耳聋基因治疗
耳聋基因治疗
耳聋是一组临床异质性很高的疾病，发病年龄、严重程度及损害部位各不相同，约60%的耳聋与遗传因素有关。人类全基因组测序工作完成后，人类基因组计划（H u m a n G e n o m e P r o j e c t,H G P）开始转入功能基因组研究阶段（I n t e r n a t i o n a l H u m a n G e n o m e S e q u e n c i n g C o n s o r t i u m，2001；
C o l l i n s e t a l，2001），应用H G P基因组作图和测序的成果以及不断改进的基因定位克隆技术，遗传性听力损害致病基因的定位克隆工作近年来取得了令人瞩目的进展。目前已定位的非综合征型遗传性聋基因位点111个，41个耳聋基因已被克隆，包括16个常染色体显性遗传基因，18个常染色体隐性遗传基因，2个X-连锁遗传基因，另有5个既表现为常染色体显性遗传又表现为常染色体隐性遗传基因（G J B2、G J B3、M Y O7A、T M C1、T E C T A）。这些基因编码的蛋白质包括离子通道蛋白、膜蛋白、转录因子和结构蛋白等（V a n C a m p&S m i t h；袁慧军,2003）。作为了解听觉通路分子机制的第一步，这些研究成果已成为为耳聋患者提供可靠的临床诊断和遗传咨询及潜在的治疗方案的生物学依据。耳蜗组织一直被认为是分裂期后终末分化的组织，损伤后不能再生，因此，尽管耳聋的发病率很高，但其治疗方法目前还仅限于助听器和人工耳蜗移植，缺乏有效的药物和生物治疗手段。了解听觉通路的分子机制有助于我们开发以基因和细胞为基础的新的治疗方法，如耳聋的基因治疗（g e n e t h e r a p y）。
基因治疗作为生物学和临床科学领域里的热门研究课题之一，以全新的医学概念和手段，给人类带来了许多惊喜，随着医学分子遗传学研究的深入，许多遗传病的发病机制在基因水平已得到阐明，使基因治疗发展速度大大加快。尽管在科学技术层次上基因治疗仍有许多障碍还有待于克服，在社会伦理道德法律上还有不同争议，但基因治疗在短短的10年里，很快从科学圣殿走向了世俗社会，从实验室研究进入了临床实践。
第1节 发展历程
基因治疗是指将人的正常基因或有治疗作用的基因通过一定方式导入人体靶细胞以纠正基因的缺陷或者置换致病基因，从而达到治疗疾病目的的生物医学新技术。E d w a r d T a t u m和J o s h u a L e d e r b e r g在60年代曾提出可利用病毒作基因转移载体的构想，但直到1990年，用基因治疗手段尝试治疗腺苷酸脱氨酶缺乏症（a d e n o s i n e d e a m i n a s e d e f i c i e n c y）才成功实现，基因治疗的对象也逐渐从遗传病被扩展到肿瘤等多种疾病。目前基因治疗的概念有了较大的扩展，凡是采用分子生物学的方法和原理，在核酸水平上开展的疾病治疗方法都可称为基因治疗。自从1990年5月美国批准了第一例临床基因治疗临床试验（治疗严重复合性免疫缺陷症）以来，基因治疗已从
单基因遗传病扩展到多个病种范围，基因治疗临床试验达近600个，治疗的各种病例数约5000个。基因治疗使得给药更加特异、高效和安全，达到医学科学所期望达到的最高目标。许多疾病是局部组织器官结构和功能障碍，不需全身用药。基因治疗技术保证了局部用药的疗效，这种优势将对医疗方式做出重大改变。基因治疗从20世纪80年代起至今经历了3个阶段：一是探索期（1980年～1989年），这个阶段中，科学家们在临床前研究方面进行了大量工作。二是狂热期（1990年～1995年），是随着1990年9月第一例基因治疗应用获得成功，使医学生物学领域一片狂热，但一些关键性技术没有得到解决，使临床应用遭受挫折。三是理性期（1996年之后），在对过去几年基因治疗临床试验进行总结评估后，提出了重点对基因治疗关键性问题进行研究的必要性，使基因治疗转入理性化的正常轨道。全世界的基因治疗临床方案逐年增加，但基因治疗要取得突破，必须解决基因导人系统、基因表达的可控性以及更多完美的治疗基因等3个关键性问题。
第2节 策 略
随着对疾病本质的深入了解和新的分子生物学方法的不断涌现，基因治疗发展迅速，前景看好。根据不同方法，基因治疗策略大致可分为以下几种。
1.基因置换和基因修复 基因置换（g e n e r e p l a c e m e n t）和基因修复（g e n e c o r r e c t i o n）即将正常的基因原位替换致病基因或将致病基因中的突变碱基序列纠正，使病变细胞内的D N A完全恢复正常状态。这种治疗方法最为理想，但目前由于技术原因尚难达到。
2.基因修饰 基因修饰（g e n e a u g m e n t a t i o n）又称基因增补，是将目的基因导入病变细胞或其他细胞，目的基因的表达产物能修饰缺陷细胞的功能或使原有的某些功能得以加强。在这种治疗方法中，缺陷基因仍然存在于细胞内，目前基因治疗多采用这种方式。
3.基因失活基因失活（g e n e i n a c t i v a t i o n）即利用反义核酸技术特异地封闭有害基因，抑制这些有害基因的表达，以达到治疗疾病的目的。如利用反义R N A、核酶或肽核酸等抑制一些癌基因的表达，抑制肿瘤细胞的增殖，诱导肿瘤细胞的分化。用此技术还可封闭肿瘤细胞的耐药基因的表达，增加化疗效果。
第3节 基因转运工具
决定基因治疗发展最关键的技术在于基因转移载体的改进和基因转移靶细胞的选择。目前已有多种基因转运的方式，其基本原则是将外源基因运到细胞内。
目前基因治疗常用的载体可分为两大类：病毒载体和非病毒载体。病毒载体可分为以R N A病毒为基础的逆转录病毒载体，因只能感染具有复制能力的分裂细胞使其应用受到限制；以D N A病毒为基础的病毒载体，包括腺病毒（A d）、单纯疱疹病毒（H S V）、腺病毒相关病毒（A A V）等载体，非病毒载体包括脂质体载体等。
腺病毒载体能感染失去分裂能力的细胞，且携带的基因长度为36k b。腺病毒载体到目前为止已发展到第三代，其特点是：容量大、副作用大幅度降低，而且在目的的基因的表达时间也大大延长。目前，应用腺病毒载体最为成功的是可使目的基因在生物体内持续稳定表达10个月以上，细胞毒性很小（L a l w a n i e t a l，1998a；D u a n e t a l，2002）。单纯疱疹病毒载体的最大优点是容量大，可同时容纳高达50k b的多个目的基因。
目前使用的各种病毒载体都有明显的缺点，如腺病毒载体可在机体内引起免疫和炎症反应，H S V载体有病毒复制可能及产生严重细胞毒性的弊端，A A V其插入的D N A片段较小，且难以制备高滴度制剂。非病毒载体的质粒脂质体复合体不能复制或重组，能感染分裂细胞和非分裂细胞，缺乏蛋白质成分，很少引起炎症和过敏反应，但其转染率较低，缺乏细胞特异性，很难控制遗传物质在靶细胞上的插入位置。近几年刚发展起来的嵌合型病毒载体是载体研究的一个热点，它是通过分子生物学技术把两种或两种以上的病毒载体结构结合起来，从而得到一种既有各家之长而无各家之短的新型嵌合病毒载体，这种载体系统已取得一系列重大成果。基因转移的载体和方法由原来的几种增加到10种左右，应用最多的仍是反转录病毒载体，但微小腺病毒载体和嵌合型病毒载体其应用前景看好，目前基因治疗中有关载体系统的研究正围绕着以下方面展开：①载体的安全性 (病毒载体有感染病毒的危险)；②进一步减少机体针对载体的免疫反应(即拒绝接受转移基因)；③易于操作。在不远的将来，结合了病毒载体的高感染性和稳定性及非病毒载体的安全性的“超级”载体的问世将为耳聋基因治疗带来更为光明的前景。但目前仍没有非常理想的基因治疗载体在听觉系统中应用，限制的内耳基因治疗的临床应用研究。
与病毒载体相比，非病毒载体具有制备简单、易于大量生产、无特异性免疫反应等优点，近年来已发展了数种非病毒运载方法：基因枪、电穿孔、裸露的质粒D N A直接注射及阳离子脂质体复合物等。阳离子脂质体主要由阳离子成分和中性脂质组成，包括3个基本成分：疏水性脂质基团、连接基团、正电荷头部基团，是能与负电荷D N A磷酸盐骨架相互作用、中和电荷并促进D N A 浓缩的两亲性分子。阳离子脂质体转基因的效率除受阳离子脂质体的组成、脂质与D N A的摩尔比、脂质-D N A复合物的稳定性以及转染组织或细胞的类型等因素影响外，还与基因进入细胞质和细胞核的效率有关。W a r e i n g等应用阳离子脂质体携带β-半乳糖苷酶报告基因经圆窗注入豚鼠耳蜗，免疫组化和P C R技术检测显示除血管纹外，在耳蜗感觉神经上皮及周围组织中均有表达，并可持
续14天，未见毒性及炎性反应，外淋巴使转染复合物以简单扩散的方式到达靶部位，与病毒载体不同，对侧耳蜗呈阴性反应，提示阳离子脂质体作为耳蜗基因治疗载体具有较好的安全性（W a r e i n g e t a l，1999；W a r e i n g e t a l，2002）。阳离子脂质体由生物体内可降解的成分组成，对细胞毒性小，对基因的大小无限制，可携带大分子D N A，并且其转基因操作简单，重复性好，能转染分裂细胞及非分裂细胞，如果能进一步提高体内转染效率及基因表达量等技术问题，脂质体作为基因治疗载体将会很快应用于临床。
第4节 导入途径和表达特点
耳蜗是一个骨性的腔，通过血迷路屏障与机体其他部位相对隔离，内、外淋巴液充满耳蜗的底部至顶部，可以将药物迅速弥散至整个耳蜗，从某种意义上说耳蜗是最适合进行基因治疗的靶器官，但内耳狭小而封闭的结构也对将基因治疗载体导入耳蜗而不损害残余听力造成困难。大多数的研究方案都是通过耳蜗开窗或圆窗膜直接注射或用渗透压泵将基因治疗载体导入耳蜗外淋巴间隙，并常常观察到脑脊液和对侧耳蜗基底转有剂量依赖性的治疗载体的弥散，学者们推测这些治疗载体是通过耳蜗导水管扩散而来的（R a p h a e l e t a l，1996；J e r o e t a l，2001）。K a w a m o t o 等（2001）比较了耳蜗开窗和半规管开窗途径对小鼠基因表达和耳蜗功能的影响，发现半规管开窗途径的基因表达可持续4周，在后半规管、球囊、椭圆囊和耳蜗的外淋巴间隙均有表达，耳蜗开窗途径在耳蜗外淋巴间隙的基因表达与半规管开窗途径相似，此外还见于内毛细胞、D e i t e r s 细胞及球囊的支持细胞。听性脑干反应检测显示半规管开窗对耳蜗的损伤比耳蜗开窗途径要小，作者认为半规管开窗途径可转染耳蜗和前庭组织，并可较好地保护耳蜗功能。
近年来对各种载体应用于耳蜗转染也做了很多的探索，表17-1总结了各种载体在耳聋基因治疗中的表达特点（W e i s s e t a l，1997；L a l w a n i e t a l，1996,1998a,1998b；D e r b y e t a l，1999；
H a n e t a l，1999；W a r e i n g e t a l，1999；L u e b k e e t a l，2001；S t a e c k e r e t a l，2001；D u a n e t a l，2002；K a w a k a m i e t a l，2002）。
表17-1各种载体在内耳的表达特点
载体 毛细胞 支持细胞 听觉神经元 血管纹 Reissner’s膜 螺旋韧
带 免疫反应
腺病毒相关病毒 +++-++-腺病毒 +++++++
单纯疱疹病毒 -++-+++牛痘病毒 ++-+++四角病毒 --+-++-脂质体 +++-++-
第5节 主要进展
内耳作为基因治疗比较理想的模型，有几个独特的优势。首先，内耳相对独立的解剖结构可以极大地减少治疗基因感染其他组织所引起的副作用,治疗基因的浓度和剂量容易把握,非常适合进行在体的基因治疗研究。其次，有很多的技术手段可以监测内耳各种细胞的功能，以实时评估内耳基因治疗的效果和安全性，如耳蜗微音器电位（C M）和耳声发射（O A E）可以评估外毛细胞的损伤状态，复合动作电位（C A P s）可以评估内毛细胞的功能，而单细胞记录可以评估螺旋神经节细胞的功能，耳蜗内电位（E P s）可以监测耳蜗内淋巴离子平衡的状态。再次，可用于耳聋基因治疗的基因选择非常多，目前已知有90多种基因与内耳的功能和发育有关（I n t e r n a t i o n a l H u m a n G e n o m e S e q u e n c i n g C o n s o r t i u m,2001），神经营养因子是药物性或噪声性耳聋基因治疗非常好的选择。对耳聋基因治疗的研究始于1996年，近十年来对耳聋基因治疗的探索主要集中在以下几个方面：①预防毛细胞死亡；②导入并调控治疗基因的表达；③抑制负性调解因子的作用；④干细胞基因治疗（L a l w a n i&M h a t r e，2003；A t a r&A v r a h a m，2003；M a i o r a n a&S t a e c k e r，2005）。
1．预防毛细胞死亡神经营养因子、抗氧化剂、抗凋亡因子可保护毛细胞对抗声损伤及氨基苷类抗生素等耳毒性药物的损害，但目前还不清楚它们对遗传因素所致的毛细胞死亡是否具有保护作用，这主要是因为遗传因素所致的毛细胞死亡机制还不十分清楚。体内和体外实验均表明抗凋亡因子—— C a s p a s e-3抑制因子（如z V A D和B A F）能够促进氨基苷类抗生素等耳毒性药物作用后毛细胞的存活（M o r i s h i t a e t a l，2001；A l a m e t a l，2001；M a t s u i e t a l，2003）。转录因子P O U4F3在人和小鼠感觉毛细胞的发育过程中起着至关重要的作用，P o u4f3基因敲除小鼠耳蜗和前庭毛细胞完全缺失并导致全聋，在胚胎发育晚期P o u4f3基因敲除小鼠耳蜗和前庭毛细胞通过凋亡机制逐渐变性死亡（V a h a v a e t a l，1998）。老化、耳毒性药物和遗传基因突变所致耳聋的最终路径都是通过凋亡完成的。因此，抗凋亡因子已成为内耳保护性基因治疗最重要的候选基因。
2．神经营养因子内耳基因治疗病理学研究表明，噪声、耳毒性药物和感染等多种损伤均可不同程度地引起毛细胞和螺旋神经节细胞的损伤，在螺旋器中的毛细胞可提供多种营养因子以维持螺旋神经节细胞的存活，因此毛细胞的死亡往往进一步引起螺旋神经节细胞的退变和死亡。脑
源性神经营养因子（B D N F）和神经营养因子-3（N T-3）作为神经营养因子中神经营养素家族成员在内耳听神经元的发育、存活及生理功能维持中起着重要作用。其中N T-3是Ⅰ型听神经元（支配内毛细胞）的主要生成因子（B o w e r s e t a l，2002），B D N F是Ⅱ型听神经元（支配外毛细胞）的主要生成因子（S t a e c k e r e t a l，1998）。B o w e r s等利用腺病毒载体介导的N T-3基因在豚鼠噪声性耳聋模型上进行内耳保护性基因治疗研究，结果表明N T-3基因可长期表达于内耳，并在噪声引起和毛细胞死亡后有效地抑制螺旋神经节细胞的退变（B o w e r s e t a l，2002）。
3．调节毛细胞分化的基因治疗非哺乳类脊椎动物的毛细胞损伤后可以再生，近年来许多研究致力于揭示这些新生毛细胞的祖细胞并发现了许多可调节和促进毛细胞增殖和分化的基因及支持细胞。最重要的研究方向集中在将外源基因导入耳蜗诱导非感觉细胞或受损毛细胞转化为功能毛细胞。在胚胎发育过程中，由细胞内信号系统和特异性基因表达控制的一系列细胞活动决定细胞分化的命运。在内耳，已经明确有几种基因参与毛细胞的分化过程，如我们所熟知的哺乳动物具有螺旋-环-螺旋结构的转录因子A t o h1（以前称为M a t h1）基因，即为毛细胞分化所必需，A t o h1基因敲除小鼠耳蜗和前庭毛细胞完全缺失，而导入A t o h1基因可长出新的毛细胞，在过去几年中这一研究领域取得了重要的突破（B e r m i n g h a m e t a l，1999；Z h e n g&G a o，2000；I z u m i k a w a e t a l，2005），R a p h a e l研究小组报导了将A t o h1基因用腺病毒载体导入到药物致聋的豚鼠耳蜗中，8周后受损的耳蜗即出现新生的毛细胞，并且具有功能，受损耳蜗的听力也有明显的改善，学者们推测新生毛细胞来源于支持细胞或其他邻近螺旋器的非感觉细胞（I z u m i k a w a e t a l，2005）。除A t o h1外的其他几种调节毛细胞分化的基因也可用于基因治疗，如A t o h1的负性调节因子H e s1和H e s5基因。实验证明，H e s1基因敲除小鼠耳蜗内毛细胞数目比野生型小鼠明显增长，H e s5基因敲除小鼠外毛细胞数目比野生型小鼠要多（Z i n e e t a l，2001），这些研究结果为探索基于毛细胞的分化关键基因表达的内耳基因治疗提供了非常有价值的研究平台。
4．细胞周期调节基因在正常的细胞周期中，细胞周期素依赖性激酶（C D K）的活性控制着驱动细胞进入S期的信号，包括至少3类蛋白家族：I n k4、C i p/K i p及R b包装蛋白（L o w e n h e i m e t a l，1999；C h e n e t a l，2003；M a n t e l a e t a l，2005），这些基因产物可抑制细胞进入S期，被命名为C D K抑制因子（C K I）。近年来的动物实验已经证实这些基因的缺失可解除对毛细胞增殖的抑制，使毛细胞重新进入有丝分裂周期而获得增殖分化的能力，预示了C K I类细胞周期调节基因在内耳毛细胞再生基因治疗中的应用价值。值得注意的是，这类因子也有可能引发细胞的恶变，用于基因治疗有一定的风险。
5．靶向表达研究基因治疗成功与否还取决于载体系统能否将足够数量的目的基因转运到靶细胞并产生有治疗效应的表达水平。组织特异性启动子可以帮助治疗基因在特定的靶细胞选择性
地表达（B o e d a e t a l，2001），对启动子的修饰可产生不同的表达模式和表达程度。已经发现的A t o h1增强子和M Y O7A毛细胞特异性启动子可用以介导治疗基因的毛细胞靶向表达。另一种方式是靶细胞特异性表面受体作为配体与基因治疗载体相结合介导治疗基因的靶向表达，但目前还没有发现毛细胞特异性表面受体可作为配体介导治疗基因的靶向表达。
6．干细胞治疗2003年，利用胚胎干细胞、成人内耳干细胞和神经干细胞在体内产生毛细胞的研究取得了突破性进展（L i e t a l，2003）。胚胎干细胞是来源于胚胎早期内胚层的多能干细胞，H e l l e r研究小组成功地在体外从胚胎干细胞中获得了内耳前体细胞，这些前体细胞可表达毛细胞特异性分子标记，如转录因子A t o h1和P o u4f3及毛细胞结构蛋白m y o s i nⅦa、e s p i n和p a r v a l b u m i n3。这些前体细胞被移植到鸡胚内耳后，只有位于内耳上皮的移植细胞可表达毛细胞特异性分子标记，提示移植细胞的微环境可影响干细胞的分化（L i e t a l，2003）。下一步需要观察在小鼠中是否能得到类似的结果。
目前从成体器官中获得干细胞的技术已比较成熟，无论是神经干细胞（N S C）还是内耳干细胞在体内或体外均有分化为不同类型内耳细胞的能力，从这两种成体干细胞产生的内耳细胞类型及所表达的特异性分子标记均不同。随着对神经干细胞生物学性状的深入研究，其诸多的优点显示了作为新一代基因治疗载体的广阔前景：①低免疫原性和良好的宿主细胞整合能力，体外分离、增殖的N S C移植后能够从细胞结构上与宿主细胞整合，在生长因子、微环境等信号的调节下可迁移分化成特定的神经细胞，并与其他神经元建立突触联系，发挥正常的细胞功能。②作为N S C的基本生物学特性，其多潜能分化和自我更新能力可使之在体内分化成多种特定的细胞；③受病变部位神经源性信号的影响，移植后的N S C具有向病变部位迁移是嗜性和极强的能力。目前研究的主要目的是利用移植的N S C来诱导毛细胞的再生从而修复受损的耳蜗，进行感音神经性耳聋的治疗。J o i c h i等报道，从成年F i s h e r鼠海马组织中分离的N S C经过体外培养，经圆窗或卵圆窗注入耳蜗，2～4周后发现一些N S C可以在耳蜗中存活，其中一些出现在毛细胞的位置上，一些存活的N S C可以向远处迁徙到达螺旋器，并具有明显的内、外毛细胞形态学特征，但没有明显的证据表明N S C可转变为螺旋神经节细胞，而且这些新生毛细胞的功能如何还需进一步研究（I g u c h i e t a l，2003）。
目前所有的内耳干细胞治疗研究还没有证实这些干细胞能够转变为有功能的新生毛细胞并整合到听觉上皮中，要恢复听力首先要形成正确的神经通路，有几个关键的问题必须明确：①新生毛细胞的位置是否至关重要？②是否要重建精确的内耳空间结构才能获得听力功能？③随机分布的新生毛细胞是否能将信号正确地传给大脑？此外，要面临的挑战也很多，如何防止这些干细胞转变为肿瘤细胞，以及选择合适的动物模型尽量避免或减少外科手术并发症的问题。
第6节 安全性问题
在早期关于耳蜗基因转移的研究中人们已认识到安全性问题，1996年L a l w a n i等利用A A V载体进行基因治疗研究时就观察到在A A V灌注动物的对侧耳蜗有转基因的表达，虽然比直接灌注的耳蜗要弱得多。随后,S t o v e r等（2000）用腺病毒也证明了对侧耳蜗的转基因表达。这一发现引起了学者们对病毒载体从靶组织向外扩散的担心，病毒出现在远离转染靶点的组织可能是通过血液循环扩散而来。另一种可能的解释可能是通过颞骨骨髓腔或脑脊液A A V迁移到对侧耳蜗（K h o e t a l，2000）。灌注了病毒载体的外淋巴液通过耳蜗导水管直接与脑脊液相通，随后的研究也显示，通过直接显微注射或圆窗给药可以很大程度上消除病毒载体在给药耳蜗外的扩散。
第7节 展 望
耳聋基因治疗研究在近5年中进步显著，导入方法的巨大改进已能够完好地保护内耳的功能。基因治疗可以改变内耳细胞微环境及细胞表型，这些在实验研究中观察到的现象奠定了全新的内耳治疗学发展基础。最终将基因治疗技术用于耳聋治疗的关键步骤目前已取得成功：病毒和非病毒载体已被证明可将外源基因导入外周听觉系统并表达。未来更精细的工作将是发展整合了病毒载体的高感染性和稳定性以及脂质体的安全性等优点的新型嵌合型载体，基因导入也将首选能最大程度地减轻耳蜗组织及听力损伤的方法如显微注射或圆窗膜导入载体，治疗制剂的局部和远距离扩散也将被实时监控并减到最低（P r a e t o r i u s e t a l，2003）。
现阶段探索耳聋基因治疗研究的主要工作都集中在用遗传学方法将内耳缺失的关键成分补足，很多努力都失败了，这一领域的研究结果还远没有达到我们的期望值。相对而言，反义R N A 或R N A干扰技术已经显示出了在耳聋基因治疗研究中更好的潜力，但R N A干扰技术在临床上应用还有很多障碍，如合适有效的导入方法、持续稳定地沉默致病基因的表达并对抗干扰素的反应等（M a e d a e t a l，2005）。总之，通过改进导入方法，修饰负性调节基因和细胞周期基因，将有利于促进新生毛细胞的生长。随着对细胞死亡、细胞周期和增殖分化分子机制更深入的了解及基因导入技术的不断改进，随着对听觉传导通路调节网络日益深入的揭示，耳聋基因治疗将不再局限于某种单一方法的探索，而是整合了干细胞治疗、基因调节和药物诱导的综合治疗方案。
（袁慧军 解放军总医院；迈阿密大学 刘学忠）
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基因治疗
基因治疗 基因治疗的发展 基因治疗的设想始于1967年，1973年一名美国研究人员和几位医生在德国进行了世界上第一例基因治疗试验，接受治疗的患者为两姐妹，研究人员将一种名为肖普氏乳头瘤的病毒(这种病毒携带有一种酶基因可能会使人本身的酶分泌正常)注射到患者体内,结果是既没有产生任何疗效,也没有出现不良反应。1980年随着外源基因导入小鼠实验的成功，美国的另一名医生对两名地中海患者进行了第二例基因治疗，结果同样没有取得成功。 20世纪80年代初，美国科学家Anderson基因治疗的前景和发展方向。此后的几年之中，一大批科学家在动物身上进行了大量的基因转移实验和基因标记实验，为以后基因治疗的临床应用积累了许多经验，也奠定了临床应用的理论基础。1990年，美国国立卫生研究院的Blaste R.M.和Anderson W.F.用腺苷酸脱氨酶（ADA）基因导入一位由于ADA基因缺陷导致严重免疫缺损的4岁患者的淋巴细胞中，治疗取得了成功，转入这种可以产生腺苷酸脱氨酶能力的淋巴细胞后，患者症状得到明显缓解。第二例接收同样方法治疗的的SCID患者是一名九岁的小女孩，治疗也同样取得成功。1991年，美国科学家Rosenberg的研究小组对50名黑色素瘤晚期患者进行了基因治疗，将外源性肿瘤坏死因子转入肿瘤中的浸润淋巴细胞,结果这种转化的TIL能集中在肿瘤所在部位并杀伤肿瘤细胞,治疗也取得了一定效果。此后世界各国都掀起了基因治疗的研究热潮，1991年美国国立卫生研究院连续批准了包括肿瘤坏死因子基因导入肿瘤细胞在内的11项人类基因治疗的实验方案。2001年法国巴黎内克尔儿童医院利用基因治疗使数名有免疫缺陷的婴儿恢复了正常的免疫功能，成为基因治疗开展近十年来科学家取得的最大成功。目前基因治疗主要集中在美国，其次是欧洲。基因治疗的适用范围也越来越广，其中，癌症居基因治疗首位，其次是单基因疾病，心血管病，传染性疾病和其他疾病。 我国的基因治疗的研究工作开展的也相对较早，且获得了很好的疗效。1991年7月，中国复旦大学与第二军医大学长海医院合作，从一批自愿接受基因治疗的凝血因子IX基因缺陷血友病B患者中选择了两兄弟开始进行基因治疗临床研究。研究人员将凝血因子IX基因导入患者皮肤成纤维细胞，再将转化的皮肤成纤维细胞回输到患者体内。经过几次转化细
基因诊断和治疗的医学应用
基因诊断和治疗的医学应用 郭龙飞 （保山学院资源环境学院云南保山678000） 摘要：各种癌症和恶性肿瘤是目前危害人类健康最为严重的疾病之一，且死亡率很高，现在还没有一种有效的治疗方法。传统的手术、放疗和化疗等方法对中晚期的患者治疗疗效已经明显不足。因此。找到一种新的治疗癌症和恶性肿瘤的治疗方法对人类健康发展是意义重大的。而基因治疗则是用各种手段从基因水平上来治疗各种疾病。于是，基因治疗为众多患者提供了希望，成为了现在医学界的热门话题。本文就是依据前人的研究成果，以基因治疗癌症和恶性肿瘤为主来论述基因治疗在医学上的应用。 关键词：基因诊断基因治疗癌症恶性肿瘤 1基因治疗概述 基因治疗的基本含义是通过遗传或分子生物学技术在基因水平上治疗各种疾病[1]。它是指将人的正常基因或有治疗作用的基因通过一定方式导入人体靶细胞,以纠正基因缺陷或者发挥治疗作用,从而达到治疗疾病的目的。广义的基因治疗是指利用基因药物的治疗,而通常所称狭义的基因治疗是指用完整的基因进行基因替代治疗,一般用DNA序列[2]。它是运用基因工程技术直接纠正肿肿瘤细胞基因的结构及（或）功能缺陷，或者间接通过增强宿主对肿瘤的杀伤力和机体的防御功能来治疗肿瘤。通过外源基因的导入，激活机体抗瘤免疫，增强对肿瘤细胞的识别能力、抑制或阻断肿瘤相关基因的异常表达或增加肿瘤细胞对药物的敏感性，这些基因主要包括细胞因子基因、抗肿瘤基因、肿瘤药物相关基因和病毒基因等[3]。 目前基因治疗的方式(type of gene therapy)主要有3种：①基因矫正或置换：即对缺陷基因的异常序列进行矫正，对缺陷基因精确地原位修复，或以正常基因原位置换异常基因，因此不涉及基因组的任何改变。②基因增补：不去除异常基因，而是通过外源基因的导人，使其表达正常产物，从而补偿缺陷基因的功能。③基因封闭：有些基因异常过度表达，如癌基因或病毒基因可导致疾病，可用反义核酸技术、核酶或诱饵转录因子来封闭或消除这些有害基因的表达[4]。 2基因诊断应用 2.1基因诊断新生儿脊髓性肌萎缩 目前报道有一些较严重的SMA I型患儿会出现关节挛缩、骨折、呼吸困难和感觉神经元受损的表现，但机制还不清楚，可能与5ql3缺失大小有关。SMA尚无特异的治疗方法，临床主要是对症治疗，如早期发现SMA患儿呼吸系统受累并干预性通气治疗可以延长疾病的病程、改善患儿生活质量、减少肺部继发性感染及呼吸衰竭发生。本例患儿经抗炎、吸氧、吸痰、补充维生素、给予丙种球蛋白等对症治疗和支持治疗，呼吸困难逐渐缓解，双肺痰鸣音减少，但最终家长考虑远期预后不良而放弃治疗[5]。 最近，在体外实验研究中发现丁酸纳、丙戊酸和Htra—ISl的调节因子可以增加SMN2基蛋白的作用，而且对细胞几乎没有毒性作用，但研究工作还处于动物实验阶段，没有正式应用于临床，该类药物可能为SMA的治疗开辟了新的途径[5]。 2.2早期胰腺藩的基因诊断 近年来，胰腺癌的发病率和死亡率呈逐渐上升趋势，每年有新发病例约20万人，占全部恶性肿瘤发病的2％。其发病匿，早期缺乏特异表现，恶性程度高，极易出现转移，80％-90％的胰腺癌病人就诊时，已经到了晚期，手术切除率只有15％，年生存率为1％-5％。而早期胰腺癌的手术切除率为90-100％，5年生存率可达70％- 100％。另有研究表明，肿瘤的大小是重要的生存率预测因子，如果直径 2020年细胞和基因治疗CDMO行业研究报告 一、细胞和基因治疗：创新疗法的新方向 （一）细胞治疗：CAR-T 是目前商业化的主流方向 细胞疗法的原理是通过向患者移植正常或生物工程改造过的人体细胞以替代失去正常功能的细胞。人体中包含200多种不同的特殊细胞类型，例如肌肉，骨骼或脑细胞。这些细胞在体内执行特定功能，疾病或衰老可能导致人体细胞失去这些分化细胞。在许多情况下，这种缺失是不可逆的，也就意味着患病或丢失的细胞不再能被健康的细胞所补充。细胞疗法旨在将新的健康细胞人为地引入患者体内，以替代患病或缺失的细胞。 细胞治疗最早可以追溯到上个世纪30年代，而近代细胞治疗的快速兴起则是在2011年之后。2011年10月，法国科学家拉尔夫·斯坦曼因“发现树突状细胞和其在后天免疫中的作用”获得诺贝尔医学奖，标志着生物免疫治疗成为癌症治疗的新型疗法。此后，细胞治疗迅速兴起，在一些复杂的肿瘤疾病治疗中率先进行临床试验，被Science杂志评为2013 年10大科技突破之首。 细胞疗法按照引入的细胞种类可以分为干细胞治疗和免疫细胞治疗。干细胞治疗是利用人体干细胞的分化和修复原理，把健康的干细胞移植到病人体内，以达到 修复病变细胞或重建功能正常的细胞和组织的目的。干细胞是一类具有无限的或者永生的自我更新能力的细胞、能够产生至少一种类型的、高度分化的子代细胞，具有多能性和全能性、自我更新能力和高度增殖能力等优点。患者自体干细胞较易获得，致癌风险也很低，同时也没有免疫排斥及伦理争议等问题，被更多地应用于临床。用于临床治疗的干细胞种类主要有骨髓干细胞、造血干细胞、神经干细胞等。干细胞治疗被广泛应用于临床各类疾病的治疗，主要包括血液类疾病、器官移植、心血管系统疾病、肝脏疾病、神经系统疾病、组织创伤等方面。 免疫细胞治疗的原理是采集人体自身的免疫细胞并进行体外培养扩增，同时加强其靶向性和杀伤力，最后再输入到病人体内以消灭病原体、癌细胞。免疫细胞是指参与免疫应答或与免疫应答有关的细胞，包括NK细胞、T细胞、B细胞、巨噬细胞等。目前免疫细胞疗法主要被运用于癌症的治疗，根据所使用的的免疫细胞不同，分为细胞因子诱导的杀伤细胞（CIK）疗法、API生物免疫治疗、DC+CIK细胞疗法、自然杀伤细胞（NK）疗法、 DC-T 细胞疗法等。 免疫细胞疗法在癌症治疗上的应用主要是通过过继性免疫治疗实现的。过继性免疫治疗是指从肿瘤患者体内分离免疫活性细胞，在体外进行扩增和功能鉴定，然后 2020年细胞和基因治疗CDMO行业调查报告 1 细胞和基因治疗：创新疗法的新方向 （一）细胞治疗：CAR-T 是目前商业化的主流方向 细胞疗法的原理是通过向患者移植正常或生物工程改造过的人体细胞以替代失去正常功能的细胞。人体中包含200多种不同的特殊细胞类型，例如肌肉，骨骼或脑细胞。这些细胞在体内执行特定功能，疾病或衰老可能导致人体细胞失去这些分化细胞。在许多情况下，这种缺失是不可逆的，也就意味着患病或丢失的细胞不再能被健康的细胞所补充。细胞疗法旨在将新的健康细胞人为地引入患者体内，以替代患病或缺失的细胞。 细胞治疗最早可以追溯到上个世纪30年代，而近代细胞治疗的快速兴起则是在2011年之后。2011年10月，法国科学家拉尔夫·斯坦曼因“发现树突状细胞和其在后天免疫中的作用”获得诺贝尔医学奖，标志着生物免疫治疗成为癌症治疗的新型疗法。此后，细胞治疗迅速兴起，在一些复杂的肿瘤疾病治疗中率先进行临床试验，被Science杂志评为2013年10大科技突破之首。 细胞疗法按照引入的细胞种类可以分为干细胞治疗和免疫细胞治疗。 干细胞治疗是利用人体干细胞的分化和修复原理，把健康的干细胞移植到病人体内，以达到修复病变细胞或重建功能正常的细胞和组织的目的。干细胞是一类具有无限的或者永生的自我更新能力的细胞、能够产生至少一种类型的、高度分化的子代细胞，具有多能性和全能性、自我更新能力和高度增殖能力等优点。患者自体干细胞较易获得，致癌风险也很低，同时也没有免疫排斥及伦理争议等问题，被更多地应用于临床。用于临床治疗的干细胞种类主要有骨髓干细胞、造血干细胞、神经干细胞等。干细胞治疗被广泛应用于临床各类疾病的治疗，主要包括血液类疾病、器官移植、心血管系统疾病、肝脏疾病、神经系统疾病、组织创伤等方面。 干细胞的全能型可以被用于细胞治疗 免疫细胞治疗的原理是采集人体自身的免疫细胞并进行体外培养扩增，同时加强其靶向性和杀伤力，最后再输入到病人体内以消灭病原体、癌细胞。免疫细胞是指参与免疫应答或与免疫应答有关的细胞，包括NK细胞、T细胞、B 细胞、巨噬细胞等。目前免疫细胞疗法主要被运用于癌症的治疗，根据所使用的的免疫细胞不同，分为细胞因子诱导的杀伤细胞（CIK）疗法、API生物免疫治疗、DC+CIK细胞疗法、自然杀伤细胞（NK）疗法、DC-T细胞疗法等。 免疫细胞疗法在癌症治疗上的应用主要是通过过继性免疫治疗实现的。过继性免疫治疗是指从肿瘤患者体内分离免疫活性细胞，在体外进行扩增和功能鉴定，然后向患者回输，从而达到直接杀伤肿瘤或激发机体的免疫应答杀伤肿瘤细胞的目的。过继性免疫治疗主要分为三大类：一种方法是利用从患者的肿瘤中分离出的肿瘤浸润淋巴细胞（TIL），在实验室中扩大其数目，然后再注入患者体内；第二种方法是改造从患者身上收获的T细胞，使其表达肿瘤抗原特异性T细胞受体（TCR），以便T细胞可以识别和攻击表达这种抗原的肿瘤细胞；第三种方法与TCR类似，区别在于其在T 细胞上构建的是一个嵌合型抗体受体（CAR），从而让免疫T细胞不仅能够特异性地识别癌症细胞，同时可以激活T细胞杀死癌症细胞。 目前CAR-T是唯一被FDA批准的过继性免疫疗法。TIL和TCR治疗只能靶向和消除在特定情况下（当抗原与主要组织相容性复合物或MHC结合时）呈递其抗原的癌细胞。而CAR的主要优势在于，即使不通过MHC将抗原呈递到表面， 肿瘤基因治疗的最新进展 王佩星 （徐州师范大学科文学院 08生物技术 088316103） 摘要：癌症是一种基因病，其发生、发展与复发均与基因的变异、缺失、畸形相关。人体细胞携带着癌基因和抑癌基因。癌症的基因治疗目前主要是用复制缺陷型载体转运抗血管生成因子、抑癌基因、前药活化基因（如ＨＳＶ－１胸腺嘧啶激酶）以及免疫刺激基因。主要抗肿瘤机制为：抑制肿瘤细胞生长、诱导肿瘤细胞凋亡、诱导抗肿瘤免疫反应、提高肿瘤细胞对化疗的敏感性、提高肿瘤细胞对放疗的敏感性、切断肿瘤细胞的营养供应。 关键词：肿瘤、基因治疗、免疫、原癌基因、抑癌基因 The latest progress of cancer gene therapy WangPeiXing (xuzhou normal university institute of biotechnology 088316103 foremen who 2008) Abstract: the cancer is a genetic disease, its occurrence, development and recurrence are associated with genetic variation, loss, deformity related. Human body cell carries oncogenes and tumor-suppressor genes. Cancer gene therapy is now primarily with copy DCF with carrier transport antiangiogenic factors, tumor-suppressor genes, before medicine activated genes (such as HSV - 1 thymine bases kinase) and immune irritancy genes. Main antitumor mechanism for: inhibiting tumor cell growth, inducing tumor cell apoptosis, inducing antineoplastic immune response, improving the sensitivity of the tumor cells to chemotherapy, radiotherapy of tumor cells to improve sensitivity, cut tumor cells to nutrition. Keywords: tumor, gene therapy, immunity, protocarcinogenic gene, tumor-suppressor genes 从本质上来讲，癌症是一种基因病，其发生、发展与复发均与基因的变异、缺失、畸形相关。人体细胞携带着癌基因和抑癌基因。正常情况下，这两种基因相互拮抗，维持协调与平衡，对细胞的生长、增殖和衰亡进行精确的调控。在遗传、环境、免疫和精神等多种内、外因素的作用下，人体的这一基因平衡被打破，从而引起细胞增殖失控，导致肿瘤发生。基因治疗的策略有基因替代、基因修复、基因添加、基因失活，目前临床使用的最主要方式是基因添加。针对肿瘤的特异性分子靶点设计肿瘤治疗方案，具有治疗特异性强、效果显著、基本不损伤正常组织的优点。这种肿瘤靶向治疗是肿瘤治疗中最有前景的方案。 1.肿瘤基因治疗的历史进展 肿瘤、艾滋病、遗传病是困扰人们的三大疾病，对肿瘤的根治是人们一直迫不及待想要实现的愿望。 基因治疗的发展及其应用 【摘要】基因治疗一种很有发展前途的高新技术。基因治疗有望成为治疗遗传病、肿瘤、心血管病、病毒感染及其它难治性疾病的有效手段，本文通过国内外相关文献的分析，从基因治疗(基因治疗的现状、肿瘤的基因治疗)、基因预防、基因治疗技术、基因治疗存在的问题和未来发展等进行综述。 【关键词】基因治疗;基因预防;基因治疗技术;现状;问题和未来发展 人类的疾病是由于其本身的基因的核苷酸发生变化有关。近年来，基因治疗作为一种安全的、新的疾病治疗手段，在一定程度上取得了重大进展。 1 基因治疗 基因治疗(Genethrapy)是向靶细胞引入正常有功能的基因，以纠正或补偿致病基因所产生的缺陷，从而达到治疗疾病的目的，通常包括基因置换、基因修正、基因修饰、基因失活等。简而言之，基因治疗是指通过基因水平的操纵而达到治疗或预防疾病的疗法。 1.1 基因治疗的现状 生物医学的深入研究表明，人类的各种疾病都直接或间接与基因有关[1]。因此，可认为人类的一切疾病都是“基因病”。故人类疾病可分为三大类。一类是单基因病。这类疾病只需一个基因缺陷即可发生，如腺苷脱氨基酶(ADA)缺陷症。二是多基因病。此类疾病的病因大多比较复杂，不但涉及各个基因，往往还与环境因素(包括自然环境、社会环境、生活方式等)有关。基因缺陷和疾病表型都具有明显的多样性。Ⅰ型糖尿病、肿瘤、心血管疾病等皆属此类。三是获得性基因病。此乃病原微生物入侵所致，如艾滋病、乙型肝炎等。因此，理论上，人类所有的疾病都可采用基因治疗。 1.2 肿瘤的基因治疗 目前治疗癌症的基因疗法种类颇多，主要集中在免疫基因治疗、药物敏感性基因治疗、肿瘤抑制基因治疗治疗三个方面。 1.2.1 免疫基因治疗 常用方法有：①细胞因子基因治疗：将某些细胞因子基因如IL 2、IL 4、IL 6、B7 1，GM CSF等转染肿瘤细胞后，增强机体对肿瘤细胞的免疫反应。②肿瘤抗原基因免疫治疗：将某些肿瘤抗原基因如MHC基因等转染肿瘤细胞，增强肿瘤细胞免疫原性。②反义基因治疗：应用反义核酸在转录和翻译水平，通过碱基互补原则封闭某些异常基因的表达，反义核酸被称为信息药物[3]。④用抗体抑制癌基因的产物杀灭肿瘤细胞。 人基因治疗研究和制剂质量控制技术指导原则 一、引言 基因治疗是指改变细胞遗传物质为基础的医学治疗。目前仅限于体细胞。 基因治疗的技术和方式日趋多样性。按基因导入的形式，分为体外基因导入（exvivo）及体内基因导入（invivo）两种形式。前者是在体外将基因导入人细胞，然后将该细胞注入人体。其制品形式是外源基因转化的细胞，适合在具有专门技术人才和GMP条件的医疗单位进行。后者则是将基因通过适当的导入系统直接导入人体，包括病毒的与非病毒的方法。其制品形式是基因工程技术改造的病毒或者是重组DNA、或者是DNA复（混）合物。基因治疗制剂种类较多，因此，本指导原则不可能用一个模式来概括，只能提出一个共同的原则，具体的方案应根据这些原则，确定研究技术路线。其基本原则：一是必须确保安全与有效，要充分估计可能遇到的风险，并提出相应的质控要求；二是要促进基因治疗的研究，并加强创新。对一些新的治疗技术路线的相应质控要求，可有一定的灵活性，应注意到基因治疗本身的特点以及它与经典的化学合成药物或基因工程药物的差别。目前，一些基因治疗研究相对比较成熟，而一些则不够完善，更加要求研究者在使用该技术指导原则时不可生搬硬套。为此，研究者应加强咨询和论证，提出一个科学可行的研究方案，最终获得确保安全有效的基因治疗制品。 在向国家药品监督管理局申报临床试验时，除须按本指导原则中"研究内容和制品质量控制"准备材料外，同时需提供下述材料： （1）国内外研究现状和进展（综述）。包括： 1．所用基因的研究现状和进展； 2．所用载体的研究现状和进展； 3．所用基因导入系统和方法的研究现状和进展； 4．该研究或制品相关的体外有效性实验资料； 5．该研究或制品相关的动物试验安全性和有效性资料； 6．该研究或制品相关的临床试验安全性和有效性资料； 7．该研究或制品的生产工艺现状； 8．该研究或制品的质量控制现状； 科技日报/2008年/12月/24日/第004版 科技改变生活 未来30年,基因治疗能否广泛应用？ 实习生梁鑫刘飞 未来，当一个婴儿刚刚出生，人们就能预知他的将来可能会得什么病，这要归功于基因诊断和治疗。这个新技术的实现需要等待多少年？有专家预测，2030年生物医疗与基因改良竞赛将出现。请关注——未来30年，基因治疗能否广泛应用？ 编者按：就像我们30年前无法想象今天的生活一样，未来的30年，我们的生活又将变成什么样呢？最近美国《未来学家》杂志对未来世界的发展提出了预测：也许到了2030年，汽车时代将结束、每个人将拥有独一无二的IP地址、城市化程度将达到60%、生物医疗与基因改良竞赛将出现……未来30年的世界真是这样的吗？本版从今日起推出系列报道，与国内有关专家共话未来。 美国《未来学家》杂志近日对世界未来发展提出预测：像上个世纪的太空竞赛那样，2030年将出现生物医疗与基因改良竞赛。而IBM公司最新公布的“未来5年的5项创新”计划则指出：未来5年，你将拥有一张基于你的DNA基因图。医生为您预测健康风险、提出治疗建议，医药公司的“对人制药”都将成为可能。 医药研制真能实现个性化吗？未来30年，我们能否用基因去治病？ 基因治疗：个人的“医药工厂” 随着生命科学与技术的发展、人们对疾病的认识不断加深，越来越多的证据表明许多疾病与人体遗传基因的结构或功能改变有关。因而，人类开始从基因方面治疗疾病。 “简单地说，基因治疗是指在人体内开一个‘医药工厂’，将特定基因作为‘药物’输送到患者体内，用以治疗疾病的一种分子治疗技术。”上海复旦大学生命科学学院遗传学研究所卢大儒教授说。中国科学院北京基因组研究所中心实验室主任胡松年解释说：“通俗地说，基因治疗跟人们吃药原理相似。例如，一个人可能由于遗传因素或者是基因突变等原因，患上某种疾病。而利用基因治疗就可以对致病基因进行替换或补充，使基因恢复正常，从而预防或治疗人类疾病。基因治疗的实现需要依靠大量的人类基因组数据研究，并对其进行信息解析。” 卢大儒认为，基因治疗与常规治疗的区别在于：“一般常规治疗方法针对的是因基因异常而导致的各种症状，而基因治疗针对的是疾病根源异常的基因本身。因此，基因治疗能从根本上治愈一些现有的常规疗法所不能解决的疾病，譬如：遗传病（如血友病、囊性纤维病、家庭性高胆固醇血症等）、恶性肿瘤、心血管疾病、感染性疾病（如艾滋病等）。” 基因治疗可以实现有效的个性化治疗吗？胡松年说：“利用基因技术可以找到个体致病的靶点，针对不同的靶点采用不同的药物，从而达到真正精准的治疗，使疾病治疗向个体方向发展。” 据了解，IBM的研究人员正在开发一种系统，可以为医生提供相关的工具，帮助其预测艾滋病患者对防逆转录酶病毒疗法的反应，从而帮助医生针对任何艾滋病病毒的基因突变选择最好的药物或药物组合。“这是一种预测防逆转录酶病毒疗法对某一种特殊的艾滋病病毒治疗效果的创新方法，这种方法利用了滤过性病毒基因的数据，并整合了欧洲最大的艾滋病数据库的一些治疗反应数据。”IBM中国研究院院长李实恭表示。 基因治疗：将会提高治愈率 复旦大学生命科学学院遗传学研究所副教授朱焕章博士指出：“若要使基因治疗技术成为临床的一个常规治疗手段，乐观估计可能需要20—30年时间。” “在未来，利用基因治疗，人类疾病的治愈率将会提高，人们的身体素质会越来越好，人类 基因治疗在疾病防治中的应用 120311102 张宇鑫 [摘要] 传染病是目前人类所面临的一类重大疾病，在某些疾病状态下，人类还未寻找到理想的治疗方法，如病毒感染等。现代基因治疗是一种应用基因工程技术和分子遗传学原理，对人类疾病进行治疗的新疗法。主要是指对致病基因的修正和基因增强及采用外源性细胞因子基因、核酶、基因药物进行疾病治疗的方法。经过多年的发展，技术逐步走向成熟，在传染性疾病的防治中显示了重大的临床应用前景。传染性疾病的基因治疗包括：基因疫苗、RNA干扰、反义技术、药物靶向治疗等。 [关键词] 基因疫苗反义技术药物靶向治疗 一、现状 1.1我国传染病预防现状 21世纪人类依然面临着传染病的挑战，就全球而言，艾滋病是当前首恶，由于其病毒极易发生变异，所以到目前为止疫苗仍在试验阶段，缺乏理想的特效药物，免疫损伤治疗难度大。我国2003年比2002年发病率上升44．39%，人类免疫缺陷病毒检出率提高了55％。并且防治工作面临来自传统传染病和新发传染病的双重压力：传统传染病威胁持续存在，新发传染病不断出现。近10年来，我国几乎每一两年就有1种新发传染病出现，许多新发传染病起病急，早期发现及诊断较为困难，缺乏特异性防治手段，早期病死率较高。其次，人口大规模流动增加了防治难度，预防接种等防控措施难于落实。三是环境和生产生活方式的变化增加了传染病防治工作的复杂性。一些地区令人堪忧的城乡环境卫生状况，以及传统的生产生活方式，使一些人畜共患病持续发生。 1.2基因治疗研究的现状 (1) 复合免疫缺陷综合征的基因治疗 1991年美国批准了人类第一个对遗传病进行体细胞基因治疗的方案，即将腺苷脱氨酶（ADA）采用反转录病毒介导的间接法导入一个4岁患有严重复合免疫缺陷综合征（SCID）的女孩，大约1－2月治疗一次，8个月后，患儿体内ADA水平达到正常值的25%，未见明显副作用。此后又进行第2例治疗获得类似的效果。 (2)黑色素瘤的基因治疗 对肿瘤进行基因治疗是人们早已期望的事，在进行了多方面探索的基础上，发现了肿瘤浸润淋巴细胞（即能在肿瘤部位持续存在而无副作用的一种淋巴细胞）在肿瘤治疗中的作用。于1992年实施了TNF/肿瘤细胞和IL－2/肿瘤细胞方案，即分别将IL－2基因肿瘤坏死细胞（TNF）基因导入取自患者自身并经培养的肿瘤细胞，再将这些培养后的肿瘤细胞注射至病人臀部，3周后切除注射部位与其引流的淋巴结，在适合条件下培养T细胞，将扩增的T细胞与IL－2合并用于病人，结果5名黑色素瘤病人中1名肿瘤完全消退，2名90%的肿瘤消退，另2人在治疗后9个月死亡。由于携有TNF的TIL可积于肿瘤处，因而TIL的应用提高了对肿瘤的杀伤作用。 577 中国肿瘤2001年第10卷第10期 安瑞生,陈晓峰 (中国科学院北京动物研究所,北京100080) Gene Thera py Techni q ue AN Rui sheng,C HEN Xiao feng 摘要:肿瘤基因治疗就是将一段特定的遗传信息物质DNA 或RN A 通过人工方法导入肿瘤细胞以治疗肿瘤性疾病。目前的 研究主要包括三个方面:肿瘤免疫基因治疗、反义RNA 、三链D NA 。其中研究较多的是肿瘤免疫基因治疗。本文主要对肿瘤免疫基因治疗的构建、接种、应用等方面做了综述,并简要介绍了反义RNA 和三链DNA 技术。 关键词:基因治疗;基因疫苗;DNA 疫苗;反义RNA;三链DN A;肿瘤中图分类号:R730.54文献标识码:B 文章编号:1004-0242(2001)10-0577-03 收稿日期:2001-08-22肿瘤免疫基因治疗就是将具有一定功能的外源基因导入人体细胞,以补充机体所缺乏的基因或纠正机体异常表达的基因。人类基因治疗的探索始于20世纪80年代初,目前已由动物实验向临床试验过渡。本文就肿瘤的基因治疗技术的现状综述如下。 1 肿瘤免疫基因治疗 1 1 载体的构建 获得合适的抗肿瘤编码基因并将它插入到载体DNA 上,是发展肿瘤基因治疗的一个主要工作。不言而喻,目的基因的选择至关重要。抗肿瘤基因可以是单个基因或具有协同保护功能的一组基因,也可以是编码抗肿瘤基因决定簇的一段核苷酸序列。但是,这都是建立在充分了解病原体基因的基础上的。表达文库免疫技术,提供了一种在各种已知或未知病原体基因组中获得目的基因的系统而普遍有效的方法。该技术根据病原体的所有抗原都由其DNA 编码这一基本原理,将病原体基因文库中的病原体DNA 片段插入特定的质粒中,利用基因免疫的方法筛选病原体基因组中具有免疫保护功能的基因片段。目前,基因表达文库免疫技术是发现目的基因的一种最系统、客观的手段。 质粒载体必须是能在大肠杆菌中高拷贝地扩增,而在动物细胞内则能高效表达,但不复制,也不含有向宿主细胞基因组内整合的序列。用于基因治疗的载体主要有质粒和病毒,病毒载体曾经被用作抗原基因载体[1],现在主要用质粒构建载体,由于细菌质粒本身没有很强的免疫原性,这对保证质粒在体内长期稳定地表达有重要意义[2]。 载体一般以PBR322或PUC 质粒为基本骨架,它们能在 大肠杆菌内扩增,但不能在哺乳动物细胞内复制 [3] 。通常使 用的质粒载体有PBR322、PUC18、PUC19、PUC118、PUC119等。常用的质粒载体启动子多为来源于病毒基因组的巨细胞病毒(CMV)早期启动子,具有很强的转录激活作用,带有细菌复制子(ORI),真核生物的启动子和PolyA 加尾信号。启动子大多来源于病毒基因组,如CMV 、PSV 、LTR 等,其中以CMV 的转录活性最高,PolyA 序列具有保证mRNA 在体内的稳定性的作用,这种稳定性因PolyA 来源不同而异,目前认为较好的PolyA 来自牛生长激素基因或兔B 球蛋白基因。另外,还可包含一些合适的增强子、终止子、内含子、免疫激活序列及多聚腺苷酸信号等。筛选载体可以选用卡那霉素、氨苄青霉素或新霉素等抗性基因。1.2 目的基因的导入 主要途径包括间接体内法和直接体内法。间接体内法是指在体外用基因转染肿瘤细胞,然后将经转染的肿瘤细胞输入病体内,最终给予病体的疗效物质是基因修饰的细胞[4]。直接体内法是指基因片段或完整基因直接注入体内进行治疗的办法。就直接体内法而言,目前使用的方法有以下几种: 裸DNA 直接注射,将裸质粒DNA 直接注射到机体的肌肉、皮内、皮下、粘膜、静脉内。这种方法简单易行。脂质体包裹DNA 直接注射,包裹DNA 的脂质体能与组织细胞发生膜融合,而将DNA 摄入,减少了核酸酶对DNA 的破坏。注射途径类似裸DNA 直接注射[5] 。金包被DNA 基因枪轰击法,将质粒DNA 包被在金微粒子表面,用基因枪使包被DNA 的金微粒子高速穿入组织细胞。繁殖缺陷细菌携带质粒DNA 法,选择一种容易进入某组织器官的细菌,将其繁殖基因去掉,然后用质粒DNA 转化细菌,当这些细菌进入某组织器官后,由于能繁殖,则自身裂解而释放出质粒DNA [6]。经改造的mRNA 法,将目的基因的mRNA 结构进行重组后直接送入体内。 肿瘤基因治疗技术 专 题报道 第二十三章基因治疗——复习测试题 （一）选择题 A型题 1. 全世界第一例基因治疗成功的疾病是 A. β地中海贫血 B. 血友病 C. 重症联合免疫缺陷症 D. 高胆固醇血症 E. 糖尿病 2. 理论上讲，基因治疗最理想的策略是 A. 基因置换 B. 基因替代 C. 基因失活 D. 免疫调节 E. 导入“自杀基因” 3. 目前基因治疗所采用的方法中，最常用的是 A. 基因置换 B. 基因替代 C. 基因失活 D. 免疫调节 E. 导入“自杀基因” 4. 利用反义核酸阻断基因异常表达的基因治疗方法是 A. 基因置换 B. 基因替代 C. 基因矫正 D. 基因失活 E. 免疫调节 5. 将白细胞介素-2基因导入肿瘤病人体内，提高病人IL-2的表达水平，进行抗 肿瘤辅助治疗。这种基因治疗方法是 A. 基因置换 B. 基因替代 C. 基因矫正 D. 基因失活 E. 免疫调节 6. 下列哪种方法不是目前基因治疗所采用的方法 A. 基因缺失 B. 基因置换 C. 基因替代 D. 基因失活 E. 免疫调节 7. 基因治疗的基本程序中不包括 A. 选择治疗基因 B. 选择载体 C. 选择靶细胞 D. 将载体直接注射体内 E. 将治疗基因导入靶细胞 8. 下列哪种方法不属于非病毒介导基因转移的物理方法 A. 电穿孔法 B. 脂质体法 C. DNA直接注射法 D. 显微注射法 E. 基因枪技术 9. 下列哪种方法属于非病毒介导基因转移的化学方法 A. 电穿孔法 B. 基因枪技术 C. DNA直接注射法 D. 显微注射 E. DEAE-葡聚糖法 10. 将外源治疗性基因导入哺乳动物细胞的方法不包括 A. 显微注射法 B. 电穿孔法 C. 脂质体法 D. CaCl2法 E. 病毒介导的基因转移 11. 目前在基因治疗的临床实施中，最常使用的载体是 A. 逆转录病毒载体 B. pBR322 C. λ噬菌体 D. pUC18 E. YAC 基因治疗 【摘要】研究发现，以基因为基础，从疾病和健康的角度考虑，人类疾病大多直接或间接地与基因相关，故有“基因病”概念产生。根据这一概念，人类疾病大致可分为三类：单基因病、多基因病和获得性基因病。随着现代生物科学的发展，基因工程已在多个领域得到广泛应用。基因治疗是利用基因工程技术向有功能缺陷的人体细胞补充相应功能基因，以纠正或补偿其疾病缺陷，从而达到治疗疾病的目的。基因治疗作为治疗疾病的一种新手段，已经在肿瘤、感染性疾病、心血管疾病和艾滋病等疾病的治疗方面取得进展。它在一定程度上改变了人类疾病治疗的历史进程，被称为人类医疗史上的第四次革命。本文就基因治疗的载体以及基因治疗在肿瘤、艾滋病治疗方面取得的成就作出介绍，并就基因治疗的现状和问题对基因治疗的未来作出展望。 【关键词】基因治疗、载体、肿瘤、p53、IAP、艾滋病、CCR5 【正文】 一、基因治疗背景及概念 1990年9月，美国政府批准实施世界上第一例基因治疗临床方案，对一名患有重度联合免疫缺陷症（SCID）的女童进行基因治疗并获得成功，从而开创了医学的新纪元。自此以来，基因治疗已从单基因疾病扩大到多基因疾病，从遗传性疾病扩大到获得性疾病，给人类的医疗事业带来革命性变革。 基因治疗（gene therapy）是指通过一定的方式，将正常的功能基因或有治疗作用的DNA 序列导入人体靶细胞去纠正基因突变或表达失误产生的基因功能缺陷，从而达到治疗或缓和人类遗传性疾病的目的，它是治疗分子疾病最有效的手段之一。 基因治疗包括体细胞基因治疗和生殖细胞基因治疗。但由于用生殖细胞进行治疗会产生伦理道德问题，因此通常采用体细胞作为靶细胞。其基本内容包括基因诊断、基因分离、载体构建和基因转移四项。根据功能及作用方式，用于基因治疗的基因可分为三大类：（1）正常基因：可通过同源重组方式置换病变基因或依靠其表达产物弥补病变基因的功能，常用于矫正各种基因缺陷型的遗传病；（2）反义基因：通过其与病毒激活因子编码基因互补，或与肿瘤mRNA互补，从而阻断其表达，常用于治疗病毒感染或肿瘤疾病；（3）自杀基因：能将无毒的细胞代谢产物转变为有毒的化合物，用于治疗癌症。 二、基因治疗载体 基因治疗的困难与前景 基因治疗是利用遗传学的原理治疗人类疾病的新手段，传统意义上的基因治疗是指目的基因导入靶细胞后与宿主细胞的基因发生基因重组，成为宿主细胞的一部分，从而可以稳定地遗传下去，并达到疾病治疗的目的。 目前，基因治疗主要的策略有4种。基因置换是利用正常的基因整个地替换突变基因，使突变基因永久地得到更正。基因修正是将突变基因的突变碱基序列用正常的序列加以纠正，而其余未突变的正常部分予以保留。相比前面两种策略，基因修饰则是间接利用目的基因的表达产物来改变宿主细胞的功能。而基因失活是利用反义技术来封闭某些基因的表达，以达到抑制有害基因表达的目的。就技术方面而言，基因置换是最常用的策略之一。 基因治疗的发展和实施，要依赖于相关的技术和研究。其中最为重要的是人类基因组计划（HGP）和基因工程技术。美国国会于1990年批准了这一项目，并决定从1990年10月1日组织实施。计划耗资30亿美金，历时15年完成。这个浩大繁杂的计划成为了国际合作项目。美国，英国，日本，法国，德国和中国6个国家相继加入到计划中。HGP最终任务是要破译人体遗传物质DNA分子所携带的所有的遗传信息。HGP的实施，使人们对自身基因的认识达到一个质的飞跃。使人们进一步认识各种基因的生物学 功能以及与遗传病之间的关联，认识遗传病的分子缺陷的基础知识，为遗传病的基因治疗奠定基础。 HGP为基因治疗提供了基础知识，而真正的成功操作则要依赖基因工程技术。其中最重要的是基因治疗的载体构建。病毒载体是常用的载体之一。如：逆转录病毒载体，腺病毒载体等。而非病毒载体主要为显微注射法和电穿孔DNA转移法。 从1967年Nirenbery提出基因治疗实施。在1990年9月，美国FDA批准了人类首例基因治疗，针对于SCID的病例的基因治疗研究。同年9月14日第一位基因治疗的患者被成功回输带有矫正基因的T细胞。 基因治疗的基础研究虽然已经有近半个世纪，但基因治疗的成功案例并不多，所涉及的疾病领域也不广。其中的问题还存在很多。其中伦理问题和技术安全问题是最受关注的。 对生殖细胞的操作有不可预知性，有可能使后代产生缺陷。就目前的技术还不能做到避免外源基因的插入引起的生殖细胞的基因突变。这种改变是否符合我们后代的最佳利益。这就提出了一个新的伦理问题。我们是否有权这样做。我们对后代的责任是什么。基因治疗还面临着很大的社会风险，通过遗传筛查可以不让可能患遗传病的人出生，以此来预防遗传病。这会鼓励强迫性的优生规划和对 2020年中国细胞和基因疗法市场分析报告 简介:全球范围内，细胞和基因疗法（CGT）不仅改变了人类治疗遗传疾病和疑难杂症的方式，同时也正在颠覆整个制药生态圈。至2019年底，全球共推出超过27种CGT产品，约990家公司从事下一代疗法研发和商业化，全球CGT市场规模有望在2025年超过119.6亿美元。 对于志在赢占中国细胞和基因疗法市场的国内外企业，必须采用独特的商业模式解决这些本土问题在强有力的政策支持下，中国已经成为全球CGT 发展的沃土，2017年至2019 年期间共有 1,000 多项临床试验已经开展或正在进行，中国政府授予数千项相关专利，位居全球第二。45 家本土企业以及四家合资公司引领中国CGT 生物技术行业蓬勃发展，并拥有获批的CGT 新药临床试验申请（IND）。 尽管CGT行业繁荣发展，但外商投资监管、报销时间的不确定性、技术和知识产权本土化要求、医疗服务机构的能力差异等中国CGT生态圈的多个环节，均为CGT产品的顺利商业化带来重大挑战。对于志在赢占中国细胞和基因疗法市场的国内外企业，必须采用独特的商业模式解决这些本土问题，并且需要围绕市场准入、监管、产品组合与知识产权、以及商业化能力建立卓越发展框架，制定相应战略并衡量成效。此外，这些企业还应考虑如 何有效获取日益丰富的本土创新技术，培养专业能力，依托生态圈合作在全球开发此类知识产权。 本文将探究影响中国 CGT 行业的关键因素和主要趋势，助力投资者、企业和研究人员塑造不断创新且可持续发展的中国CGT行业，并且从中受益。 一、应对新冠疫情危机 随着全球新冠疫情危机继续蔓延，并将持续数月或更长时间，预计将为CGT行业带来如下影响： CGT基础生物医学研究相关的资金支持会继续增加。CGT不仅可能治疗甚至治愈非传染性的疑难杂症，例如遗传疾病或晚期肿瘤，也有可能通过恢复人体的自然免疫力防治新型传染病。例如，一家致力于为遭受威胁生命的病毒性疾病患者开发细胞疗法的波士顿公司AlloVir近期宣布，和美国贝勒医学院合作开发针对新冠病毒的异体T 细胞疗法。 在中国推动CGT产品商业化的企业将面临更多不确定性。正在开展或计划中的临床研究可能会被中断，与国家药品审评中心的沟通和监管审批或将推迟，涉及CGT生产原材料进出口的供应链可能受到影响，而且市场准入相关事宜也将延期。 企业需要重新调整其产品发布时间安排，基于对监管审批流程、供应链应对能力和目标医院在降低新冠病毒影 基因治疗 摘要： 生物技术在生命科学领域扮演者重要的角色，基因治疗在治疗方面，将新的遗传物质转移到某个个体的体细胞内使其获得治疗效果；在基因工程方面，将正常的有功能的基因置换或增补缺陷基因。近些年来，已对若干人类单基因遗传病和肿瘤开展了临床的基因治疗。基因治疗作为治疗疾病的一种新手段，正愈来愈受到人们的重视和关注。 关键词：基因工程基因治疗基因 一、基因治疗的历史 随着DNA双螺旋结构的发现和以DNA重组技术为代表的现代分子生物学技术的发展以及人类对疾病认识的不断深入，越来越多的证据证明，多种疾病与基因的结构或功能改变有关，因而萌生了从基因水平治疗疾病的念头和梦想。 早在1968年，美国科学家发表了“改变基因缺损：医疗美好前景”的文章，首次在医学界提出了基因疗法的概念。1989年美国批准了世界上第一个基因治疗临床试验方案。1990年美国NIH的Frenuch Anderson博士开始了世界上第一个基因治疗临床试验，用腺苷酸脱氨酶基因治疗了一位ADA基因缺陷导致的严重免疫缺损的四岁女孩，并获得成功[1]。 1994年美国科学家利用经过修饰的腺病毒为载体，成功地将治疗遗传性囊性纤维化病的正常基因cfdr 转入患者肺组织中。2000年，法国巴黎内克尔儿童医院利用基因治疗，使数名有免疫缺陷的婴儿恢复了正常的免疫功能，取得了基因治疗开展近十年最大的成功[2]。 2004年1月，深圳赛百诺基因技术有限公司将世界第一个基因治疗产品重组人p53抗癌注射液正式推向市场，这是全球基因治疗产业化发展的里程碑[3]。迄今报道已有数千例基因治疗患者，病种主要是恶性肿瘤、艾滋病、血友病B、病毒性肝炎等等。 二、基因治疗的概念 基因治疗是指向有功能缺陷的细胞补充相应的基因，以纠正或补偿其基因缺陷，从而达到治疗的目的。 广义的说，基因治疗就是应用基因或基因产物治疗疾病的一种方法。狭义的说，基因治疗是把外界的正常基因或治疗基因，通过载体转移到人体的靶细胞，进行基因修饰和表达，治疗疾病的一种手段。 基因治疗的研究现状以及应用前景分析 摘要： 基因治疗是一种通过基因水平的操作而达到治疗或预防的高新技 术。可治疗包括遗传性疾病、癌症、感染性疾病、心血管疾病和自身 免疫性疾病在内的多种疾病。近几年来基因治疗在全球范围内虽然取 得了快速发展，但也遇到了很多技术、伦理以及法律问题。未来基因 治疗的主要目 标是在法律和伦理要求范围内，开发更加安全高效的基因导入系统， 更好的服务于人类。本文主要论述了基因治疗的研究现状，并在此基 础上分析了其应用前景。 关键词：基因治疗，研究现状，应用前景 Abstract： ?Gene therapy is a new technology by which people can cute and prevent many diseases at the level of genes, such as,genetic disease,infectional disease,cardiovascular disease and autoimmune disease.At the past years , gene therapy has been developed all around the world , however , it has also come across some probloms , including technology ,laws and ethics. At the future , the main aim of gene therapy is to develop more safe and efficient gene delivery system within the limits of laws and ethics .The research status and application prospect of gene therapy are discussed in this paper.2020年细胞和基因治疗CDMO行业研究报告
2020年细胞和基因治疗CDMO行业调查报告
肿瘤基因治疗的最新进展
基因治疗的发展及其应用
人基因治疗研究和制剂质量控制技术指导原则
未来30年_基因治疗能否广泛应用_
基因治疗在疾病防治中的应用
肿瘤基因治疗技术
第二十三章 基因治疗——复习测试题
基因治疗
基因治疗的困难与前景
2020年中国细胞和基因疗法市场分析报告
基因工程之基因治疗
基因治疗的研究现状以及应用前景分析