土壤腐殖质组成测定

土壤腐殖质组成测定标准化管理处编码[BBX968T-XBB8968-NNJ668-MM9N]

土壤腐殖质组成测定

土壤腐殖质事土壤有机质的主要成分。一般来说，它主要是由胡敏酸（HA)和富里酸（FA)所组成。不同的土壤类型，其HA/FA比值有所不同。同时这个比值与土壤肥力也有一定关系。因此，测定土壤腐殖质组成对于鉴别土壤类型和了解土壤肥力均有重要意义。

实验方法：用 0.1M焦磷酸钠和0.1M氢氧化钠混合液处理土壤，能将土壤中难溶于水和易溶于水的结合态腐殖质络合成溶于水的腐殖质钠盐，从而比较完全的将腐殖

质提取出来。

实验操作步骤：

1、称取0.25mm相当于2.50g烘干重的风干土样，置于250ml三角瓶中，用移液管准确加入0.1M焦磷酸和0.1M氢氧化钠混合液，震荡5分钟，塞上橡皮套，然后静置13——14

小时（控制温度在20℃左右），旋即摇匀进行过滤，收集滤液（一定要清亮）。

2、胡敏酸和富里酸总碳量的测定

吸取滤液，移入150毫升三角瓶中，加3mol／L H2SO4约五滴（调节ph为7）至溶液

出现浑浊为止，置于水浴锅上蒸干。加／L（1／6K2Cr2O7）标准液，用注射筒迅速注入浓硫酸5ml，盖上小漏斗，在沸水浴上加热15分钟，冷却后加蒸馏水50ml稀释，加邻啡罗林指示剂3滴，用∕L硫酸亚铁滴定，同时作空白实验。

3、胡敏酸量测定

吸取上述滤液于小烧杯中，置于沸水浴上加热，在玻璃搅拌下滴加3mol∕L H2SO4酸化（约30滴），至有絮状沉淀析出为止，继续加热10分钟使胡敏酸完全沉淀。过滤，以∕L H2SO4洗涤滤纸和沉淀，洗至滤液无色为止（即富里酸完全洗去）。以热的∕L NaOH

溶解沉淀，溶解液收集于150ml三角瓶中（切忌溶解液损失），如前法酸化，蒸干，测碳。（此时的土样重量w相当于1g）

结果计算：

1、腐殖质总碳量（%）= [ **（V0-V1 ）*V0 ]*100/W

式中：毫升标准重铬酸钾溶液空白实验滴定的硫酸亚铁毫升数。

V1--待测液滴定用去的硫酸亚铁毫升数

w--吸取滤液相当的土样重（g）

5----空白所用K2Cr2O7毫升数

注意事项：1、在中和调节溶液pH时，只能用稀酸，并不断用玻棒搅拌溶液，然后用玻棒醮少许溶液放在ph试纸上，看其颜色，从而达到严格控制ph

2、蒸干前必须将ph调至7，否则会引起碳损失

固体废物堆肥胡敏酸光谱学特性研究进展

摘要着重论述了堆肥过程中光谱学特性研究方法，主要包括紫外光谱法、红外光谱法、13C-核磁共振波谱法及荧光光谱法。介绍了在不同光谱分析条件下，堆肥过程中胡敏酸分子的结构特性。最后指出不同光谱学分析方法判断堆肥腐熟度存在的不足及今后的发展趋势。

关键词固体废物堆肥胡敏酸光谱

堆肥法是固体废弃物资源化处理的主要方式之一，堆肥的过程是微生物利用有机物质作为能源进行好氧发酵的过程[1]，同时也是有机物质腐殖化与稳定化的过程[2]。堆肥过程中，有机物质通过微生物的作用形成复杂的、暗棕色的、稳定的腐殖质类物质，其分子量在200~300 000 g/mol，根据腐殖质在强酸中的溶解性的不同，可将其分为胡敏酸（Humic acid，HA）类、富里酸类及胡敏素（Humin）等物质，其中胡敏酸分子量介于10 000~100 000 g/mol，溶于碱溶液但不溶于强酸溶液。通常胡敏酸类物质含量及其结构的复杂化程度是决定堆肥质量及腐熟度的重要因素之一。同时，堆肥产品施入土壤后，胡敏酸类物质可以改善土壤团粒结构、影响重金属的迁移转化、缓冲土壤pH，并且由于其含有作物生长所需要的营养元素（N、P、K等），可以作为土壤氧分的潜在储存库，并且会对作物的生长发育产生积极的作用[3]。堆肥过程中胡敏酸结构变化，不仅影响堆肥的腐熟进程，还决定着堆肥产品的培肥效果。因此，利用光谱扫描手段对堆肥过程中胡敏酸分子结构进行分析，从物质结构的角度了解堆肥过程及腐熟度，判断堆肥质量，是研究者面临的主要研究内容之一。目前在堆肥过程中研究胡敏酸光谱学特性应用较多的方法为紫外光谱法（UV-Visible absorption spectrum，UV-Vis）、红外光谱法（Fourier transform infrared, FTIR）、13C-核磁共振波谱法（Solid-state 13C-NMR）、荧光光谱法（Fluorescence spectrum），通常胡敏酸结构特性大都采用多种光谱分析的方法[4-8]。本文将对这些分析技术作一综合评述。

1 堆肥过程中胡敏酸变化

在堆肥的不同阶段，腐殖质、胡敏酸、富里酸含量及其结构特性不同，因此堆肥过程腐殖酸类物质变化对判断堆肥腐熟度具有十分重要的意义。通常情况下，堆肥初期胡敏酸含量较少，而富里酸含量则处于较高的水平。在堆肥过程中，腐殖质总量基本恒定[9]，但由于堆肥的固体废弃物种类及性质不同，腐殖质含量也可能发生变化[10]；而胡敏酸含量一般呈明显的增加趋势。Sugaharq[11]利用生活垃圾堆肥，研究了胡敏酸、富里酸及腐

殖化指数（胡敏酸/富里酸，HI），结果表明，堆肥过程中富里酸含量呈明显降低的趋势，而胡敏酸含量、HI值则呈明显的增加的趋势。Chetez[9]的研究也得到了相似的结果，胡敏酸含量堆肥初期为7%，而堆肥后则增加至12%。综合已有的研究报道表明，堆肥的腐熟进程实质上也是胡敏酸物质含量增加及芳构化程度增强的过程；同时由于富里酸结构较为简单，通过微生物作用，可发生矿化，进而使堆肥中富里酸含量减少[12]，同时一部分富里酸还可以通过分子间的键合形成更为复杂的胡敏酸物质[10]。

2 胡敏酸紫外光谱特性

胡敏酸分子中的多价健与非共用电子，通常具有发色基团（C=C、C=O）与助色基团（C—OH、C=NH2），它们都在紫外光区域出现吸收，其光谱的共同特征是吸收值随波长增加而减少[13]。在堆肥过程中，胡敏酸的紫外吸收在扫描波长范围内呈逐渐增加的趋势，在堆肥腐熟后期，增加幅度趋缓，在整个堆肥周期内，胡敏酸在短波长紫外吸收增加幅度明显大于较长波长[11]。胡敏酸紫外扫描光谱通常在200~210 nm有1个较强紫外吸收峰，而在285 nm附近则形成1个类肩峰。随着堆肥的进行200~210 nm处吸收峰逐渐增强，并伴随红移现象发生，210 nm附近最大吸收峰是由含有π—π共轭结构的分子如（芳香族）中的电子的π→π* 跃迁引起，最大吸收峰向近紫外区域移动，说明堆肥过程胡敏酸的共轭作用增加，缩合度增强[14]。另外，波长285 nm附近的类肩峰可能是胡敏酸分子中木质素成分引起[15]，或者是由由含有π—π共轭结构的分子（如芳香族）中的电子的π→π*跃迁引[14]。随着堆肥的进行，285 nm处类肩峰逐渐减弱，表明胡敏酸分子木质素成分减少，芳香族化合物含量增加。或者是胡敏酸分子中共轭作用增强，腐殖化程度提高。因此测定不同堆肥时期胡敏酸的紫外光谱性质，可以对城市生活垃圾堆肥的腐熟程度进行定性的判断。

3 胡敏酸红外光谱特性

红外光谱可以作为胡敏酸主要官能团变化的定性分析工具，胡敏酸的红外光谱主要吸收带及其所对应的主要官能团见表1。随着堆肥的进行，羧基特征峰（1710 cm-1）逐渐演变为小肩峰；脂族吸收带（2925 cm-1、2850 cm-1）、酰胺类特征峰（1540 cm-1）明显减弱[9]（图1）。Hsu等[12]研究同样表明，堆肥初期胡敏酸分子中包含较多易降解的成分，如脂肪类、多糖、蛋白质等，而堆肥腐熟时期胡敏酸分子中含有较多的芳族类化合物，芳构化程度增强。实际上，在堆肥的不同阶段胡敏酸的红外光谱谱形基本相似，只是在某些特征峰吸收强度上有明显差异，反映了不同堆肥时期胡敏酸结构单元和官能团数量有明显的变化。为了进一步描述堆肥过程中胡敏酸的腐殖化程度，研究者们还利用了一些特征峰密度比值来定量分析某些官能团的变化[16-18]，如1650 cm-1（芳族碳）/2924 cm-1（脂肪碳）、1650 cm-1（芳族碳）/1540 cm-1（酰胺）、1650 cm-1（芳族碳）

/1030 cm-1（多糖）等。Inbar等l[17]通过红外光谱特征峰密度比值分析表明，在堆肥后期，多糖类、脂族类及酰胺类等成分明显减少，而芳族类成分相对增加。

表1 胡敏酸的主要吸收带[13,17,19-24]

4 胡敏酸13C-NMR波谱分析

13C-NMR波谱分析技术可为堆肥过程中胡敏酸的转化提供分子骨架信息，能够十分灵敏地反映碳核所处化学环境的细微差别。Inbar[25]等对牛粪堆肥样进行13C-NMR光谱图分析后，含碳功能团的分布为9个组分，通过峰面积的积分计算表明，堆肥后多糖类降低了33%。Chefetz等将堆肥中有机物质13C-NMR波谱分为5个区域（图2）[9]，依次为0~50为链烷烃或脂肪链中的甲基、亚甲基；50~112为C—O、C—N结合的多糖类、醇类、脂类及胺类；112~163为芳族碳和苯酚碳；163~190为羧基碳、脂类碳及酰胺碳。190~215为羧基碳。通过对吸收峰面积进行积分计算，得出堆肥前后胡敏酸分子中不同官能团变化，其中多糖碳降低16%，芳族碳增加了51%，而羧基碳水平增加幅度较小，表现相对稳定。

图2 堆肥过程中胡敏酸13C-NMR波谱变化 [9]

5 胡敏酸荧光光谱分析

腐殖质物质是一类性质和结构非常复杂的物质，来源不同，则结构也不同，因此详细组成和化学结构目前尚未清楚，但分子中肯定存在芳香羧酸和酚结构单元，同时也存在高度不饱和脂肪链。由于这些功能基团的存在，荧光光谱便能应用于这一领域研究[26-28]。虽然荧光物质仅是腐殖质总体组成的一小部分，但荧光现象是腐殖质整体性质的反应。荧光光谱可分为发射光谱、激发光谱和同步扫描光谱，其中同步扫描光谱可以看作是化合物的指纹谱，在谱图中每一化合物都有它的唯一特征峰，从而可把荧光物质一一鉴定出来。但是，在腐殖质物质中，聚核芳香碳氢衍生物的这类谱图还很少，缺乏标准的图谱可以对照。目前对土壤胡敏酸及各种来源的水溶性有机物荧光光谱特性的大量研究报导[29-33]，为堆肥过程中胡敏酸分子结构分析提供了依据。

魏自民等[34]利用城市生活垃圾采用工厂化堆肥工艺，系统地研究了堆肥前后胡敏酸荧光特性变化（图3）。堆肥过程中胡敏酸荧光发射光谱较为简单，堆肥起始阶段胡敏酸在400 nm左右有1个较强的荧光强度峰，而在440 nm附近有1个相对较宽的特征峰，堆肥结束后由于胡敏酸缩合度增加，400 nm处吸收峰逐渐消失，而440 nm附近宽峰的荧光强度增强，并发生红移现象，由堆肥前440 nm移至堆肥后的445 nm。但其特征波长（445 nm）距离土壤胡敏酸的发射光特征峰波长（470~500 nm）较远[35]。胡敏酸荧光激发光谱在520 nm左右有1个较强的荧光强度峰，460 nm处有1个中等荧光强度峰，而在400 nm 处存在1个小肩峰。堆肥结束后，520 nm处荧光强度峰消失，460 nm处中等强度峰逐渐减弱成为类肩峰，并且在440 nm处形成1个中等荧光强度峰，而400 nm由堆肥前的小肩峰逐渐转变成为主峰。与荧光发射光谱与激发光谱相比，荧光同步扫描光谱更能获得较清晰图谱 [32]。堆肥前胡敏酸荧光同步扫描光谱分别在335 nm有1个十分强的荧光强度峰； 453 nm处有1个中等强度的荧光强度峰；475 nm处有1个相对较弱的荧光强度峰；

在500 nm与520 nm附近分别形成较弱的肩峰。堆肥后胡敏酸在扫描波长范围内的荧光强度峰明显降低，尤其是在较短的波长335 nm、385 nm处降低幅度最大，这部分荧光强度主要是由分子中结构较简单的、缩合度、芳构化程度较低的化合物形成[33,36]，表明堆肥后，胡敏酸分子中结构简单成分减少。同时堆肥后450 nm附近特征峰有较为明显的红移现象，由堆肥前453 nm移至堆肥后的458 nm。胡敏酸同步扫描光谱主峰的位置也发生了明显的改变，由堆肥前的375 nm转变为堆肥后的458 nm，更接近于土壤胡敏酸的主峰位置（460~480 nm）[32]。表明堆肥后胡敏酸分子的缩合度增加[37]，芳构化程度明显，向成熟方向发展。

通常荧光光谱分析可提供3种不同的扫描光谱（发射光谱、激发光谱、同步扫描光谱），因此，胡敏酸荧光光谱所包含的信息是其它研究方法无法比拟的。近年来，随着现代仪器的发展，荧光三维图谱被成功地应用于不同来源的有机物质的研究中[36,38]，相对于传统荧光光谱，三维荧光图谱可以对多组分复杂的有机物质体系中荧光光谱重叠的对象进行光谱识别和表征[39-42]。因此，在未来胡敏酸荧光三维图谱分析方面发展空间巨大。

图3 城市生活垃圾堆肥前后胡敏酸荧光光谱[34]

6 展望

目前，在堆肥胡敏酸光谱分析方面的研究，应用较多的是红外光谱法与13C-核磁共振法，红外光谱可以辨别化合物的特征官能团，而13C-核磁共振法可提供有机分子的骨架信息。因此，二者的配合使用基本上可以确定有机物的结构。但由于液体核磁共振方法由于其对样品丰度和仪器的要求相对较高，且测定费用昂贵，在实际使用中有一定限制。紫外光谱提供的信息量较少，在胡敏酸结构分析方面存在明显的缺陷。荧光光谱分析法优点在于能够从不同的尺度提供大量的胡敏酸结构信息，但由于其特征峰所对应的官能团还不

十分明确，因此在胡敏酸结构判断方面，还存在一定的不足。相信随着该领域研究的不断深入，荧光光谱分析技术在堆肥中胡敏酸结构的研究上能够起到越来越重要的作用。

在堆肥过程中，采用光谱手段研究胡敏酸的结构特性，其实质是为了确定堆肥的腐熟进程，遗憾的是，目前，利用光谱测试方法还不能形成一个堆肥腐熟度判断的定量指标，必需结合其它物理、化学或生物学的方法才能确定堆肥的腐熟度。因此，利用光谱法判断堆肥的腐熟度还有特于进一步研究。

参考文献

[1] Chefetz B，Hadar Y，Chen Y．Dissolved organic carbon fractions formed during composting of municipal solid waste：properties and

significance[J]．Acta Hydrochim Hydrobiol，1998，26(3)：172-179．

[2] Adani F，Genevini P L，Tambone F．A new index of organic matter

stability[J]．Compost Sci．Util．，1995，3：25-27．

[3] Chen Y，Aviad T．Effects of humic substances on plant growth[C]//MacCarthy P．，Clapp C．E．，Malcolm R．L．，Bloom P．R．(eds．)：Humic Substances in Soil and Crop Sciences：Selected readings．Proceedings of a symposium cosponsored by the International Humic Substances Society．Chicago，IL，1990：161-186．

[4] Ahmed O H，Husni M H A，Anuar A R．Production of Humic Acid from Pineapple Leaf Residue[J]．Journal of Sustainable Agriculture，2003，22 (1)：113-124．

[5] Heymann K，Mashayekhi H，Xing B S．Spectroscopic Analysis of Sequentially Extracted Humic Acid from Compost[J]．Spectroscopy Letters，2005，38（3）：

293-302．

[6] Chang -Chien S W，Huang C C，Wang M C．Analytical and spectroscopic characteristics of refuse compost-derived humic

substances[J]．Int．J．Appl．Sci．Eng．，2003，1(1)：62-71．

[7] Schepetkin I A，Khlebnikov A I，Ah S Y，et al．Characterization and biological activities of humic substances from mumie[J]．Journal of Agricultural and Food Chemistry，2003，51：5245-5254．

[8] Velasco M I，Campitelli P A，Ceppi S B，et al．Analysis of humic acid from compost of urban wastes and soil by fluorescence

spectroscopy[J]．Agriscientia，2004，XXI (1)：31-38．

[9] Chefetz B，Adani F，Genevini P，et al．Humic acid transformations during composting of municipal solid waste[J]．J．Environ．Qual．，1998，27：794-800．

[10] 魏自民，席北斗，王世平，等．城市生活垃圾外源微生物堆肥对有机酸变化及堆肥腐熟度的影响[J]．环境科学，2006，27(2)：186-190．

[11] Sugahara K，Inoko A．Composition analysis of humus and characterization of humic acid obtained from city refuse compost[J]．Soil Sci．Plant Nutr．，1981，27(2)：213-224．

[12] Hsu J H，Lo S L．Chemical and spectroscopic analysis of organic matter transformations during composting of pig manure[J]．Environmental Pollution，1999，104：189-196．

[13] Stevenson F J．Humus chemistry [M]．New York：Wiley Interscience Publications，1982．

[14] 占新华，周立祥，沈其荣，等．污泥堆肥过程中水溶性有机物光谱学变化特征[J]．环境科学学报，2001，21(4)：470~474．

[15] 窦森，陈恩凤，须湘成，等．施用有机肥料对土壤胡敏酸结构特征的影响——胡敏酸的光学性质[J]．土壤学报，1995，32(1)：40-49．

[16] 李艳霞，王敏健，王菊思．有机固体废弃物堆肥的腐熟度参数及指标[J]．环境科学，1999，20(2)：98-103．

[17] Inbar Y，Chen Y，Hadar Y．Solid-state 13C NMR and infrared spectroscopy of composted organic matter[J]．Soil Sci．Soc．Am．J．，1989，53：1695-1701．[18] Inbar Y，Chen Y，Hadar Y． 13C CPMAS NMR and FTIR spectroscopic analysis of organic matter transformation during composting of solid wastes from wineries[J]．Soil Sci．，1991，152：272-282．

19] Baes A U，Bloom P R．Diffuse reflectance and transmission Fourier transform infrared (DRIFT) spectroscopy of humic and fulvic acids[J]．Soil Sci．Soc．Am．1989，53：695-700．

[20] Evans P A．Differentiating “hard” from “soft” woods using Fourier transform infrared and fourier transform Raman

spectroscopy[J]．Spectrochem．Acta．1991，47：1441-1447．

[21] Gilbert C，Kokot S，Meyer U．Application of DRIFT spectroscopy and chemometrics for the comparison of cotton fabrics[J]．Appl．Spectr．，1993，47：741-748．

[22] Gressel N，Inbar Y，Singer A，et al．Chemical and Spectroscopic Properties of Leaf Litter and Decomposted Organic Matter in the Carmel Range，Israel[J]．Soil Biol．Biochem．，1995，27：23-31．

[23] Michell A J．Second-derivative FTIR Spectra of Native

Celluloses[J]．Carboh．Res．，1990，197：53-60．

[24] Stewart D，Morrison I M．FT-IR Spectroscopy as a Tool for the Study of Billogical and Chemical Treatments of barley Straw[J]．Sci．Food Agric．，1992，60：431-436．

[25] Inbar Y，Chen Y，Hadar Y．Characterization of Humic Substances Formed during the Composting of Organic Matter[J]．Soil Sci．Soc．Am．，1990，54：1316-1324．

[26] Schnitzer M．，Khan S．U．Humic Substances in the Environment[M]．New York：Marcel Dekker，Inc．，1972．

[27] Seitz W R．Fluorescence methods for studying speciation of pollutants in water[J]．Trends in Analytical Chemistry，1981，1：79-83．

[28] 俞天智，滕秀兰，杜金州等．大亚湾土壤胡敏酸的荧光光谱特征[J]．光谱学与光谱分析，1998，18(6)：1-6．

[29] Ghosh K，Schnitzer M．Fluorescence excitation spectra of humic substances[J]．Can J Soil Sci，1980，60：373-379．

[30] Olk D C，Brunetti G．，Senesi N．Decrease in humification of organic matter with intensified lowland rice cropping：A wet chemical and spectroscopic investigation[J]．Soil Science Society of America Journal，2000，64：1337-1347．

[31] Aguer J P，Trubetskaya O，Trubetskoj O，et al．Photoinductive properties of soil humic acids and their fractions obtained by tandem size exclusion chromatography-polyacrylamide gel electrophoresis[J]．Chemosphere，2001，

44(2)：205-209．

[32] Senesi N，Miano T M，Provenzano M R．et al．Characterization，differentiation，and classification of humic substances by fluorescence spectroscopy[J]．Soil Sci．，1991，152(4)：259-270．

[33] Wei Z M，Xi B D，Wang S P，et al．Fluorescence characteristic changes of dissolved organic matter during municipal solid waste composting[J]．Journal of Environmental Sciences，2005，17(6)：953-956．

[34] 魏自民，席北斗，赵越，等．接种外源微生物生活垃圾堆肥中的胡敏酸荧光特性[J]．环境科学学报，2005，25(10)：1349-1354．

[35] Provenzano M R，Senesi N，Piccone G．Thermal and spectroscopic characterization of composts from municipal solid wasters[J]．Compost Science & Utilization，1998，6(3)：67-73．

[36] 刘伟，胡斌，于敦源，等．我国重质油的三维荧光特征及其地质意义[J]．物探与化探，2004，28(2)：127-129

[37] Miikki V，Senesi N，Hanninen K．Characterization of humic materials formed by composting of domestic and industrial biowastes[J]．Chemosphere，1997，34：1639-1655．

[38] 傅平青，刘丛强，吴丰昌．三维荧光光谱研究溶解有机质与汞的相互作用[J]．环境科学，2004，25(6)：140-144

[39] Wu F C，Midorikawa T，Tanoue E．Fluorescence properties of organic ligands for coper (II) in Lake Biwa and its rivers[J]．Geochemical Journal，2001，35：333-346．

[40] Wu F C，Tanoue E．Isolation and partial characterization of dissolved copper complexing ligands in stream waters[J]．Environ．Sci．Technol．，2001，35：3646-3652．

[41] Coble P G．Characterization of marine and terrestrial DOM in seawater using excitation-emission matrix spectroscopy[J]．Marine Chemistry，1996，51：325-346．

[42] Baker A．Fluorescence excitation-emission matrix characterization of some sewage-impacted rivers．Environ．Sci．Technol．，2001，35：948-953．