用低浓度的荧光嵌入染料溴化乙啶(Ethidium bromide, EB)染色,在紫外光下至少可以检出1-10ng的DNA条带,从而可以确定DNA片段在凝胶中的位置。此外,还可以从电泳后的凝胶中回收特定的DNA条带,用于以后的克隆操作。 琼脂糖和聚丙烯酰胺可以制成各种形状、大小和孔隙度。琼脂糖凝胶分离DNA片度大小范围较广,不同浓度琼脂糖凝胶可分离长度从200bp至近50kb的DNA片段。琼脂糖通常用水平装置在强度和方向恒定的电场下电泳。聚丙烯酰胺分离小片段DNA(5-500bp)效果较好,其分辩力极高,甚至相差1bp的DNA片段就能分开。聚丙烯酰胺凝胶电泳很快,可容纳相对大量的DNA,但制备和操作比琼脂糖凝胶困难。聚丙烯酰胺凝胶采用垂直装置进行电泳。目前,一般实验室多用琼脂糖水平平板凝胶电泳装置进行DNA电泳。 琼脂糖主要在DNA制备电泳中作为一种固体支持基质,其密度取决于琼脂糖的浓度。在电场中,在中性pH值下带负电荷的DNA向阳极迁移,其迁移速率由下列多种因素决定: 1、 DNA的分子大小: 线状双链DNA分子在一定浓度琼脂糖凝胶中的迁移速率与DNA分子量对数成反比，分子越大则所受阻力越大，也越难于在凝胶孔隙中蠕行，因而迁移得越慢。 2、琼脂糖浓度 一个给定大小的线状DNA分子,其迁移速度在不同浓度的琼脂糖凝胶中各不相同。DNA电泳迁移率的对数与凝胶浓度成线性关系。凝胶浓度的选择取决于DNA分子的大小。分离小于0.5kb的DNA片段所需胶浓度是1.2-1.5%,分离大于10kb的DNA分子所需胶浓度为0.3-0.7%, DNA片段大小间于两者之间则所需胶浓度为0.8-1.0%。 3、 DNA分子的构象 当DNA分子处于不同构象时,它在电场中移动距离不仅和分子量有关,还和它本身构象有关。相同分子量的线状、开环和超螺旋DNA在琼脂糖凝胶中移动速度是不一样的,超螺旋DNA移动最快,而线状双链DNA 移动最慢。如在电泳鉴定质粒纯度时发现凝胶上有数条DNA带难以确定是质粒DNA不同构象引起还是因为含有其他DNA引起时,可从琼脂糖凝胶上将DNA带逐个回收,用同一种限制性内切酶分别水解,然后电泳,如在凝胶上出现相同的DNA图谱,则为同一种DNA。 4、电源电压 在低电压时,线状DNA片段的迁移速率与所加电压成正比。但是随着电场强度的增加，不同分子量的DNA片段的迁移率将以不同的幅度增长,片段越大,因场强升高引起的迁移率升高幅度也越大,因此电压增加，琼脂糖凝胶的有效分离范围将缩小。要使大于2kb的DNA片段的分辨率达到最大,所加电压不得超过5v/cm。 5、嵌入染料的存在 荧光染料溴化乙啶用于检测琼脂糖凝胶中的DNA,染料会嵌入到堆积的碱基对之间并拉长线状和带缺口的环状DNA，使其刚性更强,还会使线状DNA迁移率降低15％。 6、离子强度影响 电泳缓冲液的组成及其离子强度影响DNA的电泳迁移率。在没有离子存在时(如误用蒸馏水配制凝胶),电导率最小,DNA几乎不移动,在高离子强度的缓冲液中(如误加10×电泳缓冲液),则电导很高并明显产热,严重时会引起凝胶熔化或DNA变性。
实验二 琼脂糖凝胶电泳实验知识交流
实验二琼脂糖凝胶电 泳实验
实验二琼脂糖凝胶电泳实验 【实验目的】 （1）学习琼脂糖凝胶电泳的基本原理； （2）掌握使用水平式电泳仪的方法； （3）学习在含有甲醛的凝胶上进行RNA电泳的方法。 【实验原理】 琼脂糖凝胶电泳是基因工程实验室中分离鉴定核酸的常规方法。核酸是两性电解质，其等电点为 pH2-2.5，在常规的电泳缓冲液中（pH约8.5），核酸分子带负电荷，在电场中向正极移动。核酸分子在琼脂糖凝胶中泳动时，具有电荷效应和分子筛效应，但主要为分子筛效应。因此，核酸分子的迁移率由下列几种因素决定： （1）DNA的分子大小。线状双链DNA分子在一定浓度琼脂糖凝胶中的迁移速率与DNA分子量对数成反比，分子越大则所受阻力越大，也越难于在凝胶孔隙中移动，因而迁移得越慢。 （2）DNA分子的构象。当DNA分子处于不同构象时,它在电场中移动距离不仅和分子量有关,还和它本身构象有关。相同分子量的线状、开环和超螺旋质粒DNA在琼脂糖凝胶中移动的速度是不一样的，超螺旋DNA移动得最快，而开环状DNA移动最慢。如在电泳鉴定质粒纯度时发现凝胶上有数条DNA带难以确定是质粒DNA不同构象引起还是因为含有其他DNA引起时，可从琼脂糖凝胶上将DNA带逐个回收，用同一种限制性内切酶分别水解，然后电泳，如在凝胶上出现相同的DNA图谱，则为同一种DNA。 （3）电源电压。在低电压时，线状DNA片段的迁移速率与所加电压成正比。但是随着电场强度的增加，不同分子量的DNA片段的迁移率将以不同的幅度增长，片段越大，因场强升高引起的迁移率升高幅度也越大，因此电压增加，琼脂糖凝胶的有效分离范围将缩小。要使大于2kb 的DNA 片段的分辨率达到最大，所加电压不得超过5v/cm。
电泳原理.pdf
电泳原理 阳极电泳用水溶性树脂是一种高酸值的羧酸盐，在水中溶解后以分子和离子平衡 状态存在于直流电场中，通电后，由于两极的电位差，离子定向移动，阴离子沉积在阳极表面，而阳离子在阴极表面获得电子还原成胺，它是一个电化学反应，包括电泳、电解、电沉 积和电渗四个同时进行的过程。 1.电泳：在直流电压作用下，分散在介质中的带电胶体粒子在电场作用下向与其所 带电荷相反的电极方面移动，叫电泳。 2.电沉积：阴离子树脂放出电子沉积在阳极表面，形成不溶水的漆膜，此过程叫电 沉积。 3.电渗：电泳逆过程，当阴离子树脂在阳极上，吸附在阳极上的介质在内渗力的作 用下，从阳极穿过沉积的漆膜进入漆液，称电渗。 4.电解：电流通过漆液时水便发生电解阴极放出氢气，阳极放出氧气，此过程 即为电解。 电泳涂料 有人说，电泳涂料可划分为三代，第一代为环氧树脂涂料，第二代为丙烯酸树脂涂料， 第三代为聚氨酯涂料。由于环氧涂料主要应用于汽车底盘，第三代主要用于阴极电泳漆，涂覆于首饰表面，故目前主要介绍第二代，即丙烯酸树脂涂料。此树脂如一团乱麻，羧基藏于里，胺基接于外,其中最先的羧基有70%被胺基取代，因其树脂中存在-COONHR，使树脂成为水溶性。铝型材表面涂覆的丙烯酸树脂多采用胺基树脂为固化剂进行交联固化，同时， 涂料分子均匀性对工艺操作有很大影响，一般说，乳化越好，分子越均匀。 涂装工艺流程 1 .除油：如有酸回收装置，推荐采用碱性除油，因碱性除油后，铝型材表面比较光亮，且 不会与后面的碱蚀发生副作用，如用碱性除油，其主要成份是 Na 2 CO 3 和NaOH。 2 .水洗：自来水洗去前道工序的酸或碱。 3 .蚀：加入碱蚀剂的碱蚀工序，会降低型材表面光亮度，但效果并不十分明显,主要应注意不可使槽中Al 3 含量过大，温度过高，否则易产生洗不去的花斑，涂漆烘干后呈黄色。 二道水洗：最好有喷淋或加大溢流，以保证清洗彻底。 除灰：用HNO 3 效果较好，但要注意加强水洗（最少二道+喷淋）。 水洗：自来水用H 2 SO 4 除灰，一道水洗即可，用HNO 3 除灰，需二道水洗 氧化：H 2 SO 4 氧化一般为20min，使氧化膜达到9ｕ，某些公司推销的所谓的 高温氧化剂，其主要成份是一种混酸，建议不要使用，对氧化膜的色泽、硬度、可着色性均 无好处。 水洗：自来水二道加大溢流。 着色：用单锡盐、单镍盐、锡镍复合盐均可，注意不要有色差，因为色差会在 电泳涂漆后加大。 水洗：最好加喷淋，以期尽量减少对后道工序酸的带入量。 热纯水洗：要求电导率＜100ｕs/cm，温度70-80℃，PH=4-6，尤其是银白涂漆型材或氧化中电压较大的型材应在此槽中处理较长的时间，PH值可用三乙胺进行调整。
琼脂糖凝胶电泳标准操作流程
琼脂糖凝胶电泳操作标准流程 一、实验目的 琼脂糖凝胶电泳是常用的检测核酸的方法，具有操作方便、经济快速等优点。本铜人阵学习DNA琼脂糖凝胶电泳的使用技术，此关为能力考核，通关成功后，代表具备操作琼脂糖电泳的能力。 二、实验原理 琼脂糖凝胶电泳是常用的用于分离、鉴定DNA、RNA分子混合物的方法，这种电泳方法以琼脂凝胶作为支持物，利用DNA分子在泳动时的电荷效应和分子筛效应，达到分离混合物的目的。DNA分子在高于其等电点的溶液中带负电，在电场中向阳极移动。在一定的电场强度下，DNA分子的迁移速度取决于分子筛效应，即分子本身的大小和构型是主要的影响因素。DNA分子的迁移速度与其相对分子量成反比。不同构型的DNA分子的迁移速度不同。如环形DNA分子样品，其中有三种构型的分子：共价闭合环状的超螺旋分子（cccDNA）、开环分子(ocDNA)、和线形DNA分子(IDNA)。这三种不同构型分子进行电泳时的迁移速度大小顺序为:cccDNA＞IDNA＞ocDNA 影响核酸分子泳动率的因素主要还是：1、DNA分子大小；2、琼脂糖浓度； 3、DNA构想； 4、所用的电压； 5、琼脂糖种类； 6、电泳缓冲液 核酸电泳中常用的染色剂是溴化乙锭（ethidium bromide EB）。溴化乙锭是一种扁平分子，可以嵌入核酸双链的配对碱基之间。在紫外线照射BE-DNA复合物时，出现不同的效应。254nm的紫外线照射时，灵敏度最高，但对DNA损伤严重；360nm紫外线照射时，虽然灵敏度较低，但对DNA损伤小，所以适合
对DNA样品的观察和回收等操作。300nm紫外线照射的灵敏度较高，且对DNA 损伤不是很大，所以也比较适用。 三、材料、试剂及器具 1、材料 不同大小的基因组片段； 2、试剂 Hind III digest DNA Marker（分子量标准）(TaKaRa)；D2000(TianGen)；BIOWESTAGAROSE（西班牙琼脂糖）；加样缓冲液（6x）：溴酚黄；电泳缓冲液（1×TAE）；溴化乙锭（EB）； 3、仪器及器具 （1）移液器、吸头、锥形瓶 （2）电泳系统：电泳仪、水平电泳槽、托盘、胶托、梳子等。 （3）紫外透射仪、微波炉、电子天平 四、操作步骤 1.器具清洗：首先将配胶、电泳、染胶所需要的器具清洗干净，包括托盘、胶托、梳子、电泳槽、染胶盘（EB污染，需独立清洗）。清洗流程为：先用自来水冲洗三次，然后用纯水冲洗三次，最后用纸巾或医用纱布擦干。若需对电泳产物进行胶回收，则还需用75%酒精对器具进行消毒。 2.配胶：根据基因组片段大小，配置相应浓度的琼脂糖凝胶。首先将锥形瓶洗干净并加入少量纯水煮沸，然后量取一定量的电泳缓冲液（1×TAE）至锥形瓶中，再称取相应量的BIOWESTAGAROSE（西班牙琼脂糖）倒入锥形瓶中，摇匀并
凝胶电泳实验原理与步骤
一、实验目的 学习和掌握琼脂糖电泳法鉴定DNA的原理和方法。 二、实验原理 琼脂糖凝胶电泳是用于分离、鉴定和提纯DNA片段的标准方法。琼脂糖是从琼脂中提取的一种多糖，具亲水性，但不带电荷，是一种很好的电泳支持物。DNA在碱性条件下（pH8.0的缓冲液）带负电荷，在电场中通过凝胶介质向正极移动，不同DNA分子片段由于分子和构型不同，在电场中的泳动速率液不同。溴化乙锭（EB）可嵌入DNA分子碱基对间形成荧光络合物，经紫外线照射后，可分出不同的区带，达到分离、鉴定分子量，筛选重组子的目的。 三、实验材料 实验14提取的DNA样品， 四、器具及药品 电泳仪，电泳槽，紫外透射反射仪，恒温水浴锅，微波炉，微量进样器，三羟甲基氨基甲烷，盐酸，醋酸钠，EDTA，琼脂糖，溴酚蓝，溴化乙锭。 五、实验步骤 1、安装电泳槽 将有机玻璃的电泳凝胶床洗净，晾干，用胶带将两端的开口封好，放在水平的工作台上，插上样品梳。 2、琼脂糖凝胶的制备 称取琼脂糖溶解在电泳缓冲液中，（按0.3-1.5%的琼脂糖含量，1-25kb大小的DNA用1%的凝胶，20-100kb的DNA用0.5%的凝胶，200-2000bp的DNA用1.5%的凝胶）置微波炉或沸水浴中加热至完全溶化（不要加热至沸腾），取出摇匀。 3、灌胶 将冷却到60℃的琼脂糖溶液轻轻倒入电泳槽水平板上。 4、待琼脂糖胶凝固后，在电泳槽内加入电泳缓冲液，然后拔出梳子。 5、加样 将DNA样品与加样缓冲液按4：1混匀后，用微量移液器将混合液加到样品槽中，每槽加10-20μl，记录样品的点样次序和加样量。 6、电泳 安装好电极导线，点样孔一端接负极，另一端接正极，打开电源，调电压至3-5V/cm，电泳1-3hr，当溴酚蓝移到距凝胶前沿1-2cm时，停止电泳。 7、染色和观察 取出凝胶，放在含有溴化乙锭的染色液中染色30min，即可在254nm的紫外灯下观察，有橙红色荧光条带的位置，即为DNA条带，或在紫外灯下照相记录电泳图谱。溴化乙锭是致癌剂，操作时要小心，必须戴手套。 附： ⑴5×TBE（tris-硼酸及EDTA）缓冲液的配制(1000ml)： Tris 54g，硼酸27.5g，0.5mol/L EDTA 20ml，将pH调到8.0，定容至1000ml，4℃冰箱保存，用时稀释10倍。 ⑵加样缓冲液的配制： 0.25%溴酚蓝，40%（W/V）蔗糖水溶液，4℃冰箱保存。 ⑶溴化乙锭的配制： 称取0.1g溴化乙锭，溶于10ml水，配成终浓度为10mg/ml的母液，4℃冰箱保存。染
琼脂糖凝胶电泳 配方与步骤
?RNA琼脂糖凝胶电泳： 配制： 1.0.5M EDTA（pH=8.0）： 100ml：称取18.61g Na2EDTA·2H2O（分子量372.24），加80ml ddH2O剧烈搅拌， 用NaOH调节PH值至8.0（约需2g NaOH）.高压灭菌，室温保存。 2.50×TAE loading buffer:（Tris acetate-EDTA buffer）电泳缓冲液 组分：2M Tris-乙酸；100mM EDTA（pH=8.0） 500mL:称121.1g Trisbase（分子量121.14），加800ml ddH2O溶解，加57.1ml 乙酸和50ml0.5M EDTA溶液（pH=8.0），搅拌，ddH2O定容至500mL.室温保存。 3.1×TAE loading buffer: 取20ml50×TAE，ddH2O定容至1L.室温保存。 4.100×Sybergreen： 500ul：取495ul1×TAE于1.5ml离心管，加入5ul Sybergreen原液混匀，4℃锡纸 避光保存。 注意：Sybergreen原液需稀释10000倍； 6×DNA loading buffer上样缓冲液需稀释六倍，最终稀释倍数应不小于1×。 步骤： 1.制备1%琼脂糖凝胶(大胶用70ml,小胶用50ml，我们用30ml): 称0.3g琼脂糖置于100ml锥形瓶中，加入30ml1×TAE，瓶口倒扣小烧杯。 微波炉加热煮沸3次，至琼脂糖全部融化，摇匀，即成1.0%琼脂糖凝胶液。 2.胶板制备: 取电泳槽内的有机玻璃内槽(制胶槽)洗干净,晾干,放入制胶玻璃板.取透明胶带将玻璃板与内槽两端边缘封好,形成模子.将内槽置于水平位置,并放好梳子. 将冷却到65℃左右的琼脂糖凝胶液混匀小心地倒入内槽玻璃板上,使胶液缓慢展开,直到整个玻璃板表面形成均匀胶层.室温下静置直至凝胶完全凝固,垂直轻拔梳子,取下胶带,将凝胶及内槽放入电泳槽中.添加1×TAE电泳缓冲液至没过胶板为止. 3.加样: 样品制备：（10ul体系/样品槽）于0.25ml离心管中 样品RNA（最后加）:2ul/3ul/5ul 6×DNA loading buffer:10/6=1.7ul 100×Sybergreen：0.1ul DEPC水：至10ul (注意:加样前要先记下加样的顺序).分别将样品加入胶板的样品小槽内,每加完一个样品,应更换一个枪头,以防污染,加样时勿碰坏样品孔周围的凝胶面. 4.电泳: 加样后的凝胶板立即通电进行电泳,电压60-100V,样品由负极(黑色)向正极(红色)方向移动.电压升高,琼脂糖凝胶的有效分离范围降低.当溴酚蓝移动到距离胶板下沿约1cm处时,停止电泳. 5.电泳完毕后,取出凝胶,利用科212凝胶成像系统,在紫外灯（trans UV）下观察拍照 保存.DNA存在则显示出红色荧光条带.RNA完美提出应该是三条带：28，18,5.8。 28和18比较亮,而且28是18亮度的2倍,5.8基本很模糊，可有可无
RNA的琼脂糖凝胶电泳实验原理和步骤
RNA的琼脂糖凝胶电泳实验原理和步骤 关键词：RNA琼脂糖电泳2012-03-09 00:00 来源：互联网点击次数：38148 一、实验目的 掌握植物总RNA非变性胶电泳的原理和方法。 二、实验原理 RNA电泳可以在变性及非变性两种条件下进行。非变性电泳使用1.0%--1.4%的凝胶，不同的RNA条带也能分开，但无法判断其分子量。只有在完全变性的条件下，RNA的泳动率才与分子量的对数呈线性关系。因此要测定RNA分子量时，一定要用变性凝胶。在需快速检测所提总RNA样品完整性时，配制普通的1%琼脂糖凝胶即可。
三、实验材料、器具及药品 蘑菇的总RNA溶液。电泳仪，电泳槽，电子天平，移液器，枪头，微波炉，紫外透射检测仪等。琼脂糖，1XTAE电泳缓冲液，0.5μg/ml溴化乙锭（EB）10X载样缓冲液。 四、实验步骤 （1）用1×TAE电泳缓冲液制作琼脂糖凝胶，加1×TAE电泳缓冲液至液面覆盖凝胶。 （2）在超净工作台上，用移液器吸取总RNA样品4μl于封口膜上。在实验台上再加入5μl 1×TAE电泳缓冲液及1μl 的10X载样缓冲液，混匀后，小心加入点样孔。 （3）打开电源开关，调节电压至100V，使RNA由负极向正极电泳，约30min 后将凝胶放入EB染液中染色5min,用清水稍微漂洗。在紫外透射检测仪上观察RNA电泳结果。
RNA的变性琼脂糖凝胶检测 试剂： （1）MOPS缓冲液（10*）:0.4mol/L 吗啉代丙烷磺酸（MOPS）(Ph7.0)，0.1mol/L NaAc, 10mol/L EDTA。 （2）上样染料：50%甘油，1mmol/L EDTA ,0.4%溴酚蓝，0.4%二甲苯蓝。（3）甲醛。 （4）去离子甲酰胺。v电泳槽清洗：去污剂洗干净（一般浸泡过夜）——水冲洗——乙醇干燥——3%H2O2灌满——室温放置10分钟——0.1%DEPC水冲洗。 操作：
双向电泳操作步骤
双向电泳操作步骤 水化上样( 被动上样) 1. 从冰箱中取出IPG 胶条，室温放置10min。 2. 沿水化盘槽的边缘从左向右线性加入样品，槽两端各1cm 左右不加样，中间的样品液一定要连贯。注意：不要产生气泡，否则会影响胶条中蛋白质的分布。 3. 用镊子轻轻撕去IPG 胶条上的保护层。注意：碱性端较脆弱，应小心操作。 4. 将IPG胶条胶面朝下轻轻置于水化盘中样品溶液上。注意：不要将样品溶液弄到胶条背面，因为这些溶液不会被胶条吸收；还使胶条下面的溶液产生气泡。如产生了气泡，用镊子轻轻地提起胶条的一端，上下移动胶条，直到气泡被赶走。 5. 放置30~45min 大部分样品被胶条吸收，沿着胶条缓慢加入矿物油，每根胶条约3ml(17cmIPG)，防止胶条水化过程中液体蒸发。 6. 置等电聚焦仪于- 20℃水化11~15h。 第一向等电聚焦 1. 将纸电极置于聚焦盘的正负极上，加ddH2O 5~8μl 润湿。 2. 取出水化好的胶条，提起一端将矿物油沥干，胶面朝下，将其置于刚好润湿的滤纸片上杂交以去除表面上的不溶物。 3. 将IPG 胶条胶面朝下置于聚焦盘中，胶条的正极（标有+）对应于聚焦盘的正极，确保胶条与电极紧密接触。 4. 在每根胶条上覆盖2- 3ml 矿物油。 5. 对好正、负极，盖上盖子。设置等电聚焦程序。 6. 聚焦结束的胶条，立即进行平衡、第二向SDS-PAGE电泳。或将胶条置于样品水化盘中，- 20℃冰箱保存，电泳前取出胶条，室温放置10 分钟，使其溶解。 第二向SDS-PAGE电泳 1. 配制12%的丙烯酰胺凝胶。 2. 待凝胶凝固后，倒去分离胶表面的MilliQ水、乙醇或水饱和正丁醇，用MilliQ 水冲洗。 3. 配制胶条平衡缓冲液I 4. 在桌上先放置干的厚滤纸，聚焦好的胶条胶面朝上放在干的厚滤纸上。将另一份厚滤纸用MilliQ水浸湿，挤去多余水分，然后直接置于胶条上，轻轻吸干胶条上的矿物油及多余样品，这样可以减少凝胶染色时出现的纵条纹。 5. 将胶条转移至样品水化盘中，加入6ml(17cmIPG)平衡缓冲液I ，在水平摇床上缓慢摇晃15 分钟。 6. 配制胶条平衡缓冲液II 。 7. 第一次平衡结束后，取出胶条将之竖在滤纸上沥去多余的液体，放入平衡缓冲液II 中，继续在水平摇床上缓慢摇晃15 分钟。 8. 用滤纸吸去SDS-PAGE胶上方玻璃板间多余的液体，将二向凝胶放在桌面上，凝胶的顶部面对自己。 9. 将琼脂糖封胶液加热溶解。 10. 在100ml 量筒中加入TGS 电泳缓冲液。 11. 第二次平衡结束后，取出胶条，用滤纸吸去多余的平衡液（将胶条竖在滤纸上，以免损失蛋白或损坏凝胶表面）。 12. 用镊子夹住胶条的一端使胶面完全浸末在1×电泳缓冲液中漂洗数次。 13. 将胶条背面朝向玻璃板，轻轻放在长玻板上，加入低熔点琼脂糖封胶液。 14. 用适当厚度的胶片，轻轻地将胶条向下推，使之与聚丙烯酰胺凝胶胶面完全接触。注意：不要在胶条下方产生气泡，应推动凝胶背面的支撑膜，不要碰到面胶。
(完整word版)DNA的琼脂糖凝胶电泳实验原理和操作步骤
一、实验目的 琼脂糖凝胶电泳是常用的检测核酸的方法，学习DNA琼脂糖凝胶电泳的使用技术，掌握有关的技术和识读电泳图谱的方法。 二、实验原理 琼脂糖凝胶电泳是常用的用于分离、鉴定DNA、RNA分子混合物的方法，这种电泳方法以琼脂凝胶作为支持物，利用DNA分子在泳动时的电荷效应和分子筛效应，达到分离混合物的目的。DNA分子在高于其等电点的溶液中带负电，在电场中向阳极移动。在一定的电场强度下，DNA分子的迁移速度取决于分子筛效应，即分子本身的大小和构型是主要的影响因素。DNA分子的迁移速度与其相对分子量成反比。不同构型的DNA分子的迁移速度不同。如环形DNA分子样品，其中有三种构型的分子：共价闭合环状的超螺旋分子（cccDNA）、开环分子(ocDNA)、和线形DNA分子(IDNA)。这三种不同构型分子进行电泳时的迁移速度大小顺序为:cccDNA＞IDNA＞ocDNA 核酸分子是两性解离分子，pH3.5是碱基上的氨基解离，而三个磷酸基团中只有一个磷酸解离，所以分子带正电，在电场中向负极泳动；而pH8.0-8.3时，碱基几乎不解离，而磷酸基团解离，所以核酸分子带负电，在电场中向正极泳动。不同的核酸分子的电荷密度大致相同，因此对泳动速度影响不大。在中性或碱性时，单链DNA与等长的双链DNA的泳动率大致相同。 影响核酸分子泳动率的因素主要是： 1、样品的物理性状 即分子的大小、电荷数、颗粒形状和空间构型。一般而言，电荷密度愈大，泳动率越大。但是不同核酸分子的电荷密度大致相同，所以对泳动率的影响不明显。 对线形分子来说，分子量的常用对数与泳动率成反比，用此标准样品电泳并测定其泳动率，然后进行DNA分子长度（bp）的负对数——泳动距离作标准曲线图，可以用于测定未知分子的长度大小。 DNA分子的空间构型对泳动率的影响很大，比如质粒分子，泳动率的大小顺序为：cDNA ＞IDNA＞ocDNA但是由于琼脂糖浓度、电场强度、离子强度和溴化乙锭等的影响，会出现相反的情况。 2、支持物介质 核酸电泳通常使用琼脂糖凝胶和聚丙烯酰胺凝胶两种介质，琼脂糖是一种聚合链线性分子。含有不同浓度的琼脂糖的凝胶构成的分子筛的网孔大小不同，是于分离不同浓度范围的核酸分子。聚丙烯酰胺凝胶由丙烯酰胺（Acr）在N,N,N′-四甲基乙四胺（TEMED）和过硫酸铵
双向电泳步骤--标准操作完整版
细胞裂解（蛋白质提取） 一、试剂配置： PBS配方 氯化钠(MW 58.44) 130mM 8g 氯化钾(MW 74.5) 2.7mM 0.2g 十二水和磷酸氢二钠(MW 358) 10 mM3.63g 磷酸二氢钾(MW 136) 2 mM0.24g 加水至1L配好后进行高压灭菌。 Washing buffer（500mL）配方 Tris（MW 121.1） 10mM 0.605g 蔗糖（MW 342） 250mM 42.75g 加水溶解，用HCl调pH至7.0后用孔径为0.22μm滤膜过滤（使用1M盐酸略高于2750uL调pH） 裂解储液配方（细胞）： 尿素(MW 60.06) 7M 4.2g 硫脲(MW 76.12) 2M 1.52g CHAPS(MW614.89) 4%（W/V）0.4g 加超纯水定容至10mL后经0.22μm一次性滤膜过滤，过滤后分装成20小管，每小管500uL，-20℃冰箱保存。 裂解储液配方（组织）： 尿素(MW 60.06)5M3g 硫脲(MW 76.12) 2M1.52g
CHAPS(MW614.89) 2% 0.2g Tris（MW 121.1）40mM 0.048g 加超纯水定容至10mL后经0.22μm一次性滤膜过滤，过滤后分装成20小管，每小管500uL，-20℃冰箱保存。 裂解液： 裂解液储液 100uL IPG buffer（pH可选） 2% 2uL Pi 2uL NucLease mix（100×） 1uL PMSF（100mM：20mg/mL） 1mM 1uL DTT（0.411g/mL） 40mM 1.5uL Pi：每片使用200uL超纯水溶解后按10 uL分装 考马斯亮蓝G-250： 考马斯亮蓝G-250 0.01% 100g 95%乙醇 4.7% 50ml H3PO4 8.5% 85g 将考马斯亮蓝G-250溶于50ml95%乙醇中，与用水溶解的100mlH3PO4混合后稀释至1000ml，之后使用滤纸过滤。 二、实验准备： 1、准备冰盒，细胞裂解过程均在冰盒内进行（4℃）； 2、准备4℃离心机，开机降温，保证温度下降至4℃； 3、取出置于-20℃保存的试剂，需冰上融化，最后取出细胞样品。
琼脂糖凝胶电泳
琼脂糖凝胶电泳 1.原理 琼脂糖凝胶电泳是用琼脂糖作支持介质的一种电泳方法。其分析原理与其他支持物电泳最主要区别是：它兼有“分子筛”和“电泳”的双重作用。 琼脂糖凝胶具有网络结构，物质分子通过时会受到阻力，大分子物质在涌动时受到的阻力大，因此在凝胶电泳中，带电颗粒的分离不仅取决于净电荷的性质和数量，而且还取决于分子大小，这就大大提高了分辨能力。但由于其孔径相当大，对大多数蛋白质来说其分子筛效应微不足道，现广泛应用于核酸的研究中。 蛋白质和核酸会根据pH不同带有不同电荷，在电场中受力大小不同，因此跑的速度不同，根据这个原理可将其分开。电泳缓冲液的pH在6~9之间，离子强度0.02~0.05为最适。常用1%的琼脂糖作为电泳支持物。琼脂糖凝胶约可区分相差100bp的DNA片段，其分辨率虽比聚丙烯酰胺凝胶低，但它制备容易，分离范围广。普通琼脂糖凝胶分离DNA的范围为0.2-20kb，利用脉冲电泳，可分离高达10^7bp的DNA片段。 DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效应和分子筛效应。DNA分子在高于等电点的pH溶液中带负电荷，在电场中向正极移动。由于糖-磷酸骨架在结构上的重复性质，相同数量的双链DNA几乎具有等量的净电荷，因此它们能以同样的速率向正极方向移动。 2操作流程 准备干净的配胶板和电泳槽 琼脂糖凝胶电泳：水平电泳 注意DNA酶污染的仪器可能会降解DNA，造成条带信号弱、模糊甚至缺失的现象。 (1)电泳方法
一般的核酸检测只需要琼脂糖凝胶电泳就可以；如果需要分辨率高的电泳，特别是只有几个bp的差别应该选择聚丙烯酰胺凝胶电泳；用普通电泳不合适的巨大DNA链应该使用脉冲凝胶电泳。注意巨大的DNA链用普通电泳可能跑不出胶孔导致缺带。 (2)凝胶浓度 对于琼脂糖凝胶电泳，浓度通常在0.5～2%之间，低浓度的用来进行大片段核酸的电泳，高浓度的用来进行小片段分析。低浓度胶易碎，小心操作和使用质量好的琼脂糖是解决办法。注意高浓度的胶可能使分子大小相近的DNA带不易分辨，造成条带缺失现象。 (3)缓冲液 常用的缓冲液有TAE和TBE，而TBE比TAE有着更好的缓冲能力。电泳时使用新制的缓冲液可以明显提高电泳效果。注意电泳缓冲液多次使用后，离子强度降低，pH值上升，缓冲性能下降，可能使DNA电泳产生条带模糊和不规则的DNA带迁移的现象。 三羟甲基氨基甲烷（Tris(hydroxymethyl)aminomethane，一般简称为Tris）是一种有机化合物，其分子式为(HOCH2)3CNH2。Tris被广泛应用于生物化学和分子生物学实验中的缓冲液的制备。例如，在生物化学实验中常用的TAE和TBE 缓冲液（用于核酸的溶解）都需要用到Tris。 (4)电压和温度 电泳时电压不应该超过20V/cm，电泳温度应该低于30℃，对于巨大的DNA 电泳，温度应该低于15℃。注意如果电泳时电压和温度过高，可能导致出现条带模糊和不规则的DNA带迁移的现象。特别是电压太大可能导致小片段跑出胶而出现缺带现象 (5)DNA样品的纯度和状态 注意样品中含盐量太高和含杂质蛋白均可以产生条带模糊和条带缺失的现象。乙醇沉淀可以去除多余的盐，用酚可以去除蛋白。注意变性的DNA样品可能导致条带模糊和缺失，也可能出现不规则的DNA条带迁移。在上样前不要对DNA样品加热，用20mM NaCl缓冲液稀释可以防止DNA变性。 (6)DNA的上样
实验五--核酸琼脂糖凝胶电泳
实验五核酸琼脂糖凝胶电泳 一、实验目的 琼脂糖凝胶电泳是常用的检测核酸的方法，具有操作方便、经济快速等优点。本实验学习DNA琼脂糖凝胶电泳的使用技术，掌握有关的技术和识读电泳图谱的方法。 二、实验原理 琼脂糖凝胶电泳是用于分离、鉴定和提纯DNA片段的标准方法。琼脂糖是从琼脂中提取的一种多糖，具亲水性，但不带电荷，是一种很好的电泳支持物。DNA在碱性条件下（pH8.0的缓冲液）带负电荷，在电场中通过凝胶介质向正极移动，不同DNA分子片段由于分子和构型不同，在电场中的泳动速率也不同。溴化乙锭（EB）可嵌入DNA分子碱基对间形成荧光络合物，经紫外线照射后，可分出不同的区带，达到分离、鉴定分子量，筛选重组子的目的。但是EB具有致癌性，所以我们选用无毒，高灵敏度是Ex Green染料，。此核酸染料在紫外透照仪及可见光透射仪上均可使用。ExGreen外观呈红色，与核酸结合后，可用300 nm （紫外透射仪）激发。
三、材料、仪器和试剂 1、材料大肠杆菌中提取的质粒DNA 2、仪器电泳仪；台式离心机；恒温水浴锅；微波炉；紫外透射仪；照相机或者凝胶成像系统 3、试剂 （1）50×TAE电泳缓冲液：称取Tris 242g，EDTA 37.2g，加入约800ml的去离子水，充分搅拌溶解，加入57.1ml的醋酸，充分搅拌，加去离子水定容至1L，室温保存。 （2）6×电泳上样缓冲液：0.25%溴酚蓝、40%（W/V）蔗糖水溶液，贮存于4℃。 （3）溴化乙锭（EB）溶液母液：将EB配制成10mg/mL。用铝箔或黑纸包裹容器，贮存于室温即可。 （4）分子量标准DNA：DNA Marker 四、操作步骤 1、制备1%琼脂糖凝胶(大胶用40ml，小胶用30ml)：称取0.7 g(0.5 g) 琼脂糖置于锥形瓶中，加入70 ml(50ml) 1×TAE，瓶口倒扣小烧杯。微波炉加热煮沸3次至琼脂糖全部融化，摇匀，即成1.0%琼脂糖凝胶液。 注意：用于电泳的缓冲液和用于制胶的缓冲液必须是相同的 2、胶板制备：取电泳槽内的有机玻璃内槽(制胶槽)洗干净，晾干，放入制胶玻璃板.取透明胶带将玻璃板与内槽两端边缘封好，形成模子。将内槽置于水平位置，并在固定位置放好梳子。在冷却到65℃左右的琼脂糖凝胶液中加入Ex Green染料（10ml:1ul），混匀后小
双向凝胶电泳比较三种常用蛋白质提取方法
ISS N 100727626 C N 1123870ΠQ 中国生物化学与分子生物学报 Chinese Journal of Biochemistry and M olecular Biology 2005年10月 21(5):691～694 ?技术与方法? 双向凝胶电泳比较三种常用蛋白质提取方法 翁 瑜1),2), 曾群力2),3), 姜 槐2), 许正平2),3)3 (1)浙江大学生命科学学院;2)浙江大学医学院浙江省生物电磁学重点研究实验室;3)浙江大学医学院环境基因组学研究中心,杭州 310031) 摘要 组织(或细胞)的蛋白质提取效率直接影响蛋白质双向凝胶电泳(22DE)的分辨率.为探索建立适用于人乳腺癌细胞株MCF27蛋白质提取的最佳条件,比较目前在双向凝胶电泳中常用的3种蛋白质提取方法对MCF27细胞总蛋白的提取效率.MCF27细胞经培养后,分别采用M2PER试剂、标准裂解液或含硫脲裂解液提取其总蛋白质,然后进行双向凝胶电泳,并根据凝胶上蛋白质斑点的丰度和分布特点判断所得双向电泳图谱的质量,以确定MCF27细胞蛋白质提取的相对最佳方法.结果显示,M2PER试剂法得到的图谱分辨率较低,蛋白质主要集中分布在分子量15～70kD,pH417～613的范围内;标准裂解液法得到的图谱分辨率有所提高,蛋白质分布比M2PER试剂法得到的图谱广;硫脲裂解液法得到的图谱是三者中分辨率最高的,尤其是高丰度蛋白和高分子量蛋白分离效果比前两者好.结果表明,在3种常用的蛋白质提取方法中,硫脲裂解液对细胞蛋白质的溶解性最佳,相对更适合于提取MCF27细胞的蛋白质,并与双向凝胶电泳条件更兼容. 关键词 蛋白质提取,双向凝胶电泳,MCF27,条件优化 中图分类号 Q503 Comparison of Three Protein Extraction Methods by Tw o2 Dimensional E lectrophoresis WE NG Y u1),2),ZE NG Qun2Li2),3),J I ANG Huai2),X U Zheng2Ping2),3)3 (1)College o f Life Sciences,2)Bioelectromagnetics Laboratory,3)Research Center for Environmental G enomics, Zhejiang Univer sity School o f Medicine,Hangzhou 310031,China) Abstract Protein extraction from tissue or cells is a key step to achieve high2res olution protein separation in tw o dimensional electrophoresis(22DE).Three routine cellular total protein extraction methods were com pared in order to determine an optimal one for human breast cancer cell line MCF27.The cultured MCF27cells were lysed by M2PER kit,standard lysis buffer or im proved lysis buffer,respectively.Then the extracted total proteins were subjected to22DE,and the best extraction method was determined by the indexes of protein distribution and abundance on corresponding silver2stained gel.Data showed that use of M2PER kit gave the lowest res olution,in which m ost proteins were distributed in the pI ranging from417to613with m olecular weight between15kD and70kD.Standard lysis bu ffer im proved protein res olution with broader protein distribution pattern.Im proved lysis bu ffer generated the best res olution am ong these three methods,especially for the high2abundance and high m olecular weight proteins.Based on above results,we concluded that the im proved lysis bu ffer has the best protein s olubilization ability,which renders it much m ore suitable for cellular protein extraction from MCF27,and is m ore com patible with the conditions of22DE. K ey w ords protein extraction,tw o dimensional electrophoresis,MCF27,optimization 收稿日期:2004212203,接收日期:2005203221 国家自然科学基金项目(N o.50137030,30170792),浙江省自然科学基金项目(N o.301524)和浙江省卫生厅重点项目(N o.2004Z D006)资助 3联系人 T el:0571287217386,Fax:0571287217410,E2mail:zpxu@https://www.360docs.net/doc/822979796.html, Received:December3,2004;Accepted:M arch21,2005 Supported by National Natural Science F oundation of China(N o.50137030,30170792),and Natural Science F oundation of Zhejiang Province(N o.301524),and K ey Program of Health Bureau of Zhejiang Province(N o.2004Z D006) 3C orresponding author T el:0571287217386,Fax:0571287217410,E2mail:zpxu@https://www.360docs.net/doc/822979796.html,