临床应用型人脐血间充质干细胞分离培养与鉴定

解剖科学进展　Progress of Anatomical Sciences　2010 Jul,16(4):327~330

临床应用型人脐血间充质干细胞分离培养与鉴定

11，21，2111，2*

肖　娟，陈　琳，王洪美，李　莹，任玉水，黄红云（1. 北京市虹天济神经科学研究院；2. 北京康复中心神经外科， 北京 100144）

【收稿日期】*通讯作者（To whom correspondence should be addressed）

2009-12-03

【基金项目】国家自然科学基金资助项目（No.30971527），北京 市优秀人才培养资助基金（No.20081D1101000337）【摘要】　目的　探讨能够达到临床细胞治疗标准的人脐血间充质干细胞的体外培养与纯化方法。方法 以15%FBS/DMEM作为培养基，采用淋巴细胞分离液间接分离法，分离MSCs，以贴壁培养法进行原代培养和纯化。倒置显微镜下观察生长状态和形态学变化，共聚焦显微镜下观察细胞表面抗原CD34，CD44免疫组化染色的鉴定。结果　细胞计数显示人脐血间充质干细胞产品的细胞成活率大于95%，其纯度大于85%，符合卫生部第三类医疗技术的有关标准。结论　脐带血内含MSCs，可在体外分离培养纯化增殖，获得大量相对纯化的MSCs，达到临床应用水平。

【关键词 】　人；脐血；间充质干细胞；细胞培养；免疫组化

【中图分类号】　Q592.1 【文献标识码】　A 【文章编号】　1006-2947（2010）04-0327-04

Culture and purification of mesenchymal stem cells of human cord blood

11,21,211,21,2*

XIAO Juan , CHEN Lin , WANG Hong-mei , LI Ying , REN Yu-shui HUANG Hong-yun （1. Beijing Hongtianji Neuroscience Academy; 2. Department of Neurosurgery, Beijing Rehabilitation Center, Beijing 100144 China , ）

【Abstract】　Objective　To explore a practical method of culture and purification of mesenchymal stem cells (MSCs) from human cord blood in vitro in order to satisfy the clinical application. Methods　The MSCs from human cord blood were cultured in 15% FBS/DMEM and separated indirectly by lymphocyte separating medium. The primary culture and purification were performed by adherent method. Growth condition and morphology change of MSCs were observed under the inverted microscope, and the cell surface antigen was identified by CD34 and CD44 immunohistochemistry and observed by laser scanning confocal microscope. Results　The obtained human MSCs showed CD44 positve and CD34 negative. The purity of human MSCs was more than 85% and about 95% of them were viable, which was in line with the standard of third category of national medical technology issued by Ministry of Health of China. Conclusion　The MSCs from human cord blood were separated, cultured and purified successfully, which meets the need of clinical treatment by MSCs transplantation.

【Key words】 human; cord blood; mesenchymal stem cells; cell culture; immunohistochemistry

细胞移植是治疗中枢神经系统疾病的重要手化能力强，免疫原性很弱，无伦理问题等诸多优[1-3][5，6]段，脐血间充质干细胞（mesenchymal stem cell，点。本研究探寻一种适合脐血MSCs的体外培养及MSC）是候选细胞之一。它来源于发育早期的中胚纯化方法，以达到临床治疗标准要求。层，具有全能干细胞的特点，自我更新能力强大， [4]1　材料与方法

多向分化潜能。脐血（umbilical cord blood，UCB）间充质干细胞是从脐带血中分离和培养的一种多潜 1.1 材料与设备

能成体干细胞，具有分泌神经营养因子，免疫调DMEM/F12（ GIBCO产品），胎牛血清（FCS，节，血管发生，向神经样细胞分化的潜能；与其他GIBCO产品），人淋巴细胞分离液（1.077g/ml，天来源的MSCs相比具有来源广泛，采集方便，增殖分

津TBD公司），甲基纤维素，肝素， 0.25%胰蛋白酶（Amresco 0458）， EDTA，终止液，青链霉素，多聚赖氨酸（Sigma），24孔培养板（Coring公司），双人双面超净台（北京东联哈尔 DL-CJ-2N）、低速

·328·解剖科学进展2010年第16卷第4期

离心机（KUBOTA 2420）、尼康倒置显微镜（TS 扫描。

100F）、CO培养箱（Thermo 3111）、荧光显微镜

2

2　结果

（Leica DMLB2）、尼康数码相机（COOLPIX

4500），激光共聚焦显微镜（ZEISS，德国）。

2.1 细胞形态学观察

1.2 脐血单个核细胞的分离方法

用含15%胎牛血清的DMEM/F12培养基，在多聚在无菌条件下取正常足月或剖腹产的脐血

赖氨酸包被过的聚乙烯培养瓶中培养单个细胞，初30ml，肝素抗凝。所得脐血与PBS按1：1混匀，再与

次接种细胞呈悬浮状态，细胞小而圆，24h后开始有5g/L的甲基纤维素按4：1混匀，静止30min后，分2

细胞贴壁，3d后细胞呈圆形，椭圆形，纺锤，逗号层，红细胞在下面，吸取上清离心（2000r/5min），

样或树枝状，然后细胞数目增多，有少量突起逐渐弃上清，用PBS制成单个细胞悬液，叠加到相对密度

伸出，5-7d出现大量的贴壁细胞以间充质细胞为1.077的淋巴细胞分离液上，进行梯度离心（2500r/

主，同时有大量破骨样细胞混杂，破骨样细胞镜下20min），然后缓慢吸出界面层白色豆渣状的细胞悬

圆形，胞体较大，多核。此时贴壁的MSCs最初散在液层，加PBS制成单个细胞悬液，离心，洗涤2次，

8分布，有少量聚集存在，形态呈梭形或多角形，单个调整密度1.0×10/ml 。

核，胞浆比较大，有较长的突起，折光性强（图1）。

1.3 细胞培养及纯化

15d细胞数目大量增多，成较均一的长梭形细胞将细胞悬液以DMEM/F12（含15%FBS）按1.0×

82突起明显，类似于成纤维细胞，其他形状的细胞明10个/ml的密度接种到多聚赖氨酸包被的25 cm培养

显减少。21d细胞达90%融合时，多为平行生长或成瓶中，置于37℃、5%CO饱和湿度培养箱内培养，

2

漩涡状，形状均一长梭形（图2）。传代后24h内完3天，更换培养基，去掉未贴壁的细胞，根据细胞生

全贴壁，7～10d完全融合，传至第3 代后，破骨样细长状况，每3天半量换液一次。待细胞生长到90%融

胞逐渐被去除，剩下的形态均一，宽大扁平的细合时以0.25%胰蛋白酶消化，加EDTA，按1：2比例

胞，即为脐血间充质干细胞。

传代接种培养，直到贴壁细胞长满瓶底重复以上操

2.2 免疫组化结果

作。

荧光显微镜下可见均强烈表达CD44，不表达1.4 细胞活力检测

CD34。表达CD44的细胞比率达85%。表明脐血MSCs 细胞悬液培养及传代前计数细胞存活率。制备

6表达间充质细胞表面抗原而不表达造血细胞、祖细单个细胞悬液，稀释成10个/ml。将90μl的细胞悬液

胞及内皮细胞表面抗原（图3）。这与骨髓来源的和10μl的0.4%台盼蓝溶液充分混匀并静止0.5min，

MSCs免疫组化结果一致。

微量加样器抽取10μl混合液，沿计数板边缘加样。

2.3 细胞活力的测定

200倍显微镜下随机选择9个视野，分别记录活细胞

细胞经台盘兰染色后，普通显微镜下可见活细（未染色）和死细胞（染成淡蓝色）数目，计数在

胞胞质和胞核透亮，而死细胞胞核蓝染。在镜下分3min内完成。根据公式求MSCs细胞活力，即活细胞

别计数活细胞数和细胞总数，分离脐血MSCs悬液活总数/（活细胞总数+死细胞总数）×100%。应用

性率为（95.60±1.5）％，见表1。

SPSS13.0软件计算脐血间充质干细胞阳性率，相关

数据用x+s表示。

3　讨论

1.5 脐血间充质干细胞的表面标志的鉴定

将4%的多聚甲醛固定的细胞片置于湿盒中，

间充质干细胞移植治疗发挥作用的主要作用机PBS清洗3次，每次5min。10%的山羊血清封闭30

制包括分泌营养支持因子，免疫调节，促进血管发min。将封闭液稀释的一抗（CD44 1:10，CD34 1:

[7-9]

生，增殖分化成神经样细胞，细胞替代等。 骨髓200）滴加到封闭好的细胞上，室温下1h后，用

来源的间充质细胞是临床最早用于治疗的本类细PBS清洗3次，每次5min。以此加入荧光二抗，室温

胞，但存在取材对机体可造成一定损伤，随年龄增下静置30min，核染后封片。共聚焦显微镜下观察并

field of vision living cell/cell total viability rate（％）

1

232/239

97.07

2

201/211

95.26

3

186/192

96.87

4

215/220

97.72

5

197/210

93.80

6

247/256

96.48.

7

224/240

93.33

8

201/211

95.26

9

195/206

94.66

Table 1. The viability rate of MSCs

2010年第16卷第4期·329·

肖　娟临床应用型人脐血间充质干细胞分离培养与鉴定等　

Fig 1. Primary MSCs cultured for 7 days ×200Fig 2. Primary MSCs cultured for 21 days ×200

Fig 3. CD44 positive cells（A ×200）and CD34 negative cells(B ×200) and cell nucleus(C ) and combination of A and C(D)

加细胞活性下降，病毒感染率高，儿童和体弱人员离；（3）流式细胞仪分选法，根据MSCs细胞表面取材受限等不足之处。而脐血来源的MSCs来源广标志进行分选。脐血MSCs由于缺乏特异性鉴别标阔，其收集对于新生儿及产妇均无任何痛苦和不良记，不宜用流式、免疫磁珠等方法分离，目前以密作用，形态和生物学特性与骨髓源性MSCs基本相度梯度离心法贴壁培养分离脐血MSCs的方法简便易似，脐血免疫系统的原始性，降低了移植后排斥反行。

应，目前认为可作为替代细胞。

本实验采用5%甲基纤维素结合Ficoll分离方法提有关脐血间充质细胞的培养方法有多种，1982 高了脐血MSCs成功培养率，对其进行免疫组化研究[10]结果证实了脐血中含有MSCs，免疫组化结果显示表年Fridenshtein等发现并建立了以贴壁培养为主要手达CD44的细胞比率可维持在85%以上。我们体会：段的分离扩增方法。目前用于初筛分离脐血的方法（1）分离获得单个细胞的数量对脐血MSCs培养成主要有3种：（1）直接贴壁法，根据MSCs易于贴附功有很大的影响，甲基纤维素沉降红细胞的时间塑料培养瓶壁的生长特性进行筛选；（2）密度梯度30~50min，应以清晰的分层为准，Ficoll分离液进行

离心法，根据MSCs和其它细胞的密度不同进行分

·330·解剖科学进展2010年第16卷第4期

into injured spinal cord injury[J]. Chin Med J (Engl), 2003, 116(10): 单个核细胞分离，应尽量完全吸出单个核细胞层，

1488-1491.

避免细胞的损失。（2）单个核细胞接种密度要足够

[2] 陈琳, 黄红云, 王洪美, 等. 嗅鞘细胞移植改善橄榄体桥脑小脑萎

8

高，过高或过低都直接影响细胞生长，以1.0×10/ml 缩患者神经功能: 1例报告[J]. 中国临床康复, 2006, 10(29): 24-25.密度接种细胞较早贴壁，首次换液培养后第3天去除[3] 黄红云, 陈琳, 郗海涛, 等. 嗅鞘细胞移植治疗中枢神经系统疾病

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intracoronary transplantation of autologous bone marrow 形态类似成纤维细胞为间充质细胞。随着细胞迅速mesenchymal stem cell inpatients with acute myocardial infarction[J].

增殖，3周左右细胞达90%融合时，多为平行生长或Am J Cardiol, 2004, 94(1): 92- 95.

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对脐血MSCs培养成功很重要，血清浓度15%，培养

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血MSCs传代的时间应视细胞生长而定，首次传代为242.

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stem cells enhances axonal outgrowth and cell survival in an

[11]

文献报道多采用定向分化的方法对其进行鉴定。

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如体积小，胞浆大，多为平行排列生长，呈长梭形

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表达CD34等标记物，亦能满足当前临床使用质控要

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（上接第326页）

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