木质素生物降解过程中木质素介体反应系统的研究进展

综述评论

木质素生物降解过程中木质素-介体反应

系统的研究进展

YA N W C

闫文超,黄 峰*,高培基

(山东大学微生物技术国家重点实验室,山东济南250100)

摘 要: 对木质素降解酶作用过程中介体物质研究进展进行评述,包括漆酶/介体系统(L M S)在生物漂白、脱木质素、和环境污染治理方面的研究应用情况及其动力学研究进展。

关键词: 木质素酶系统;漆酶/介体系统;生物漂白;木质素降解

中图分类号:T Q 351.013;O 636.2 文献标识码:A 文章编号:0253-2417(2003)01-0083-06

ADV ANCES OF CU RRENT IN V EST IGAT IONS ON MEDIAT OR

SYST EM FOR LIGN IN BIO -DEGRA DAT ION OF LIGN IN

YAN Wen -chao,H UANG Feng,GAO Pe -i ji

(State key Lab o f M icrobial Technology ,Shandong Univer sity ,Ji nan 250100,China)

Abstract:Advances of current inv estigations on mediator systems for bio -degradation of lignin are reviewed,includ -

ing application researches of laccase -mediator -system (L M S)on bio -bleaching ,bio -delignification,pollution tr eat -

ment,and kinetic studies o f L M S.

Key words:lignolytic systems;laccase mediator system(LM S);bio -bleaching ;delignification

木质素是一种具有复杂而不规则的三维网状结构的高聚物。它的结构基本单元是苯基丙烷,靠多种不同的碳-碳键和醚键连接而形成一种生物大分子物质,它是水不溶性的。植物木质化组织中含木质素20%~30%。木质素与纤维素和半纤维素之间具有物理或化学结合,使植物的机械强度提高。白腐真菌以及某些细菌可将木质素彻底降解,使有机碳变成无机碳返回自然界碳循环圈。木质素的含量仅次于纤维素,到目前为止尚未被很好的利用。很久以来人们对于用真菌在制浆造纸工业中进行木质素降解和生物漂白方面做了许多实验和努力,然而要想得到令人满意的木质素降解,必须经过长时间的培养,这与现有的制浆和漂白工艺不相容。而且,与传统的化学漂白或酶处理比较起来,对活的有机体的控制也很不方便。使用木质素酶系统替代真菌培养进行制浆漂白,被认为是技术上可行的,它的应用不需要对现有的工艺流程做大的改动。

收稿日期:2001-07-26

作者简介:闫文超(1979-),男,贵州贵阳人,硕士研究生,从事木质素降解机理研究。*通讯联系人第23卷第1期

2003年3月林 产 化 学 与 工 业Chemistry and Industry of Forest Products Vol.23No.1

M ar.2003

1 木质素降解酶系统

1.1 主要的木质素降解酶

目前发现的最主要的木质素降解酶是木质素过氧化物酶(LiP)、锰过氧化物酶(MnP)和漆酶(lac -case),但其它的酶类如纤维二糖醌氧化还原酶、纤维二糖脱氢酶、乙二醛氧化酶、葡萄糖氧化酶(葡萄糖1-氧化酶和葡萄糖2-氧化酶)、藜芦醇氧化酶和一些酯酶也参与了木材的自然腐烂这一复杂的过程。

1.2 关于木质素酶/介体系统

20世纪80年代相继发现木质素过氧化物酶和锰依赖过氧化物酶,使木质素降解酶类研究引起广泛兴趣,研究发现包括漆酶在内的木质素降解酶因尺寸太大而似乎不能透过细胞壁,酶只有在广泛的脱木质素之后才能进入到木材纤维的S2层[1]。对于木材中孔径大小的测量是对这些观察的很好的支持[2]。这似乎表明木质素生物降解过程中,酶与木质素之间需要电子传递介体物质参与作用。

很长一段时间以来,很多人认为单一的木质素酶就可以对木质素进行降解作用。但是,使用单一的M nP [3]、漆酶和LiP [4]或LiP [5]进行纸浆漂白却观察不到广泛的卡伯值的降低和浆白度的提高。说明一些活性成分的丢失和单一的酶不能模仿完整的木质素生物降解系统。

使用特别的设备将培养液用膜过滤以除去菌丝,发现滤液能使硫酸盐浆脱木质素[6]。表明对于漂白来说,真菌与纤维的接触不是必须的,而是真菌在生长过程中产生一些氧化酶和一些低分子质量的化合物共同导致了一个缓慢的、连续的木质素降解过程。通过大小排阻色谱和木质素降解酶免疫标记实验发现,活性成分可能是小分子物质而不是酶[7~8]。

次级代谢产物藜芦醇(VA)在木质素降解培养中的发现,使人们进一步假设一个小的可以扩散的氧化剂(即阳离子自由基)在木质素的氧化过程中是一个很重要的因子。1995年,一个由藜芦醇间接介导的LiP 对酚的氧化机制被提出[9]。但是许多木质素降解菌不分泌LiP 而只分泌M nP [10],这说明还存在其它的机制。比较LiP 、辣根过氧化物酶(HRP)和漆酶对各种甲氧基苯的氧化发现,它们对非酚型物质的氧化都是由阳离子介导的,并且以一种相似的方式产生醌类物质和甲基醇而对非酚型物质进行氧化[11]。

能够支持介体假说的一个很好例子是M nP,它将Mn 2+氧化成M n 3+,M n 3+再作为可扩散的氧化剂对有机底物进行单电子氧化。值得注意的是,LiP 在有丙二酸和草酸存在的情况下也能使Mn

2+氧化生

成Mn 3+。在有适当的酚型底物存在时,各种漆酶也能使Mn 2+氧化生成M n 3+[12]。用T rametes versicolor 突变株进行实验发现[13],不产生或只产生低活力的漆酶和MnP 的突变株不能使浆漂白或脱木质素;通过控制产酶条件,改变漆酶与MnP 比活进行的实验发现,提高漆酶活性同时降低M nP 活性,只有脱木质素被提高而甲醇产量和白度没有改变;降低漆酶的活性而提高MnP 的活性则导致木质素脱除率降低,白度提高较低;随着漆酶活性提高而M nP 活性不变,可以提高木质素脱除而对白度和甲醇产量没有影响;与亲本相比,一株只分泌60%活性的漆酶和70%活性的MnP 的菌株木质素脱除效果最好,甲醇产量和白度没有改变;添加纯化的M nP 只能部分的恢复漂白作用。说明漂白脱木质素不仅仅取决于M nP 和漆酶。这为介体假说提供了证据。

一些螯合剂、羟自由基和藜芦醇已被假设为自然发生的介体,但是关键的化学物质似乎还没有发现和定性。虽然对起关键作用的化合物的化学本质、种类和数量的了解还不确切,但很明显的是木质素的自然降解过程依赖于酶和介体存在。确定这些物质可以指导进行人工模拟木质素的自然降解过程,从而有望有效解决目前的制浆造纸工业与环境的冲突等问题。通过优化筛选介体化合物,漆酶介体系统在脱木质素方面已达到可与无元素氯漂白浆相似的效果。近几年来利用漆酶介体体系在有氧存在的情况下,已经取得了较好的木质素脱除效果。

2 漆酶/介体系统及其运用漆酶首次被发现是在1883年[14]。真菌漆酶是在19世纪90年代年被发现的。漆酶广泛地分布于

84 林 产 化 学 与 工 业第23卷

高等植物和真菌,如:Agar icus ,Podospora,Rhiz octonia,Pholiota,Pleurotus,Neurospora,A sp ergillus,Fusar ium ,Schinus r igidop or us ,Botry tis ,Schizop hyllum ,Cer rena,Phlebia(syn.Mer ulius),Pyr iculari-a ,Py cnop or us ,Junghuhnia,L entinus ,Ar millar ia,Monocillium ,Fomes,R ussula,L ep topor us 等。具有酚氧化酶活性的漆酶类型在细菌中很少发现,目前为止只在Str ep tomyces galbus [15]和Az osp irillum lip o f erum [16]中有发现。

漆酶能氧化 -和p -联苯酚、氨基苯酚、多酚、多胺、木质素化合物、抗坏血酸、一些无机离子和芳香胺。在真菌脱木质素中,漆酶具有催化脱羧、脱甲基和脱甲氧基作用。漆酶被许多能够与铜接合位点相互作用的阴离子如叠氮化物、氰化物、氰硫基和氟化物所抑制。因为这些试剂能置换漆酶活性位点上的铜,从而可逆地抑制了酶的活性。关于漆酶的性质、基因及其克隆人们已经作了大量的研究并取得了很多的成果,对于漆酶介体的分离、参与木质素自然降解过程的化合物的研究则越来越受到关注。已有研究结果认为,有效的介体是一些带有N -OH 基团的N -杂环物,如1-羟基苯并三唑等。N -OH 基团是介体的关键组成部分。某些过渡金属络合物能作为漆酶的介体,介导漆酶对纸浆进行脱木质素和漂白[17]。

2.1 漆酶/介体系统的动力学研究

研究漆酶/介体系统的动力学,有助于我们对漆酶/介体系统作用机理的研究。

以2,2 -联氮-二(3-乙基并噻唑-6-磺酸)(ABTS)作为介体,研究漆酶催化的氧气对藜芦醇的氧化发现此反应为假一级反应。反应的速率常数取决于介体与底物的比值,当介体与底物的摩尔比为0.15时达到最大值。介体在此反应中参与了竞争反应。当介体与底物的摩尔比值低于0.15时,介体主要作为漆酶的激活剂。随着ABTS 浓度的增加,它会与原始底物竞争漆酶的活性中心,抑制漆酶对藜芦醇的氧化,从而增加了氧化介体对藜芦醇的氧化作用[18]。以ABTS 作为介体,研究漆酶催化藜芦醇氧化反应的耗氧量发现,需氧量动力曲线由两个阶段组成。在起始阶段,藜芦醇主要被氧化成相应的阳离子。此时耗氧量曲线呈现出假零级反应速率规律。耗氧量与ABTS 的浓度有关,每摩尔ABTS 消耗0.25mol 的氧气。在后一阶段,藜芦醇主要被氧化成藜芦醛。耗氧量曲线呈现出假一级反应速率规律。耗氧量与藜芦醛产量之间成线性关系。每形成一摩尔藜芦醛消耗氧气0.42mol [19]。

比较了ABTS 和1-羟基苯并三唑(HBT)在氧化2,4-二甲氧基苄醇(DM BA)为2,4-二甲氧基苯甲醛(DMA)过程中的情况发现,以ABT S 作为介体时,介体系统的反应明显地分为两个阶段。根据反应动力学曲线,氧化剂是ABTS 双阳离子(ABTS dication)而不是酶。氧化态的ABT S 在氧化底物时反过来又会被还原为ABTS 。而以HBT 作为介体的漆酶/介体系统在此反应中不能明显地分为两个阶段,其耗氧量动力曲线在整个过程中都表现出零级反应规律。HBT 被氧化为氧化态H BT,再作为氧化剂氧化底物。因此氧化态HBT 的形成是反应速率的决定步骤。DMA 的产生也遵循零级反应规律。增加HBT 的浓度,形成每摩尔苯甲醛所需的氧量降低。表明当HBT/底物比值高时,会出现另一种反应途径。当H BT/底物比值低时,氧化态H BT 是作为单电子氧化剂而且能够被可逆还原为HBT 。但是HBT/底物比值高时,氧化态HBT 是作为三电子氧化剂而且最后被不可逆地还原为苯并三唑(BT)[20]。

研究漆酶/N -羟基,N -乙酰基苯胺(NHAA)系统使卡伯值降低的耗氧量动力学研究表明,在起始阶段(0.5~1h),NHAA 介导的木质素脱除以很高的速率进行。然而在这之后,由于介体的低稳定性导致木质素脱除速率的降低。当以HBT 作为介体时(与以NHAA 作为介体时相比),发现反应2h 以后,木质素的脱除程度更高了。与NHAA 相比,氧化介体的产生是决定HBT 介导的漆酶对浆的漂白速率的限制性步骤[21]。在pH 值为4.5的乙酸盐缓冲溶液中,在反应温度45 和一个大气压的情况下,研究漆酶/介体系统对松木硫酸盐AQ 浆脱木质素的动力学发现,在浆浓度为10%,介体剂量为每克浆0.1mmol H BT,酶剂量为每克浆10U 时,卡伯值的降低动力学曲线遵循假二级反应规律。在开始的8h 之内,氧消耗的动力学曲线遵循假一级反应规律,在后来的8~24h 之内为假零级反应

[22]。

2.2 漆酶/介体系统漂白脱木质素作用研究关于漆酶/介体系统能对硫酸盐浆进行漂白的首次报道是在1992年。起初使用ABTS 作为介体,第1期闫文超,等:木质素生物降解过程中木质素-介体反应系统的研究进展85

此后,人们在寻找经济可行的漆酶/介体组合方面进行了大量的研究工作,并且发现了几种至少与ABTS 一样有效的氮族化合物。漆酶/介体系统漂白研究中常用的介体有以下几种:ABT S 、HBT 或HOBT 、NHA(N -羟基乙酰苯胺)、NHB(N -羟基丁酰苯胺)、NNPH(N -亚硝基-N -羟基苯胺)、VA 等。

漆酶/介体系统的生物漂白被认为是通过氧、漆酶、介体和木质素之间的氧化循环来完成的。溶液中的氧首先氧化酶,氧化的酶再氧化介体,氧化的介体扩散到浆中氧化木质素。在这个反应中,理论上除了水和木质素降解产物之外没有其它的产物。介体在脱木质素中的作用是产生自由基。

ABTS 介导的漆酶对具有苄基氢不同结构的木质素非酚型和酚型模型化合物的作用后,发现具有苄基氢结构的木质素非酚型模型化合物能发生有限的 位脱氢氧化,氧化的结果主要生成芳香醛。但具有C 和C 双键的化合物却不能发生 位脱氢氧化。ABT S 形成阳离子基对酚型化合物进行氧化作用,而氧化非酚型木质素模型化合物的则是双阳离子。

用HBT 作为介体,漆酶/H BT 系统处理过的浆与对照相比,脱木质素作用较为显著。没有介体存在时,漆酶不能使浆进行脱木质素作用,也不能对纤维中的木质素进行聚合或解聚作用,而只能对其发生轻微的化学改变[23]。加入木聚糖酶能促进H BT 介导的漆酶/介体系统的脱木质素作用[24]。漆酶/NHA 对苇浆残余木质素的作用后,残余木质素在反应后甲氧基、酚羟基减少,醇羟基和羰基增多,木质素结构的苯环结构也发生了开环反应[25]。以HBT 作为介体,研究漆酶作用后的残余木质素结构发现,羧基增加而自由酚基减少。说明氧化作用是硫酸盐浆残余木质素脱除的主要机制。同时还发现残余木质素的脱甲基化作用。在漆酶漂白过程中,HBT 被迅速地转化为HT 。然而漆酶与HBT 反应还会使HBT 转化为BT 。BT 与漆酶结合没有脱木质素作用。因此,BT 的产生大大限制了脱木质素作用[26]。

研究还发现,键裂解能和介体的极性特点对漆酶介体漂白系统的反应速率有影响[26]

。

用N -亚肼三唑(N -hydrox ybenzotriazole)作为介体对漆酶作用后的木质素进行分析发现,此系统氧化木质素结构中的酚型成分,使木质素发生脱甲基化作用并使羧基显著增加。但是,N -亚肼三唑在生物漂白条件下是不稳定的,与漆酶单独作用或是在有浆存在的情况下都会转变成苯并三唑,在有浆存在的情况下这种转变发生的更快。而且苯并三唑对漆酶催化的脱木质素作用没有活性。因此对于脱木质素来说N -亚肼三唑向苯并三唑的转变是有害的[27]。

分别使用HBT 、NHA 和VA 作为介体,研究漆酶对高卡伯值硫酸盐浆的作用发现,在脱木质素方面漆酶/VA 系统的作用超过了漆酶/H BT 系统和漆酶/NHA 系统。三个系统均使浆的白度降低。推测白度的降低可能与醌型结构的出现有关。漆酶/VA 系统与氧脱木质素相比,值得注意的是前者对浆粘度的损坏小于后者[28]。比较了漆酶/HBT 和漆酶/NHAA 对浆的作用效果后发现,在特定的条件下漆酶/HBT 的脱木质素能力大于漆酶/NHAA 。同样,二者在脱木质素的同时,也使浆的白度降低[29]。在浆浓度为10%、反应温度40 和常压下反应8h,介体NHAA 和漆酶的最适用量分别为0.1mmol 和10IU 。升高温度能提高反应速率,但是却降低漆酶的稳定性。氧压的增加能增强试剂的穿透能力,从而提高木质素的降解效率[24]。付时雨等研究发现,漆酶用量为2.5U /g 浆,NHA 用量为1%,pH 值为5.0,酶处理时间2h,反应温度50 ,氧气压力0.3M Pa 时,可以获得较好的脱木质素效果[30]。漆酶介体系统除了具有降解作用外,对酚型化合物还有聚合行为。漆酶/介体系统在起始阶段对酚型化合物进行聚合作用,然后再对先前产生的聚合物进行降解。

从以上的研究可以看出,漆酶介体系统能有效的对浆进行脱木质素作用。但是,对浆的白度有损害。碱抽提可以使酶处理浆白度恢复。木质素被氧化所得降解产物与漆酶/介体之间发生副反应强烈地抑制漆酶/介体系统对木质素的脱除,用碱抽提降解掉降解所得的木质素片断能有效地恢复漆酶/介体系统对浆木质素的脱除。用木聚糖酶对浆进行预处理能显著地提高漆酶/介体系统的脱木质素效率[31]。经漆酶/介体处理后,木质素结构对碱抽提更敏感。

2.3 漆酶/介体系统与环保

漆酶/介体系统能对酚型污染物进行脱毒和脱色。近几年,这方面的专利已经被报道。一些专利技术已被采用或被改进。在3种主要的木质素降解酶中,唯一可以大量获得的是漆酶。因此,漆酶/介体86 林 产 化 学 与 工 业第23卷

系统在处理多环芳烃(PAH)方面具有很大的潜力。

漆酶能对工业染料进行脱色。在有介体HBT 存在的情况下,漆酶的脱色能力有所提高。H BT 介体来自于白腐菌(Pycnop or us cinnabarinus )的漆酶脱色作用的最适pH 值和最适温度分别为4.5和65 [32]。漆酶能在体外氧化PAH ,如:蒽、苊、苯并芘、二氢苊、芘等。加入介体H BT 能显著的提高漆酶对苊、二氢苊、蒽、苯并芘的氧化。但对其它种类的PAH 没有多大的影响,并且在漆酶/介体系统中部份PAH 被聚合[33]。在有不饱和脂类和HBT 存在的情况下,菲会被漆酶共氧化。在反应过程中,脂肪酸氢过氧化作用的发现表明反应涉及脂类的过氧化作用。漆酶对脂类的过氧化要求有HBT 而不依赖于Mn 2+或H 2O 2[34]。

T .versicolor 产的漆酶在以HBT 为介体时,能氧化二氢苊酮和苊,培养一定时间后,这两种化合物被完全代谢,主要的代谢产物为1,2-二氢苊二酮和1,8-苯二甲酸酐[35]。漆酶对染料的分解机理依染料的结构而有所不同,有些染料能直接作为漆酶的底物因此能直接被漆酶氧化,如蒽醌类染料,然而其它一些染料由于不是漆酶的底物而需要小分子代谢产物或介体的存在才能被氧化,如偶氮类和靛蓝类染料。蒽醌类染料能够介导偶氮类和靛蓝类染料的降解,即可以作为漆酶底物的染料能够促进非漆酶底物的染料的降解[36]。

3 结束

目前的制浆造纸工业与环境存在着冲突,化学品大量的使用与木质素等形成毒性物质排放到环境中造成环境污染。用生物的方法及其与化学物理的方法相结合进行制浆、漂白和预处理,不仅能提高浆的品质而且能减轻环境的压力。目前对于参与木质素自然降解过程的介体的研究还不具有工业应用可行性,随着研究的深入,木质素降解酶/介体系统的作用机理将会被阐明,同时将为大规模的工业化应用打下坚实的基础。

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