污水生物毒性监测技术规程 发光 细菌急性毒性测试 费歇尔

污水生物毒性监测技术规程发光细菌急性毒性测试-费歇尔弧菌法

（试行）

国家海洋局生态环境保护司

2015年10月

目次

1 范围 (1)

2 规范性引用文件 (1)

3 术语和定义 (1)

4 方法原理 (1)

5 试剂和材料 (1)

6 仪器和设备 (2)

7 样品的采集和保存 (3)

8 样品预处理 (3)

9 水样的毒性测试 (3)

9.1 仪器预热 (3)

9.2 测试管的准备 (3)

9.3 复苏发光细菌冻干粉 (4)

9.4 样品测试 (4)

10 参比毒物的毒性测试 (5)

11 数据处理 (5)

11.1 样品的发光抑制率计算 (5)

11.2 半数抑制浓度IC50计算 (5)

12 毒性水平评价 (6)

13 分析测试报告 (6)

14 质量控制和质量保证 (6)

15 注意事项 (6)

附录A （规范性附录）发光细菌急性毒性的分析测试报告内容 (8)

附录B （规范性附录）样品信息及测试条件的报表格式 (9)

附录C （规范性附录）测试结果的报表格式 (10)

参考文献 (11)

1 范围

本规程规定了以发光细菌费歇尔弧菌（Vibrio fischeri）为受试生物的水环境急性毒性测试与毒性水平评价方法。

本规程适用于海水、入海排污口污水、沉积物间隙水、淡水及实验室条件下化合物溶液等各类水体（盐度小于40）的急性毒性效应测试与评价。

2 规范性引用文件

下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。

GB 17378.3 海洋监测规范第3部分样品采集、贮存与运输

GB 17378.4 海洋监测规范第4部分海水分析

GB/T 14914-2006 海滨观测规范

HJ 506-2009 水质溶解氧的测定电化学探头法

3 术语和定义

下列术语和定义适用于本规程。

3.1 抑制率inhibition rate，H

水样在一定的时间和条件下与发光细菌接触后，发光细菌的发光量所降低的百分比，用H表示。

3.2 半数抑制浓度median inhibitory concentration，IC50

水样在一定的时间和条件下与发光细菌接触后，发光细菌的发光量减少50%的浓度（参比毒物或化合物浓度以mg/L为单位来表征，环境水样以样品液的百分浓度为单位来表征）。

4 方法原理

水样在一定的时间和条件下与发光细菌费歇尔弧菌接触后，发光细菌的发光强度变化与水样中毒性组分总浓度呈负相关关系，通过生物发光光度计测定水样与发光细菌接触15 min后的发光抑制率来表征水样的急性毒性水平。

5 试剂和材料

5.1 发光细菌：菌株为费歇尔弧菌（Vibrio fischeri，NRRL B-11177）。费歇尔弧菌冻干粉封装于透明小玻璃瓶中，于-18℃至-20℃下储存。使用前，添加补充液和稀释剂使发光细菌恢复活性后用于毒性测试。

5.2 补充液：超纯水，在2℃~8℃下保存。

注：可直接购置与费歇尔弧菌冻干粉配套的补充液，若自行制备则需高温灭菌。

5.3 稀释剂：2%氯化钠溶液，于2℃~8℃下保存。

注：可直接购置与费歇尔弧菌冻干粉配套的稀释剂，也可用超纯水自行配制，但需高温灭菌后使用。

5.4 硫酸锌贮备液（0.16 g/L）：准确称取0.016 g七水硫酸锌（ZnSO4?7H2O，分析纯，预先在干燥器中放置24 h以上）于50 mL干净的烧杯中，用少量稀释剂（5.2）溶解后，全量转入100 mL容量瓶中，用稀释剂（5.2）定容至标线，混匀，冷藏保存。

5.5 硫酸锌使用液：移取1 mL硫酸锌贮备溶液（5.4），用稀释剂定容至10 mL 比色管，配制浓度为16 mg/L硫酸锌使用液；再移取5 mL浓度为16 mg/L的硫酸锌使用液，用稀释剂定容至10 mL比色管，配制浓度为8 mg/L的硫酸锌使用液；以此类推，采用逐级稀释的方法配制浓度为4 mg/L、2 mg/L、1 mg/L的硫酸锌使用液。

5.6 氯化钠：固体，分析纯。

5.7 氢氧化钠溶液（1 mol/L）：称取4 g分析纯氢氧化钠溶于水，并用水稀释至100 mL，用于调整待测水样的pH值。

5.8 盐酸溶液（1 mol/L）：取8.5 mL浓盐酸（分析纯，ρ = 1.19 g/mL），并用水稀释至100 mL，用于调整待测水样的pH值。

6 仪器和设备

仪器和设备如下：

——生物发光光度计，带控温反应模块（15℃±1℃）和控温培养模块（4℃±3℃）；

——测试管：仪器配套的4 mL玻璃试管；

——比色管：10 mL；

——容量瓶：100 mL；

——溶解氧测量探头；

——盐度传感器；

——浊度计；

——计时器或秒表；

——可调节微量移液器：10 μL ~100μL，100 μL~ 1 000 μL，1 000 μL~ 5 000 μL；

——250 mL采样瓶：洁净、干燥棕色细口玻璃瓶或聚乙烯瓶。

7 样品的采集和保存

水样采集按照GB 17378.3-2007中规定执行。将水样注满采样瓶，上端不得留有空气间隙，盖上瓶盖。水样采集后，常温条件下应在24 h内测试完毕。若在24 h内不能完成测试，水样可在2℃~6℃下避光贮存，并于48 h内完成测试。

8 样品预处理

8.1 适宜测定的水样pH范围为6.0~8.5。当水样pH值小于6.0时，加氢氧化钠溶液（5.7），调节pH值约为6.0~6.5；当水样pH值大于8.5时，加盐酸溶液（5.8）调节pH值约为8.0~8.5。

适宜测定的水样盐度为20~40。若盐度小于20，则应加入氯化钠固体（5.6）将盐度调整至22±2。盐度测定参考“GB/T 14914-2006 海滨观测规范”中要求。

8.2 样品浊度若大于10 NTU，离心或过滤后测定。参考“GB 17378.4-2007 海洋监测规范第4部分海水分析”中规定的浊度计法测定样品浊度。

8.3 测试前应摇匀样品或曝气15 min，使样品溶解氧含量大于3 mg/L。参考“HJ 506-2009水质溶解氧的测定电化学探头法”规定的方法测定样品溶解氧。

9 水样的毒性测试

9.1 仪器预热

打开生物发光光度计，预热10 min。

9.2 测试管的准备

根据样品数量，准备相应数量的测试管，包括：

——补充液管：1个，温度控制在4℃±3℃；

——稀释剂管：1个，温度控制在15℃±1℃；

——样品管：根据待测样品数量设置样品测试管以及对照样测试管，温度控制在15℃±1℃；

——反应管：反应管数量是样品管数量的2倍，以作平行测定，温度控制在15℃±1℃。

9.3 复苏发光细菌冻干粉

9.3.1 配制发光细菌水合液

从冷冻环境（-18℃~ 20℃）中取出发光细菌冻干粉（含量约为0.0015 g ~ 0.0018 g）小瓶，在冷藏环境（2℃~ 6℃）下放置30 min后，启开并轻敲小瓶，确保冻干细菌充分落在小瓶底部。移取1 mL补充液（5.2）至补充液管中，放置5 min后，迅速将预冷后的1 mL补充液转移至冻干粉小瓶中，平摇3至4次，然后快速将摇好的溶液再转移回补充液管中。用1000 μL移液器充分地混合补充液管中的溶液（每次吸出500 μL再放回补充液管，反复操作至少10次）。此时补充液管中为发光细菌水合液，应在3 h之内使用。

注：补充液管的温度要求控制在4℃±3℃。

9.3.2 配制发光细菌复苏液

在稀释剂管中，用稀释剂（5.3）以1:10的比例稀释9.3.1中配制的发光细菌水合液，制备发光细菌复苏液，温度控制在15℃±1℃。发光细菌复苏液的配制量，可根据待测样品数量酌定。

9.4 样品测试

移取2 ml稀释剂（5.3）于样品管中用作对照样测定，再移取2 ml待测样品至样品管待测，放置10 min预冷后按下述步骤测定：

——自稀释剂管中分别移取100 μL发光细菌复苏液至各反应管中，静置15 min后，随机取一个反应管用作仪器初始发光强度校正，若初始发光强度不满足毒性测试要求，则需更换冻干粉；

——以5s/个~20s/个的速度测试并记录各个反应管中发光细菌复苏液的初始发光强度，对照的初始发光强度记作I C0，样品初始发光强度记作I T0；

——快速从样品管中按顺序逐个移取900 μL对照样和待测样溶液，至已加入发光细菌复苏液的对应反应管中，混匀，反应15 min；

注：自第一个样品加样开始15min倒计时，确保各个反应管的反应时间为15 min。

——反应15 min后，以5s/个~20s/个的速度按顺序逐个测定并记录反应后各反应管的15 min发光强度，对照样品的15 min发光强度记作I Ct，测试样品的15 min发光强度记作I Tt。

10 参比毒物的毒性测试

使用参比毒物硫酸锌（ZnSO4·7H2O）来评估发光细菌复苏后的相对敏感性和可靠性，至少一个月测试一次，或者在启用一批新的发光细菌冻干粉试剂时进行测试。测试步骤同9.4。

11 数据处理

11.1 样品的发光抑制率计算

本规程中规定使用反应15min时的样品发光抑制率H进行毒性水平评价，

计算方法见式（1）：

H= [(f·I T0) –I Tt]/(f·I T0) ×100% = 1 –I Tt/(f·I T0) ×100% （1）式中：

I T0——测试样品的初始发光强度；

I Tt——测试样品反应15 min时的发光强度；

f——反应15 min校正因子，计算公式见式（2）：

f =I Ct/I C0 （2）

式中：

I C0——对照样品的初始发光强度；

I Ct——对照样品在反应15 min时的发光强度。

11.2 半数抑制浓度IC50计算

发光强度的减弱可用γ量度，各个反应管中待测样品的γ值计算方法见式（3）：γ= [(f·I T0) –I Tt]/I Tt= (f·I T0)/I Tt–1 （3）用C表征样品浓度（参比毒物或化合物浓度以mg/L为单位来表征，环境水样以样品液的百分浓度为单位来表征），将γ和C转换成自然对数或者以10为底的对数形式，采用最小二乘法回归，然后将γ对C作图，线性拟合，见式（4）：

lnγ = b ln C + ln a （4）式中：

C——样品浓度；

ln a——回归直线的截距；

b——回归直线的斜率；

lnγ——对应浓度下的毒性响应。

方程的显著性水平取0.05，若概率（P）< 0.05，则回归方程成立。

γ= 1时，发光量损失50%时对应的样品浓度即为IC50，计算公式见式（5）：

50

ln -

a

b e

IC （5）12 毒性水平评价

样品毒性水平的表征方法采用检测结果中的15min发光抑制率H进行评价。根据H大小将毒性等级分为3级，相应等级分别为低度毒性风险、中度毒性风险、高度毒性风险，分级方法见表1。

表1 污水样品毒性风险等级评价方法

毒性等级H 毒性风险等级Ⅰ< 30% 低度毒性风险

Ⅱ30% ≤H < 80% 中度毒性风险

Ⅲ≥ 80% 高度毒性风险

13 分析测试报告

分析测试报告与结果报表应满足附录A、附录B和附录C的要求。

14 质量控制和质量保证

发光细菌急性毒性测试的质量控制和质量保证要求如下：

——为保证发光细菌冻干粉活性，除初始发光强度应满足生物发光光度计要求外，对照样的反应15min校正因子f应为0.6~1.8，否则需要更换冻干粉；

——精密度：样品3次重复测定结果的变异系数小于15%；

——反应15 min，参比毒物ZnSO4?7H2O的IC50范围应为0.6 mg/L ~ 6 mg/L。

注：ISO标准方法[1]中，14家实验室的参比毒物ZnSO4·7H2O的IC50变异系数为33.6%，均值为2.17 mg/L。

15 注意事项

本方法执行中应注意以下事项：

——除非另作说明，本方法所用试剂均为分析纯，水为去离子水或蒸馏水；

——对于色度较高，尤其是红色、棕色或黑色的水样，若在不经稀释的情况下测得发光抑制率≥80%，则该水样不适用于本测定方法；

——调节pH的氢氧化钠或盐酸加入液的体积不得多于样品总体积的5%；

——本方法所用发光细菌为商品化大支菌，水合后应在3 h内使用；

——商品化小支菌复苏时不使用补充液，直接添加稀释剂即可复苏（4℃±3℃），复苏后应在30 min内使用；

注：其他商品化发光细菌冻干粉复苏的具体步骤参照其商品说明书。

——若水样在48 h内不能完成测定，将水样采集于聚乙烯采样瓶中，于-20℃下冷冻贮存，贮存时间不得大于2个月，测定前化冻，恒温至室温后测定。

（规范性附录）

发光细菌急性毒性的分析测试报告内容

A.1 样品与实验室等相关信息

样品的详细信息，包括样品类型、采样地点，采样者姓名和采样方法；样品采集、运输以及保存信息；实验室名称；实验日期；实验名称；测试者姓名；测试仪型号等，具体报表见附录B。

A.2 毒性测试方法和条件

样品的pH值、溶解氧、盐度、浊度等信息；预处理过程的详细描述：样品的pH值、溶解氧、盐度、浊度、色度等调整信息，具体报表见附录B。

A.3 测试结果

参比毒物测试结果、样品测试结果及毒性风险等级等测试结果报表见附录C。

测试人签字：审核人签字：

参考文献

[1] ISO. Water quality-determination of inhibitory effect of water samples on the light emission of Vibrio fischeri(Luminescent bacteria test), part 3, 11348-3. 2007: International Organization for Standardization, Geneva, Switzerland.