拟南芥中一个未知功能蛋白的叶绿体亚细胞定位研究
植物学通报 2006, 23 (3): 249￣254收稿日期: 2005-12-20; 接受日期: 2006-03-07
基金项目: 科技部重大基础研究前期研究专项(973预研) (2003CCA01100)* 通讯作者 Author for correspondence. E-mail: znyang@https://www.360docs.net/doc/828190043.html,
．研究报告．
拟南芥中一个未知功能蛋白的叶绿体亚细胞定位研究
王鹏程１ 王晨１ 米华玲２ 周根余１ 杨仲南１＊
(1上海师范大学生命与环境科学学院 上海 200234)(2中国科学院上海植物生理生态研究所 上海 200032)
摘要 生物信息学分析表明, 模式植物拟南芥叶绿体中含有大约4 000多种蛋白质, 目前只分离得到1 000多种, 其他预测的叶绿体蛋白的实验验证对叶绿体功能研究有重要意义。本文对一个预测的叶绿体未知功能蛋白AT5G48790进行了亚细胞定位研究。我们克隆了该基因5'端长178 bp 的DNA 片段, 与绿色荧光蛋白(GFP)基因构建重组载体pMON530-cTP-GFP 。转基因植株通过激光共聚焦显微镜观察, GFP 只在叶绿体中特异表达。实验结果表明, AT5G48790的确为叶绿体蛋白。本实验方法也可用于其他预测的蛋白质的实验验证。
关键词 融合蛋白, 亚细胞定位, 转运肽
Study of Subcellular Localization of the Expressed Protein in
Arabidopsis thaliana
Pengcheng Wang 1, Chen Wang 1, Hualing Mi 2, Genyu Zhou 1, Zhongnan Yang 1*
1
(College of Life and Envionment Science, Shanghai Normal University , Shanghai 200234)
2
(Shanghai Institute Plant Physiology and Ecology , Chinese Academy of Sciences , Shanghai, 200032)
Abstract Bioinformatics analysis has revealed about 4 000 proteins in chloroplasts; however, only about 1 000 proteins have been validated. Thus, we established an experimental system to verify predicted chloroplast proteins. At5g48790 was predicted to be an Arabidopsis chloroplast protein.The 178 bp segment of the 5' sequence of this gene was cloned and fused with GFP to construct a binary vector pMON530-cTP-GFP for genetic transformation. On confocal laser-scanning microscopy,green fluorescent signals were localized in chloroplasts in transgenic Arabidopsis plants. The results suggest that At5g48790 encodes a chloroplast protein. This experiment can also be used to investi-gate other proteins predicted to be located in chloroplasts in Arabidopsis ．Key words fusion protein, subcellular localization, transit peptide
叶绿体是高等植物以及藻类中的一类重要的细胞器, 由叶绿体膜、类囊体和基质3部分构成, 其主要功能是进行光合作用, 另外还参与氨基酸、脂肪酸的生物合成(Motohashi et al.,2001)。在拟南芥中, 叶绿体蛋白质绝大部分由
核基因组编码在细胞质中合成, 叶绿体基因组编码87个蛋白(Abdallah et al., 2000)。拟南芥基因组序列分析表明, 14%左右的核基因编码的产物定位在叶绿体中(Abdallah et al., 2000)。进一步的生物信息学分析表明, 拟南芥中4 255个
25023(3)
核基因组编码的蛋白质为叶绿体蛋白(Friso et al., 2004), 其中25%蛋白质的功能尚不明确。
近年来, 亚细胞蛋白质组学的兴起为阐明细胞器的组成、蛋白质的功能提供了强有力的方法。Peltier等(2000)利用质谱和二维电泳,结合N-端Edman测序分析, 系统地分离出豌豆的61个内腔蛋白和类囊体外周蛋白。在模式植物拟南芥中, Peltier等(2002)又分离出81个内腔和类囊体周边蛋白, Kieselbach等(2000)利用蛋白质组学的方法对类囊体蛋白进行分析并确定了2个蛋白, Ferro等(2003)利用液相色谱技术分离出112个叶绿体膜蛋白, Schubert等(2002)则从类囊体腔中分离出36个蛋白, Friso等(2004)利用多种方法从类囊体膜蛋白质组中分离出154个蛋白质, Froehlich等(2003)利用改良的二维电泳分离出了叶绿体膜蛋白392个, Kleffmann等(2004)采用串联质谱技术(MS/MS)从拟南芥中分离出690个叶绿体蛋白。这些实验数据的积累, 为叶绿体蛋白质的亚细胞定位、功能注释和大规模的蛋白质分选提供了可能, 同时为优化叶绿体蛋白质的预测软件提供了基础。
绝大多数叶绿体蛋白的N端具有转运肽(chloroplast transit peptide, CTP)序列特征, 通过对细胞质中合成的蛋白质前体的N端进行序列分析, 可以预测出构成叶绿体蛋白质组的蛋白质。目前广泛应用的预测软件主要有SignalP、TargetP、LumenP、ChloroP和PSPORT等。叶绿体蛋白质的亚细胞定位实验已有报道, Mitsuda等(2001)以cDNA与sGFP构建融合蛋白用于研究AVP2基因在叶绿体中的定位, Motohashi等(2001)以APG2基因N端转运肽序列与sGFP构建融合蛋白研究其亚细胞定位。我们利用包含转运肽的基因组DNA序列建立了一套用于研究蛋白质在叶绿体中亚细胞定位的实验方法, 并成功得到了未知功能蛋白AT5G48790定位在叶绿体中的信息。１ 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 植物材料野生型拟南芥(Arabidopsis thaliana) Col-0, 由本实验室种植(培养室条件: 22℃, 16小时光照/8小时黑暗, 光通量密度110μmol.m－
2.s－1, 湿度约为30%)。
1.1.2 菌株和质粒大肠杆菌(Escherichia coli)DH5α菌株由本实验室提供, 农杆菌ASE菌株、含GFP基因的质粒pEGFP和植物双元表达载体pMON530由中国科学院上海植物生理生态研究所黄海研究员提供。
1.1.3 试剂各种酶和生化试剂分别购自上海生工、大连宝生物和Sigma等公司。
1.1.4 引物合成包含基因At5g48790 N端转运肽片段的引物5'端: ATG TCA CCG TCC TTC TCC;3'端 GTC CAT GGT ATT GTT GTT ATA CCC TC (下划线表示引入NcoⅠ位点); GFP内部引物序列为5'端: GTT GAA TTA GAT GGT GAT AAT; 3'端 ATA ACC TTC GGG CAT GGC ACT C。
1.2 方法
1.2.1 质粒提取、DNA片段克隆和重组质粒鉴定参照分子克隆实验指南(Sambrook and Russell, 2002)。
1.2.2 DNA片段回收采用BioDev公司回收试剂盒, 并按其说明书进行操作。
1.2.3 农杆菌介导拟南芥的转化参照浸花法(Clough and Bent, 1998)进行。
1.2.4 转基因T0代种子筛选种子用70%乙醇+0.01%Triton X-100混合液浸泡10分钟, 无菌水冲洗4次, 用Top agar(0.1%琼脂水溶液)均匀涂布在卡那霉素抗性(50 μg.mL?1)的PNS固体培养基上, 4℃春化2天后, 在培养室中培养。
1.2.5 转基因植株的PCR检测以筛选出来的T1代植株的总DNA为模板, 采用GFP引物进行PCR扩增。
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1.2.6 转基因植株的激光扫描共聚焦显微镜的观察用激光扫描共聚焦显微镜(LSM510 META, Zeiss)观察叶肉细胞中GFP的表达, 观察时物镜放大倍数为40倍, 激发光波长为488 nm,带通BP 505~530 nm, 长通LP 560 nm。
２ 结果
2.1 叶绿体亚细胞定位双元表达载体的构建
利用KpnⅠ和Eco RⅠ限制性内切酶消化质粒pEGFP, 获得包含GFP基因的750 bp片段, 将其插入到相同内切酶消化的质粒pMON530中,构建成用于叶绿体定位的双元载体pMON530-GFP(图1)。
2.2 At5g48790亚细胞定位表达载体的构建
通过TargetP(http://www.cbs.dtu.dk/ser-vices/TargetP)预测, 发现未知蛋白AT5G-48790N-端48aa具有转运肽结构。以Col-0基因组DNA为模板, PCR扩增一段包含转运肽的DNA序列, 长度为178 bp, 将其命名为cTP。cTP与pMD18-T vector 连接, 构建T-A克隆并经M13引物鉴定方向, 将正向插入克隆命名为cTP-T。cTP-T质粒经过KpnⅠ和Eco RⅠ双酶切与用相同酶切过的载体pMON530-GFP连接构建表达载体pMON530-cTP-GFP(图2)。2.3 转基因植株的获得
将质粒pMON530-GFP与pMON530-cTP-GFP分别导入农杆菌ASE, 采用农杆菌介导法转化拟南芥。T0代种子萌发经卡那霉素抗性筛选后, 分别得到T1代植株113棵(图3A)和42棵(图3B), 转化效率分别为0.5%和0.3%。经移栽后, 转基因植株表型正常。
2.4 外源基因整合及表达检测结果
2.4.1 目的基因PCR检测我们对筛选出来的T1代植株各取20株采用GFP内部引物进行分子检测。在转基因pMON530-cTP-GFP中, PCR检测结果全部呈阳性(图4给出部分结果);在转基因pMON530-GFP植株中, PCR检测19株为阳性, 转基因假阳性比率较低。
2.4.2 报告基因GFP表达我们对PCR检测出的阳性植株用激光共聚焦显微镜观察GFP的表达实验, 结果显示在488 nm的激发光下, 扣除野生型Col-0叶绿素自发绿色荧光背景(图6A~C), 在pMON530-GFP转基因植株中, 观察到绿色荧光在细胞质中呈弥散性分布(图6D~F);在pMON530-cTP-GFP转基因植株中, GFP
信号图1 叶绿体亚细胞定位双元载体pMON530-GFP
的构建
Fig. 1 Construction of the binary vector pMON530-
GFP
图2 双元表达载体pMON530-cTP-GFP的构建
Fig. 2 Construction of the binary vector pMON530-
cTP-GFP
M.λDNA/PstⅠ Marker; Line1?2. pMON530-cTP-
GFP/KpnⅠ+Eco RⅠ
25223(3)
与叶绿素自发荧光共定位在叶绿体中(图6G~I)。这些结果表明, GFP蛋白不含有信号肽序列就不会进入细胞器中, 基因At5g48790中的cTP具有转运肽的功能, 能将蛋白质定位在叶绿体中。
３ 讨论
蛋白质在细胞器中的定位对于明确其功能和参与的代谢途径有着非常重要的作用。虽然预测拟南芥中有4 000多种叶绿体蛋白, 但是得到实验验证的只有1 000多个。一方面, 仅核酮糖-1, 5-二磷酸羧化酶(ribulose-1, 5-biphosphate carboxylase, RuBPase)系统就占叶绿体可溶性蛋白质的50%~80%; 另一方面, 一些叶绿体蛋白质丰度特别低, 膜蛋白的分离也很困难, 因此很难用蛋白质组学方法进行验证。我们采用的实验方法是蛋白质组学等方法的有力补充, 载体构建过程简单, 所采用的报道基因采用GFP突变系EGFP(Phe-64 to Leu; Ser-65 to Thr), 荧光强度、发光效率更高, 是一种方便、经济的实验方法。
大规模进行蛋白质的亚细胞定位时, 可以在5'引物引入Kpn I位点, 转基因时也可以采用基因枪轰击烟草瞬间表达方法快速的获得亚细胞定位的信息。我们的实验是基于TargetP软件预测出基因具有N-端转运肽序列, 未预测出转运肽信息的蛋白质采用本实验方法时需要通过RT-PCR克隆cDNA与构建GFP融合蛋白。为进一步确定某蛋白质的亚细胞定位还需要分离亚细胞结构并制备蛋白质的抗体进行免疫印迹实验。此外, 对于具有导肽等信号肽的线粒体及其他亚细胞组成蛋白的定位也适用。
通过该实验,确定未知功能蛋白AT5G48790定位于叶绿体中, 为阐明该蛋白质生物学功能以及参与的生命活动过程奠定了基
图3 转基因T1代植株卡那霉素抗性筛选结果
A. 转入pMON530-cTP-GFP质粒;
B. 转入pMON530-GFP质粒
Fig. 3 Screening for transgenic plants (T1) on the KAN R selection medium. Arabidopsis seedlings transformed with pMON530-cTP-GFP(A) and pMON530-GFP(B)
图4 pMON530-cTP-GFP转基因植株PCR鉴定
Fig. 4 PCR analysis of the pMON530-cTP-GFP
transgenic plants
M. DL2000 Marker; Line 0. Wild type; Line 1. Plas-
mi d o f p E G F P;L i n e2?10.Transgenic plants
A B
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图5 转基因拟南芥细胞中荧光的观察
A～C. 野生型Col-0荧光观察; D～F. 转基因pMON530-GFP植株荧光观察; G～I. 转基因pMON530-cTP-GFP植株荧光观察; 其中, A、D和G为GFP绿色荧光, B、E和H为叶绿素自发荧光, C、F和I分别为叠加后的结果
Fig. 5 The fluorence detection in the transgenic Arabidopsis cells
A?C. Wild type Col-0 fluorescent detection; D?F. Transgenic plants pMON530 -GFP fluorescent detection; G, I. Transgenic plants pMON530-cTP-GFP fluorescent detection; A, D, G. Green fluorescence; B, E, H. Chloro-phyll autofluorescence; C, F, I. Overlapping
础, 其他分子生物学技术的应用包括RNA干涉对该基因的研究有可能深入揭示其编码的蛋白质在叶绿体及光合作用过程中的作用。
参考文献
Sambrook, J., and Russell, D. (黄培堂等译) (2002).分子克隆实验指南(第3版). (北京 : 科学出版社), pp.
27-30.
Abdallah, F., Salamini, F., and Leister, D. (2000).
A prediction of the size and evolutionary origin of the proteome of chloroplasts of Arabidopsis. Trends Plant Sci. 5, 141-142.
Clough, S.J., and Bent, A.F. (1998). Floral dip: A simplified method for Agrobacterium-mediated trans-
25423(3)
formation of Arabidopsis thaliana. Plant J. 16, 735-743.
Ferro, M., Salvi, D., Brugiere, S., Miras, S., Kowalski, S., Louwagie, M., Garin, J., Joyard, J., and Rolland, N. (2003). Proteomics of the chlo-roplast envelope membranes from Arabidopsis thaliana. Mol. Cell Proteomics 2, 325-345. Friso, G., Giacomelli, L., Ytterberg, A.J., Peltier, J.B., Rudella, A., Sun, Q., and Wijk, K.J. (2004). In-depth analysis of the thylakoid membrane proteome of Arabidopsis thaliana chloroplasts: New proteins, new functions, and a plastid proteome database. Plant Cell 16, 478-499.
Froehlich, J.E., Wilkerson, C.G., Ray, W.K., McAndrew, R.S., Osteryoung, K.W., Gage, D.
A., and Phinney,
B.S. (2003). Proteomic study of the Arabidopsis thaliana chloroplastic envelope membrane utilizing alternatives to traditional two-dimensional electrophoresis. J. Proteome Res. 2, 413-425.
Kieselbach, T., Bystedt, M., Hynds, P., Robinson, C., and Schroder, W.P. (2000). A peroxidase ho-mologue and novel plastocyanin located by proteomics to the Arabidopsis chloroplast thylakoid lumen. FEBS Lett. 480, 271-276.
Kleffmann, T., Russenberger, D., von Zychlinski, A., Christopher, W., Sjolander, K., Gruissem, W., and Baginsky, S. (2004). The Arabidopsis thaliana chloroplast proteome reveals pathway abun-dance and novel protein functions. Curr. Biol. 14,
354-362.
Mitsuda, N., Enami, K., Nakata, M., Takeyasu, K., and Sato, M.H. (2001). Novel type Arabidopsis thaliana H(+)-PPase is localized to the Golgi apparatus. FEBS Lett. 488, 29-33.
Motohashi, R., Nagata, N., Ito, T., Takahashi, S., Hobo, T., Yoshida, S., and Shinozaki, K. (2001). An essential role of a TatC homologue of a Delta pH-dependent protein transporter in thylakoid membrane formation during chloroplast development in Arabidopsis thaliana. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98, 10499-10504.
Peltier, J.B., Friso, G., Kalume, D.E., Roepstorff, P., Nilsson, F., Adamska, I., and van Wijk, K.J. (2000). Proteomics of the chloroplast: Systematic identification and targeting analysis of lumenal and peripheral thylakoid proteins. Plant Cell 12, 319-341.
Peltier, J.B., Emanuelsson, O., Kalume, D.E., Ytterberg, J., Friso, G., Rudella, A., Liberles, D.
A., Soderberg, L., Roepstorff, P., von Heijne, G., and van Wijk, K.J. (2002). Central functions of the lumenal and peripheral thylakoid proteome of Arabidopsis determined by experimentation and ge-nome-wide prediction. Plant Cell 14, 211-236. Schubert, M., Petersson, U.A., Haas,
B.J., Funk,
C., Schroder, W.P., and Kieselbach, T. (2002). P r o t e o m e m a p o f t h e c h l o r o p l a s t l u m e n o f Arabidopsis thaliana. J. Biol. Chem. 277, 8354-8365.
(责任编辑: 于昕)
蛋白质组学答案终稿
1，基因组：一个细胞或病毒所包含的全部基因。 2，蛋白质组(Proteome)的概念最先由Marc Wilkins提出。定义：蛋白质组是由一个细胞，一个组织或一个机体的基因组所表达的全部相应的蛋白质。是一个整体概念。 3，蛋白质组学：是一门以全面的蛋白质性质研究(如表达水平、转录修饰、相互作用等)为基础，在蛋白质水平对疾 病机理、细胞模式、功能联系等方面进行探索的科学，包括表达蛋白质组学，细胞谱蛋白质组学以 3，等电聚焦：分离两性分子，特别是分离蛋白质的一种技术。根据在一个电场的影响下这些两性分子在ph梯度上的分布情况进行分离 等电聚焦技术：在一个pH梯度和外加电场下，蛋白质有移向pH梯度中使其净电荷为零的点的倾向。（带正电荷移向阴极，带负电荷移向阳极）。IEF可以基于极微小的电荷差异而分离蛋白，具有高分辨率。4，负染就是用重金属盐（如磷钨酸、醋酸双氧铀）对铺展在载网上的样品进行染色；吸去染料，样品干燥后，样品凹陷处铺了一薄层重金属盐，而凸的出地方则没有染料沉积，从而出现负染效果（图2-15），分辨力可达1.5nm左右 5，质谱（又叫质谱法）是一种与光谱并列的谱学方法，通常意义上是指广泛应用于各个学科领域中通过制备、分离、检测气相离子来鉴定化合物的一种专门技术。 质谱分析是一种测量离子荷质比（电荷-质量比）的分析方法，其基本原理是使试样中各组分在离子源中发生电离，生成不同荷质比的带正电荷的离子，经加速电场的作用，形成离子束，进入质量分析器。在质量分析器中，再利用电场和磁场使发生相反的速度色散，将它们分别聚焦而得到质谱图，从而确定其质量。 7，分子离子峰：子受电子束轰击后失去一个电子而生成的离子M+成为分子离子。在质谱图中，由M+所形成的峰称为分子离子峰。 7.碎片离子峰当电子轰击的能量超过分子离子电离所需要的能量（50~70eV）时，可能使分子离子的化 学键进一步断裂，产生质量数较低的碎片，称为碎片离子。在质谱图上出现相应的峰，称为碎片离子峰。 碎片离子峰在质谱图上位于分子离子峰的左侧。研究最大丰度的离子断裂过程，能提供被分析化合物的结构信息。 8.软电离技术在质谱分析中，离子源是将分子离解成离子或解离成碎片，在这里分子失去电子， 生成带正电荷的分子离子。分子离子可进一步裂解，生成质量更小的碎片离子。由于离子化所需要的能量随分子不同差异很大，因此，对于不同的分子应选择不同的离解方法。通常称能给样品较大能量的电离方法为硬电离方法，而给样品较小能量的电离方法为软电离方法，后一种方法适用于易破裂或易电离的样品。 9.源内衰变技术（insource-decay，ISD）源内衰变发生在离子源区域内，时间为激光撞击之后几 百纳秒之内，是离子的“即可片段化”。这些片段离子通过衰减离子取出，能在线性飞行时间质谱中被发现，许多蛋白质和大的肽常在MOLDI-TOF-MS的离子源区域内变成肽离子片段。主要产生含N端的b型和含C端的y型片段离子，通过分析这些片段离子谱可鉴定蛋白质。 10.肽质量指纹图谱是指蛋白质被酶切位点专一的蛋白酶水解后得到的肽片段质量图谱。由于 每种蛋白质的氨基酸序列都不同，蛋白质被酶水解后，产生的肽片段序列也各不相同，其肽混合物质量数据也具特征性，这种特征就像指纹一样，所以称为指纹谱。肽质量指纹图谱可用于蛋白质的鉴定，用实验测得的PMF与蛋白数据库中的蛋白质理论PMF比对，就可以鉴定该蛋白质 肽序列标签是由一个多肽的部分氨基酸序列和该肽的质量以及该肽未测序部分的质量等组成。
蛋白质组学期末作业
蛋白质组学期末作业
1、一、常用的样品制备技术： 1、高丰度蛋白去除技术（抗体亲和法：通过抗原抗体反应原理，用针对样品中多种高丰度蛋白的单克隆或多克隆抗体来特异性去除样品中的高丰度蛋白；染料亲和法：通过高丰度蛋白与染料环结构之间复杂的静电、疏水及氢键相互作用去除样品中的高丰度蛋白，其特异性相对较低。） 2、自由流电泳技术（FFE）（FFE分离原理－IEF （等电聚焦）条件下：根据等电点的不同进行样品分离，主要用于分离蛋白质。ZE（区带电泳）条件下：根据样品表面电荷密度不同进行分离，主要用于分离细胞器。FFE的特点：1、是基于液体的样品分离/制备技术，与所有下游分离技术兼容；2、分离非常快； 3、液相分离保证初始样品具有很高的回收率； 4、采用连续模式，上样和分离连续同时进行； 5、分析对象广泛； 6、分离条件温和，适合活性生物材料的分离纯化。 二、2－DE技术，即双向电泳，是当前蛋白质组学研究中分辨率最高、信息量最大的分离技术。它的优点有：1. 可以将上千种不同的蛋白质分离开来，并得到每种蛋白质的等电点、表观
质膜的纯度鉴定方法 11、形态学方法（常规透射电镜、免疫电镜观察其切片，纯细胞膜成空的膜泡或片状结构）2免疫印迹法（常用抗体:抗caveolin、Na+--K+--ATPase、flotillin、5`-nucleotidase 等） 3、酶活测定法（测 AP、ADP、Na+-K+-ATPase、5`-nucleotidase的活性） 4、膜组分分析法（分析脂质与蛋白质的比例） 由于细胞器在细胞内结构上与许多其他亚细胞组分相关联，和细胞器组成的动态性，所以分离得到的细胞器很难达到100% 的纯度。所以，亚细胞组分的纯度问题和亚细胞组分生物学功能的深入挖掘是亚细胞蛋白质组研究所面临的挑战。现在已经有一些研究策略来解决这一难点问题，如Schirmer等提出的差减蛋白质组学方法来解决核膜的内质网污染问题；Andersen 等提出的蛋白质校正谱图分析法(protein correlation profiling，PCP)来分析可能定位
线粒体蛋白质组学的研究进展(一)
线粒体蛋白质组学的研究进展(一) 【摘要】线粒体是真核细胞重要的细胞器，随着蛋白质组技术的发展和完善，一些新方法也被应用于线粒体蛋白质的研究，线粒体蛋白质组研究虽然已取得了一些成果，但线粒体蛋白质组数据库中的数据仍较匮乏，并且还有一些问题亟待解决和改善。 【关键词】线粒体；蛋白质组学 人类体细胞中除了红细胞，其他所有细胞均含有线粒体。线粒体是真核细胞重要的细胞器，它不仅是机体的能量代谢中心，而且还参与多种重要的细胞病理过程。线粒体拥有自己的DNA（mtDNA），可以进行转录、翻译蛋白质合成。线粒体含有500～2000种蛋白质，约占整个细胞蛋白质种类的5%~10%。线粒体的蛋白质参与机体许多生理、病理过程，如参与电子传递和ATP合成、三羧酸循环、脂肪酸氧化、氨基酸降解等过程。线粒体蛋白质结构与功能的改变与人类许多疾病相关，如退行性疾病、心脏病、衰老和癌症。运用蛋白质组研究技术，从整体上研究这些蛋白质在生理及病理状态下的变化趋势及相互关系，可以为线粒体作用机制的探索提供新的有力的支持。 1线粒体的超微结构和功能 线粒体是机体细胞中重要的亚细胞器，它具有独特的超微结构和多种重要的生物学功能。线粒体由两层膜包被，外膜平滑，内膜向内折叠形成嵴，两层膜之间有腔，线粒体中央是基质。基质内含有与三羧酸循环所需的全部酶类，内膜上具有呼吸链酶系及ATP酶复合体。线粒体是细胞内氧化磷酸化和形成ATP的主要场所，有细胞“动力工厂”之称。线粒体合成的ATP供给几乎所有的细胞生理过程：从骨骼肌和心肌的收缩，到细胞膜跨膜离子梯度的维持、甚至激素和神经递质的分泌等。另外，线粒体有自身的DNA和遗传体系，但线粒体基因组的基因数量有限，因此，线粒体只是一种半自主性的细胞器。线粒体的主要化学成分是蛋白质和脂类，其中蛋白质占线粒体干重的65%~70%，脂类占25%~30%。在肝细胞线粒体中外膜、内膜、膜间隙和基质四个功能区，各蛋白质的含量依次为：基质67%，内膜21%，外膜8%，膜间隙4%。内膜含有三类功能性蛋白：（1）呼吸链中进行氧化反应的酶。（2）ATP合成酶复合物。（3）一些特殊的运输蛋白，调节基质中代谢物的输出和输入。细胞线粒体的功能，不仅限于生物学功能。它们在氨基酸和血脂新陈代谢、血红素和铁硫群生物合成、细胞信号与细胞凋亡发挥关键作用。 2线粒体蛋白质组学概述 2.1蛋白质组学的概念蛋白质组学（proteome）一词，源于蛋白质（protein）与基因组（genome）两个词的杂合，意指“一种基因组所表达的全套蛋白质”，即包括一种细胞乃至一种生物所表达的全部蛋白质。蛋白质组本质上指的是在大规模水平上研究蛋白质的特征，包括蛋白质的表达水平、翻译后的修饰、蛋白与蛋白相互作用等，由此获得蛋白质水平上的关于疾病发生、细胞代谢等过程的整体而全面的认识。 2.2蛋白质组学的研究内容蛋白质组学的研究内容主要有两个方面：即结构蛋白质组学和功能蛋白质组学。结构蛋白质组学主要是蛋白质表达模式的研究，包括蛋白质氨基酸序列分析及空间结构的解析、种类分析及数量确定。功能蛋白质组学主要是蛋白质功能模式的研究，包括蛋白质的功能及蛋白质间的相互作用。蛋白质组的研究不仅能为生命活动规律提供物质基础，也能为多种疾病机制的阐明及攻克，提供理论根据和解决途径。 2.3线粒体蛋白质组的分析对蛋白质组组成的分析鉴定是蛋白质组学中与基因组学相对应的主要内容。目前线粒体蛋白质组的分析工作主要有:（1）通过双向电泳等技术得到正常生理条件下的蛋白质的图谱，建立相应的数据库。（2）比较病理组织细胞蛋白质组发生的变化，如蛋白质表达量的变化,翻译后修饰的类型和程度,或者可能的条件下分析蛋白质在亚细胞水平上定位的改变等。 2.4线粒体蛋白质组研究技术线粒体蛋白质组研究常用的技术有：（1）用于蛋白质相互作用
亚细胞定位之烟草转化方法
本氏烟草（N. benthamian）瞬时表达及相关实验方法： 一、农杆菌介导的烟草瞬时转化： A、实验步骤： 1、根据实验需要，将所要表达的基因克隆到含有不同标签的双元载体中，并转化农杆菌。 2、将新活化的农杆菌单克隆接种到含有相应抗生素的YEP中，28℃，200rpm过夜。 *估算时间，防止农杆菌液浓度超过1OD，否则会影响转化效率。 3、当菌液OD值介于0.6~1.0之间时，1000g，5min离心收集农杆菌。 4、用2ml Induction medium（without AS）轻柔重悬农杆菌，然后再次离心收集菌液。 5、重复步骤4。 6、所得沉淀用1ml Induction medium 重悬。 7、室温放置1~4小时 8、测OD值，根据实验需要，配置侵染液（组合详见下文）。 9、用不加针头的注射器将侵染液注射进6~8周大的本氏烟草叶片中。 *使用注射器时注意安全，防止针头扎到手，使用完的注射器要把针头套套上再扔，或者将针头放到注射器里面，避免伤害他人；注射时应戴乳胶手套并在每次注射完成后清洗手套，防止交叉污染。B、试剂： Induction medium： MES-KOH PH 5.7 10mM MgCl210mM AS 200uM 推荐提前配制母液 1M MES-KOH PH5.7 过滤灭菌，4℃保存，用时稀释100倍。 1M MgCl2 过滤灭菌，4℃保存，用时稀释100倍。 0.2M AS 溶于DMSO 有机溶剂专用滤膜过滤灭菌，分装（避免反复冻融），-20℃。用高压灭菌的超纯水稀释。 C、关于表达时间： 烟草瞬时表达系统中蛋白的表达可以维持比较长的时间，一般注射24小时之后到一周之内都会有表达。严格来讲需要摸索每个蛋白的最佳表达时段，但一般注射后48小时至72小时不同蛋白表达量都比较可观，不要错过。 D、关于侵染液浓度： 推荐每个菌株的浓度在0.1~0.2之间。过高的农杆菌浓度会引起叶片萎蔫甚至枯萎。
蛋白质组学课程论文
蛋白质组学关键技术研究进展 摘要：蛋白质组学是对蛋白质特别是其结构和功能的大规模研究，是在90年代初期，由Marc Wikins 和学者们首先提出的新名词。蛋白质组的研究不仅能为生命活动规律提供物质基础，也能为众多种疾病机理的阐明及攻克提供理论根据和解决途径。本文综述了蛋白质组学的一些关键技术的应用研究进展。 关键词：蛋白质组学；蛋白质组技术；研究方法 蛋白质组学的概念[1]最早是在1995年提出的，它在本质上指的是在大规模水平上研究蛋白质的特征，包括蛋白质的表达水平，翻译后的修饰，蛋白与蛋白相互作用等，由此获得蛋白质水平上的关于疾病发生，细胞代谢等过程的整体而全面的认识。近年来，高通量蛋白质分离与鉴定技术，如双向电泳、生物质谱、蛋白质芯片、酵母双杂交系统、生物信息学等相继建立并日趋完善，加速了蛋白质组学的发展。 1蛋白质组学概述 随着人类基因组计划的完成和功能基因组时代的到来，蛋白质结构与功能研究越来越重要，蛋白质组学、生物信息学等相关学科已逐渐成为生命科学的前沿。 随着人类基因组计划的实施和推进，生命科学研究已进入了后基因组时代。在这个时代，生命科学的主要研究对象是功能基因组学，包括结构基因组研究和蛋白质组研究等。尽管现在已有多个物种的基因组被测序，但在这些基因组中通常有一半以上基因的功能是未知的。 目前功能基因组中所采用的策略，如基因芯片、基因表达序列分析(Serial analysis of gene expression, SAGE)等，都是从细胞中mRNA的角度来考虑的，其前提是细胞中mRNA的水平反映了蛋白质表达的水平。但事实并不完全如此，从DNA、mRNA、蛋白质，存在三个层次的调控，即转录水平调控(Transcriptional control)，翻译水平调控(Translational control)，翻译后水平调控(Post-translational control)。从mRNA 角度考虑，实际上仅包括了转录水平调控，并不能全面代表蛋白质表达水平。实验也证明，组织中mRNA丰度与蛋白质丰度的相关性并不好，尤其对于低丰度蛋白质来说，相
WoLF PSORT 蛋白亚细胞定位预测
Nucleic Acids Research,2007,Vol.35,Web Server issue W585–W587 doi:10.1093/nar/gkm259 WoLF PSORT:protein localization predictor Paul Horton1,Keun-Joon Park1,2,Takeshi Obayashi3,Naoya Fujita1,3, Hajime Harada1,C.J.Adams-Collier4and Kenta Nakai3,* 1Computational Biology Research Center,AIST,Tokyo,Japan,2Center for Genome Science,National Institute of Health,Korea Center for Disease Control&Prevention,5Nokbeon-Dong,Eunpyung-Gu, Seoul122-701Korea,3Human Genome Center,Institute of Medical Science,University of Tokyo,Tokyo,Japan and4Collier Technologies,Everett,WA,USA Received January30,2007;Revised March26,2007;Accepted April8,2007 ABSTRACT WoLF PSORT is an extension of the PSORT II program for protein subcellular location prediction. WoLF PSORT converts protein amino acid sequences into numerical localization features; based on sorting signals,amino acid composition and functional motifs such as DNA-binding motifs. After conversion,a simple k-nearest neighbor classifier is used for https://www.360docs.net/doc/828190043.html,ing html,the evidence for each prediction is shown in two ways: (i)a list of proteins of known localization with the most similar localization features to the query,and (ii)tables with detailed information about individual localization features.For convenience,sequence alignments of the query to similar proteins and links to UniProt and Gene Ontology are provided. Taken together,this information allows a user to understand the evidence(or lack thereof)behind the predictions made for particular proteins. WoLF PSORT is available at https://www.360docs.net/doc/828190043.html, INTRODUCTION Bilipid membranes divide eukaryotic cells into various types of organelles containing characteristic proteins and performing specialized functions.Thus,subcellular localization information gives an important clue to a protein’s function.Although localization signals in mRNA appear to play some role(1),the main determi-nant of a protein’s localization residues in the protein’s amino acid sequence.(We recommend https://www.360docs.net/doc/828190043.html,/wiki/ Protein_targeting for a brief overview and Alberts et al. (2)for a textbook description.) Numerous experiments to determine protein localiza-tion have been performed to date.These can broadly be classi?ed as:small-scale experiments—the results of which continue to accumulate in public databases,such as UniProt(3)and Gene Ontology(4);and large-scale experiments using epitope(5)or green?uorescent protein (GFP)(6)tagging,or by separation of organelles by centrifugation combined with protein identi?cation by mass spectrometry(7,8). Although they provide invaluable information,the coverage of experimental data is only high for model organisms,particularly yeast.Moreover,the agreement amongst large-scale experimental data is only75–80% (6–9).Thus,computational prediction of localization from amino acid remains an important topic. Numerous computational methods are available [reviewed in(10,11)].Some(including WoLF PSORT) have recently been benchmarked by Sprenger et al.(12), who found the computational methods to be useful for sites,such as the nucleus,for which many training examples can be easily obtained from UniProt(which is the source of most or all of the training data for most prediction methods—including WoLF PSORT).The di?erent methods they benchmarked were found to have di?erent strengths.Here,we describe the public server for our WoLF PSORT method. PREDICTION METHOD WoLF PSORT is an extension of PSORT II(13,14)and also uses the PSORT(15)localization features for prediction.In addition,WoLF PSORT uses some features from iPSORT(16)and amino acid composition.Those features are used to convert amino acid sequences into numerical vectors,which are then classi?ed with a weighted k-nearest neighbor classi?er.WoLF PSORT uses a wrapper method to select and use only the most relevant features.This reduces the amount of information which needs to be considered(and displayed)for the user to interpret individual predictions and may also make the predictor less prone to over learning.The prediction method has described in more detail elsewhere(17). *To whom correspondence should be addressed.Tel:t81-3-5449-5131;Fax:t81-3-5449-5133;Email:knakai@ims.u-tokyo.ac.jp ?2007The Author(s) This is an Open Access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution Non-Commercial License(https://www.360docs.net/doc/828190043.html,/licenses/ by-nc/2.0/uk/)which permits unrestricted non-commercial use,distribution,and reproduction in any medium,provided the original work is properly cited.
蛋白质组学期末复习题
蛋白质组学相关试题及答案 解释 1． Proteome(蛋白质组)：由一个细胞或者组织的基因组所表达的全部相应的蛋白质，称为蛋白质组。 2. Proteomics(蛋白质组学)：指应用各种技术手段来研究蛋白质组的一门新兴学科，即研究细胞在不同生理或病理条件下蛋白质表达的异同，对相关蛋白质进行分类和鉴定。更重要的是蛋白质组学的研究要分析蛋白质间相互作用和蛋白质的功能. 3. Mass Spectrometer（质谱仪）：质谱仪是一个用来测量单个分子质量的仪器，但实际上质谱仪提供的是分子的质量与电荷比（m/z or m/e）。分离和检测不同同位素的仪器。即根据带电粒子在电磁场中能够偏转的原理，按物质原子、分子或分子碎片的质量差异进行分离和检测物质组成的一类仪器。质谱仪最重要的应用是分离同位素并测定它们的原子质量及相对丰度。 4. Proteome sample holographic preparation（蛋白组样品的全息制备）：（1）keep protein information （2）adapted to separation and identification methods （3）different samples,different extraction. 蛋白质样品制备是蛋白质组研究的第一步，也是最关键的一步。因为这一步会影响蛋白质产量、生物学活性、结构完整性。因此要用最小的力量使细胞达到最大破坏程度同时保持蛋白质的完整性。原则是，保持蛋白质的所有信息；选择合适的分离和鉴定方法；对于不同的样品要用不同的提取方法。 5. Post translational modification(蛋白质翻译后修饰) 肽链合成的结束，并不一定意味着具有正常生理功能的蛋白质分子已经生成。已知很多蛋白质在肽链合成后还需经过一定的加工（processing）或修饰，由几条肽链构成的蛋白质和带有辅基的蛋白质，其各个亚单位必须互相聚合才能成为完整的蛋白质分子。 6. De novo sequencing(从头测序) 从头测序为蛋白质组研究提供了一种不用借助于任何蛋白质序列数据库信息，直接解读串联质谱数据的方法。其基本算法主要由4个部分组成：质谱图的构建、
蛋白质组学在肿瘤研究的应用
蛋白质组学在肿瘤研究的应用 姓名：学号 专业：病理学与病理生理学导师： 摘要随着人类全基因组计划（HGP）测序工作的完成, 对基因功能即基因表达产物蛋白的研究已经拉开了序幕。蛋白质组学研究直接定位于蛋白质水平, 大规模地分析组织细胞的蛋白质表达水平、翻译后修饰以及蛋白质间相互作用, 是后基因组计划的重要组成部分。肿瘤的发生涉及一系列复杂的分子事件, 蛋白质组学研究手段可以大规模地定量分析细胞内的蛋白质表达水平、翻译后修饰等性质以及定义信号网络中的蛋白质间相互作用, 从而有希望发现控制肿瘤进程的关键分子, 为肿瘤的诊断、分型、药物研制带来新的思路和途径。蛋白质组学为肿瘤的研究提供了新的平台。本文就蛋白质组学研究的技术方法和在肿瘤研究方面的应用做一个综述。 关键词蛋白质组学肿瘤应用 蛋白质组学（Proteomics）是研究一种细胞或一种生物中全部蛋白质的表达、结构、功能等的新兴学科，与基因组学、代谢组学等一起构成了当代生命科学的组学( -omics) 系列。蛋白质组学一般分为表达蛋白质组学( expression proteomics)、结构蛋白质组学( structural proteomics) 和功能蛋白质组学( functional proteomics) 3 个方面。表达蛋白质组学也叫差异蛋白质组学，主要对正常、疾病或药物处理细胞或亚细胞中的所有蛋白质进行定性或定量的研究; 结构蛋白质组学主要研究特定细胞或细胞器中蛋白质及蛋白质复合体的组成，确定其定位并了解蛋白质间相互作用; 功能蛋白质组学是一个较为广义的概念，主要研究蛋白质转录后修饰，为细胞信号转导、疾病机制等提供重要信息。恶性肿瘤的发生是一个涉及多因素、多基因的多阶段病理过程. 以往的研究主要集中在基因组和转录组分析. 随着人类基因组计划的完成, 肿瘤研究开始进入“后基因组时代”, 肿瘤蛋白质组学应运而生. 蛋白质作为基因功能的主要执行者, 一方面在肿瘤发生发展过程中扮演重要角色, 另一方面在很大程度上决定正常细胞和肿瘤细胞之间的差异(如异型性、恶性特征等).李国庆[1]等参考了他人的研究成果，通过对肿瘤发生与蛋白质表达（谱）的改变、肿瘤与翻译后修饰蛋白质
蛋白质的亚细胞定位的预测
蛋白质的亚细胞定位的预测 关于蛋白质的亚细胞定位的预测，In general，预测方法分为3个步骤。首先，为每一类亚细胞locations构建客观而具有代表性的数据集。其次，从数据集中提取特征参数或descriptor。最后也是最关键的一步，通过算法比较查询序列中所包含的特征参数与各类相应的location 的相似度，作出判断，一般会用一组概率的形式来表述。很明显，其中大量运用的是机器学习理论和统计学的方法。对算法有兴趣的朋友可以参考下面这一篇综述，“An overview on predicting the subcellular location of a protein” In Silico Biology 2002 http://www.bioinfo.de/isb/2002/02/0027/main.html 以下是该综述中涉及的部分server，都是比较经典的。 PSORT：http://psort.nibb.ac.jp By amino acid composition information and sorting signal knowledge TargetP：http://www.cbs.dtu.dk/services/TargetP/ By discriminating the individual targeting signal peptide MitoProt：http://ihg.gsf.de/ihg/mitoprot.html By discriminating mitochondrial and chloroplast signal peptide Predotar：http://www.inra.fr/Internet/Produits/Predotar/ By discriminating mitochondrial, chloroplast signal peptide NNPSL：https://www.360docs.net/doc/828190043.html,/nnpsl By amino acid composition SobLoc：https://www.360docs.net/doc/828190043.html,/SubLoc/ By amino acid composition SubLoc: https://www.360docs.net/doc/828190043.html,/SubLoc/ By more sequence information besides the amino acid composition 一篇文献：https://www.360docs.net/doc/828190043.html,/papers/2003_loci_3dnet/paper.html “Better prediction of sub-cellular localization by combining evolutionary and structural information”
EMSA、CHIP.亚细胞定位
EMSA 实验材料：EMSA探针生物素标记试剂盒（20；1358）；化学发光EMSA检测试剂盒（100；1399）；正电尼龙膜（20；458）；细胞核蛋白提取试剂盒（50；462）；BCA蛋白浓度测定试剂盒（200；170）；压片暗盒（1个；138）；PMSF试剂（1g;118） 实验方法： 一、探针制备： 1.准备工作： A.取出TdT Buffer (5X)、Biotin-11-dUTP和Ultrapure water溶解，并置于冰浴上备用。 B.取出待标记的单链EMSA探针，用水稀释至1μM，并置于冰浴上备用。如果待标记 的EMSA探针为双链，95℃加热2分钟，然后立即放置到冰水浴中，使双链的EMSA 探针转变为单链的探针，然后同样用水稀释至总的单链DNA浓度为1μM，即每条单链的浓度为0.5μM，相当于最初双链的EMSA探针浓度为0.5μM。 2.DNA 探针的标记: Ultrapure water 29ul TdT Buffer (5X) 10ul 待标记探针(1μM) 5ul Biotin-11-dUTP (5μM)5ul TdT (10U/μl)1ul 总体积50ul A.参考上表设置反应体系。注：对于双链的EMSA探针的标记反应，建议一次做两管， 即总体积共100μl，以最终获得足够的生物素标记EMSA探针用于后续EMSA检测。 B.用枪轻轻吹打混匀，切勿vortex。37℃孵育30分钟。 C.加入2.5μl 探针标记终止液，轻轻混匀终止反应。 3.TdT 的去除: A.探针标记反应终止后，加入52.5μl氯仿-异戊醇(24:1)，vortex使有机相和水相充分 混合以抽提TdT(说明：静止后有机相和水相会很快分层)。 B.12000-14000g离心1-2分钟。吸取上清备用。上清即为被生物素标记的单链DNA探 针。 4.探针的纯化( 选做) ： 通常为实验简便起见，可以不必纯化标记好的探针。有些时候，纯化后的探针会改善后续实验的结果。如需纯化，可以按照如下步骤操作： A.对于100μl 标记好的探针，加入1/4体积即25μl 的5M醋酸铵，再加入2体积 即200μl 的无水乙醇，混匀。 B.-70℃至-80℃沉淀1小时，或-20℃沉淀过夜。 C.4℃，12,000g-16,000g离心30分钟。小心去除上清，切不可触及沉淀。 D.4℃，12,000g-16,000g离心1分钟。小心吸去残余液体。微晾干沉淀，但不宜过分干 燥。 E.加入50μl TE，完全溶解沉淀。标记好的探针可以-20℃保存。 5.生物素标记探针标记效率的检测： A.取5μl Biotin-Control Oligo (0.4μM)，加入196μl TE，混匀，稀释成10nM Biotin-Control Oligo(作为标准品)。取出适量10nM Biotin-Control Oligo，依次稀释成5nM、2.5nM、1nM、0.5nM和0.25nM。 B.取3μl步骤3B所获得的生物素标记的DNA探针(100nM)，加入27μl TE，混匀，稀 释成10nM 生物素标记的探针(作为待测样品)。取出适量的10nM 生物素标记的探
蛋白质组学期末作业
1、一、常用的样品制备技术： 1、高丰度蛋白去除技术（抗体亲和法：通过抗原抗体反应原理，用针对样品中多种高丰度蛋白的单克隆或多克隆抗体来特异性去除样品中的高丰度蛋白；染料亲和法：通过高丰度蛋白与染料环结构之间复杂的静电、疏水及氢键相互作用去除样品中的高丰度蛋白，其特异性相对较低。） 2、自由流电泳技术（FFE）（FFE分离原理－IEF（等电聚焦）条件下：根据等电点的不同进行样品分离，主要用于分离蛋白质。ZE（区带电泳）条件下：根据样品表面电荷密度不同进行分离，主要用于分离细胞器。FFE的特点：1、是基于液体的样品分离/制备技术，与所有下游分离技术兼容；2、分离非常快； 3、液相分离保证初始样品具有很高的回收率； 4、采用连续模式，上样和分离连续同时进行； 5、分析对象广泛； 6、分离条件温和，适合活性生物材料的分离纯化。 二、2－DE技术，即双向电泳，是当前蛋白质组学研究中分辨率最高、信息量最大的分离技术。 它的优点有：1. 可以将上千种不同的蛋白质分离开来，并得到每种蛋白质的等电点、表观分子量和含量等信息。2.如果双向电泳后续接一系列自动化操控，就能大大增加蛋白质分析与鉴定的能力。3.可检测翻译后和翻译过程的蛋白质修饰。 缺点有：1、不能进行可完全的2-DE分析。 2、许多较大的疏水蛋白质在IEF分析中的结果不理想。3、对相对分子质量过大（）100000）的蛋白质分离分析能力差 4、双向电泳不易实现自动化操作，不能适应大规模蛋白质组分析的需要5、双向电泳首先由的主要染色技术（考马斯亮兰染色、银染色）的检测灵敏度较差，且局限在越100倍的动态范围，而细胞中蛋白质表达的动力学范围为百万倍，而且从胶上切割下的蛋白点消化后所产生的肽的回收率常常低于60%，这更会妨碍MS对低丰度蛋白的鉴定。 二亚细胞组份的分离与鉴定。分离：最好的分级分离方法是亚细胞器的分离，然后对各细胞器的蛋白质组进行单独研究。一般从三个方面对亚细胞器的纯度进行评价：1．电子显微镜检测 2.标志酶活性测定 3.Western blot 质膜的纯度鉴定方法： 质膜的纯度鉴定方法 11、形态学方法（常规透射电镜、免疫电镜观察其切片，纯细胞膜成空的膜泡或片状结构） 2免疫印迹法（常用抗体:抗caveolin、Na+--K+--ATPase、flotillin、5`-nucleotidase 等）
Science重磅首次绘制出人蛋白质组亚细胞定位图
在一项新的研究中，对人细胞中的蛋白是如何分布的首个分析结果揭示出大部分人蛋白能够在一个给定的细胞中的一个以上位置发现到。利用位于瑞典的细胞图谱（Cell Atlas），研究人员研究了人蛋白质组（对应着绝大多数蛋白编码基因）的空间分布，而且他们史无前例详细地描述了蛋白在多个细胞器和细胞亚结构中的分布。 相关研究结果于2017年5月11日在线发表在Science期刊上，论文标题为“A subcellular map of the human proteome”。 Schematic overview of the cell. 在一个细胞中，细胞器形成一个封闭的空间。在这个空间中发生的化学反应完成细胞中的特定功能。鉴于这些功能与一组特定的蛋白紧密地关联在一起，了解人蛋白质组的亚细胞定位是理解人细胞的功能和内在机制的关键知识。 这项研究是由瑞典皇家理工学院副教授Emma Lundberg领导的。Lundberg及其团队产生了30多万张图片来系统性地确定人蛋白在体外培养的细胞系中的空间分布，并且在单细胞分辨率上将它们定位到细胞区域和亚结构中。
Subcellular structures annotated in the Cell Atlas by immunofluorescence microscopy. 这种细胞图谱是人类蛋白图谱（Human Protein Atlas）计划10多年研究的结果，它是在2016年12月发起的。这项新的研究详细地分析了这几十万张图片。这些图片是作为一项国际合作行动的一部分产生的。这个国际合作行动也包括来自中国、韩国、印度、丹麦和德国的研究团队。 瑞典皇家理工学院教授、人类蛋白图谱主任Mathias Uhlen说，“仅通过研究人体最小的功能单元（即细胞），我们才能够充分地理解人体生物学功能。这种细胞图谱给研究人员提供新的知识而有助在功能上解释单个蛋白和它们在人体生物学功能和疾病中的作用。” 这些研究人员将由13,993种抗体靶向的总共12,003种蛋白定位到30个细胞区室和亚结构中的一个或多个，此外，他们还详述了13个主要细胞器的蛋白质组。具有最大蛋白质组的细胞器是细胞核（有6,930种蛋白）及其亚结构（如核小体和核小斑点），和细胞质（有4,279种蛋白）。
拟南芥中一个未知功能蛋白的叶绿体亚细胞定位研究
植物学通报 2006, 23 (3): 249￣254收稿日期: 2005-12-20; 接受日期: 2006-03-07 基金项目: 科技部重大基础研究前期研究专项(973预研) (2003CCA01100)* 通讯作者 Author for correspondence. E-mail: znyang@https://www.360docs.net/doc/828190043.html, ．研究报告． 拟南芥中一个未知功能蛋白的叶绿体亚细胞定位研究 王鹏程１ 王晨１ 米华玲２ 周根余１ 杨仲南１＊ (1上海师范大学生命与环境科学学院 上海 200234)(2中国科学院上海植物生理生态研究所 上海 200032) 摘要 生物信息学分析表明, 模式植物拟南芥叶绿体中含有大约4 000多种蛋白质, 目前只分离得到1 000多种, 其他预测的叶绿体蛋白的实验验证对叶绿体功能研究有重要意义。本文对一个预测的叶绿体未知功能蛋白AT5G48790进行了亚细胞定位研究。我们克隆了该基因5'端长178 bp 的DNA 片段, 与绿色荧光蛋白(GFP)基因构建重组载体pMON530-cTP-GFP 。转基因植株通过激光共聚焦显微镜观察, GFP 只在叶绿体中特异表达。实验结果表明, AT5G48790的确为叶绿体蛋白。本实验方法也可用于其他预测的蛋白质的实验验证。 关键词 融合蛋白, 亚细胞定位, 转运肽 Study of Subcellular Localization of the Expressed Protein in Arabidopsis thaliana Pengcheng Wang 1, Chen Wang 1, Hualing Mi 2, Genyu Zhou 1, Zhongnan Yang 1* 1 (College of Life and Envionment Science, Shanghai Normal University , Shanghai 200234) 2 (Shanghai Institute Plant Physiology and Ecology , Chinese Academy of Sciences , Shanghai, 200032) Abstract Bioinformatics analysis has revealed about 4 000 proteins in chloroplasts; however, only about 1 000 proteins have been validated. Thus, we established an experimental system to verify predicted chloroplast proteins. At5g48790 was predicted to be an Arabidopsis chloroplast protein.The 178 bp segment of the 5' sequence of this gene was cloned and fused with GFP to construct a binary vector pMON530-cTP-GFP for genetic transformation. On confocal laser-scanning microscopy,green fluorescent signals were localized in chloroplasts in transgenic Arabidopsis plants. The results suggest that At5g48790 encodes a chloroplast protein. This experiment can also be used to investi-gate other proteins predicted to be located in chloroplasts in Arabidopsis ．Key words fusion protein, subcellular localization, transit peptide 叶绿体是高等植物以及藻类中的一类重要的细胞器, 由叶绿体膜、类囊体和基质3部分构成, 其主要功能是进行光合作用, 另外还参与氨基酸、脂肪酸的生物合成(Motohashi et al.,2001)。在拟南芥中, 叶绿体蛋白质绝大部分由 核基因组编码在细胞质中合成, 叶绿体基因组编码87个蛋白(Abdallah et al., 2000)。拟南芥基因组序列分析表明, 14%左右的核基因编码的产物定位在叶绿体中(Abdallah et al., 2000)。进一步的生物信息学分析表明, 拟南芥中4 255个