表达载体转化的方法
目前外源基因导入叶绿体基因组的方法主要有基因枪转化法、PEG介导转化法、显微注射及激光注射法、转运肤介导的叶绿体间接转化法、电击法等。
(1)基因枪转化法
基因枪法是20世纪80年代后期发明的，它是将外源DNA(通常是带有目
的基因的质粒载体)如附在金属颗粒(如钨、金等)表面，然后通过高压动力装
置将金属颗粒轰击到受体细胞中的特定部位。基因枪法是目前己被验证的叶绿体基因组转化转化效率最高、采用最多的方法。大多数己经成功的叶绿体基
因组转化都是用这种方法实现的。它可以通过人为控制，将外源DNA导入到
细胞核及细胞器(如叶绿体体、线粒体等部位)中。基因枪法不受物种和基因型
的限制，转化后的组织可以迅速再生成植株，并且这一方法适合于不同种类的植物，其缺点是成本较高，操作复杂，不易普及到所有实验室。
(2)PEG介导转化法
PEG介导转化法是在PEG存在的情况下将去壁的受体细胞原生质体暴露
在纯化过的外源DNA中，由于PEG的存在，原生质体会先缩水，然后细胞膜结构会发生重构，在细胞膜结构到达不可逆破坏之前除去PEG，细胞膜结构又会回复到原先的自然稳定状态。在此过程中，外源DNA有机会进入胞内及质
体内，从而实现外源基因的转化。Golds等用PEG介导转化法成功地实现了烟草的原生质体转化，为质体转化提供了一条新的途径。该方法虽然成本较低，但原生质体的制备和再生比较困难，使得转化植株的再生频率较低，从而限制了这一方法的普遍应用。到目前为止，只有PEG法在烟草质体转化中获得成功的报道。
(3)显微注射及激光注射法
显微注射及激光注射法就是利用能量很高、直径很小的激光微束引起细胞膜可逆性穿孔，从而使处于细胞周围的外源DNA随之进入细胞的转基因方法。早在1987年，webe等就利用微束激光照射油菜细胞，将用荧光素标记的外源DNA 导入叶绿体，观察到荧光显示，并且发现这一处理对叶绿体的光合能力和细胞的分裂能力影响较小。由于激光微束穿刺技术操作简便，转化频率高，从而引起了许多科学家的重视，由此带动了此项技术在原生质体遗传转化中的应用与发展。此后，Kllobfauch等研究开发出了一种称为“毫微注射技术”(几mtojeetionteehnique)的叶绿体基因组转化方法。该方法是用一种亚显微直径为
0.1rnrn的微型注射器(femtosyringe)将10一15几(fL,femtoliter)的外源DNA直接导入完整植物细胞的叶绿体中。此种注射器是根据锢(indium,In)、稼(gallium,Ga)、和锡(tin,sn)组成的液态合金“gahnstan”的热膨胀原理制造的。由于这种合金具有很好的热传导性，热诱导的galinstan膨胀可以很好地控制注射速率，注射器不会对叶绿体细胞器造成明显的损伤。激光微束穿刺法对细胞的损伤小而且操作简便，可以准确定位于被照射的细胞,实验重复性好，己成为一种行之有效的转基因手段。但与农杆菌介导法相比，激光微束穿刺法转化效率较低，且激光微束仪设备复杂造价昂贵，因此限制了此技术的推广普及。
(4)转运肤介导的叶绿体间接转化法
此方法的原理是在构建植物定点整合表达载体时，将外源基因和叶绿体的转运肤编码序列相连，然后用细胞核转化技术把外源基因导入植物细胞。这样外源基因编码的蛋白质就有可能在转运肤的引导下输送到叶绿体细胞器中去，从而克服叶绿体DNA多拷贝的问题，并且在很大程度上还可缓解转化体的分离。例如Bogoradl将PsbA同转运肤序列融合后，通过Ti质粒导入烟草的核基因组后，在细胞质中合成的融合蛋白基因产物在转运肤的作用下输入到叶绿体腔内，间接地实现了叶绿体的转化。采用转运肤介导目的基因的方法虽然没有将外源基因整合到叶绿体基因组中，但可以使外源基因的产物蛋白定位到叶绿体中。由于细胞核转基因技术己经相当成熟，因此，这种间接的采用转运肤介导叶绿体转化的方法可能是一条值得采用的途径。
(5)电击法
电击法是利用高压电脉冲作用，在原生质体膜上进行“电击穿孔”，形成可逆的瞬间通道，从而促进外源DNA的摄入，此法最早是在动物细胞中得到应用，并取得了很好的效果。现在这一方法已被广泛应用于各种植物，例如Guerche用纤维素酶处理油菜2周龄的嫩叶后获得原生质体，将原生质体置于电穿孔仪中进行电击转化处理，筛选得到了21个抗性克隆，并最终获得了2株转化植株，其形态和育性完全正常；黄家总等用电击细胞融合的方法成功地使桂竹香和紫罗兰的原生质体产生融合。由于该方法对细胞没有毒害作用，融和同步性好，并且操作简便，整个过程中的参数容易控制，可在显微镜下观察融合的全过程，因此已被广泛应用于动植物及微生物细胞的融合。
电穿孔技术转化三角褐指藻
以三角褐指藻为受体细胞，利用电穿孔法将构建好的三角褐指藻叶绿体基因组定点整合表达载体pRC一GFP转化进三角褐指藻叶绿体中，用不同浓度的氯霉素进行阳性藻株的筛选，扩大培养后在激光扫描共聚焦显微镜下检验绿色荧光蛋白GFP的表达情况，并提取阳性藻株的总DNA进行CAT基因表达盒的扩增，进行分子水平的验证。
3.1实验材料
藻种及质粒
三角褐指藻由暨南大学藻种库保存。
质粒pPtc一GFP为上一章中所构建。
主要培养基和试剂的配制
1)f/2(Si一)培养基配制同2.1.4
2)1%f/2固体培养基的配制:1L f/2液体培养基(不加生长素)加入10g琼脂粉，高压灭菌后温度降至40℃左右时加入生长素。
3)100mg.ml-1氯霉素的配制:称量1g氯霉素溶于10ml无水乙醇中，分装后用锡纸包住。
3.2实验方法
3.2.1电穿孔法转化三角褐指藻
待藻细胞进入对数生长期后，进行电击实验。具体操作步骤如下：
1)离心收集l.0xl07一108个藻细胞，1394xg离心10min，弃上清。
2)加150ul 1.0molL-1NaCL悬浮藻细胞，再加150ul 0.1molL-1甘露醇，
混匀，冰上放置30min。
3)将藻液转移到0.4cm电激杯内，电激杯内藻液以不超过400 ul为宜，同
时加质粒pPtC-GFp(0.4 ug)混匀。
4)将电激杯放置好，调电穿孔仪电容至25F，电阻为400欧，电压为1.5kv，
进行电击。
5)将电击后的藻液转移到50ml三角瓶中，加新鲜的f/2培养基10ml，暗
处理2h，再正常培养24h(12L:12D)。
3.2.2氯霉素筛选阳性藻株并扩大培养
收集培养电击后培养了24h的藻液，155×g离心5min收集藻细胞，用新鲜的f/2(Si一)培养基悬浮藻细胞，将藻细胞分别涂布于含有氯霉素(200ug.ml-1、300ug.ml-1和400ug.ml-1)的f/2(si-)固体培养基平板上进行筛选。挑取在抗性平板上长出的转化子藻落，转接于含有相应浓度抗生素的f/2(si一)液体培养基中扩大培养。每7天更换一次含相同浓度氯霉素的培养基。
3.2.4氯霉素乙酞转移酶(CAT)基因表达盒在阳性藻株中的扩增
l)提取扩大培养后的阳性藻株总DNA。具体步骤如2.2.2
2)以阳性藻株总DNA为模板，利用引物P5、P6扩增氯霉素乙酞转移酶(CAT)表达盒。
片段CAT基因表达盒的PCR反应体系为20ul，
取5ul扩增产物与1ul 6×LoadingBuffer混匀后以1%琼脂糖凝胶电泳检查结果，并拍照。
3.3结果与分析
阳性藻株经过氯霉素筛选后的生长状况
l)平板筛选后长出的藻落
将电击后的藻液离心重新悬浮后涂到均匀涂布在含有不同浓度(200ug.ml-1、300ug.ml-1和40ug.m-1 )氯霉素的f/2( Si- )固体培养基上，倒置于智能人工气候箱中培养，经过10至15天后，对照组在200ug.ml-1氯霉素平板上无可见藻落(图3一1A)，而实验组在200ug.ml-1、300ug.ml-1,和400ug.ml-1，氯霉素筛选浓度下可看到清晰的藻落长出(图3-1B,C,D)。说明200ug.ml-1，,筛选浓度下己经完全可以抑制藻细胞的生长，而电击后的三角褐指藻对氯霉素产生了抗性。
后进生转化工作计划及措施1
后进生转化工作计划及措施 ******小学张** 新的学年又开始了，今年我担任二年级一班的数学课。通过对学 生的观察了解。我发现了不少聪明好学的孩子，但也有不少学生学习 起来感到吃力。后进生转化工作是班级工作的重要环节，在班级管理 上，要把转化后进生放到首位，可以说在时间及精力的投入上要更多， 通过教师和家长的积极努力，积极帮助后进生。 一、班级情况分析： 本班的学生大部分在学前阶段接受的幼儿教育比较少，知识面比 较狭窄。从家长的情况来看，大部分家长工作比较忙，文化层次较低， 对学生的辅导基本没有。那么本班的后进生大部分属于家长不管，学 习不自觉的情况。我班学习较差的学生有：马国俊，翟浩然，姜跃华， 林艳兵等。学生年龄虽小，但争当个好学生的愿望却是人人都有的， 他们单纯、比较听老师的话。只要老师恰当引导，多鼓励，多辅导， 就能取得理想的成绩。 二、后进生形成的原因： 1、家庭原因： 家长教育观念上的错误。作为家长望子成龙盼女成凤的愿望是对 的，但有的父母不顾及子女的学习基础和智力水平，把自己的一切愿 望无条件地全部寄托在子女身上，“严管”导致“怕学”、“厌学”。两代 人之间存在着代沟，相互之间的沟通困难。父母整天忙于工作，由 长辈带，长辈过于溺爱，导致本班有的学生过于娇惯。学习自觉性较 差。 2、学生原因：有的学生属于智力相对低一点的学生，进入一年 级以后，学习的知识越来越多，学生出现了怕学的情况。针对这样的 问题，要对学生进行积极的鼓励，帮助他树立学习的信心。 三、解决措施： 1、聚焦对象，查明落后根源。 有的放矢，才能百发百中。我必须逐个聚焦、全面地认识这些 学困生。一想到这些学生，我的眼前就出现了一个个鲜活的面孔。把 这些暂时在我心中定位为学困生一组一组地集中坐在一起，不管是上
表达载体的构建方法及步骤
表达载体的构建方法及步骤 令狐采学 一、载体的选择及如何阅读质粒图谱 目前，载体主要有病毒和非病毒两大类,其中质粒DNA 是一种新的非病毒转基因载体。 一个合格质粒的组成要素： （1）复制起始位点Ori 即控制复制起始的位点。原核生物DNA 分子中只有一个复制起始点。而 真核生物DNA 分子有多个复制起始位点。 （2）抗生素抗性基因可以便于加以检测，如Amp+ ,Kan+ （3）多克隆位点MCS 克隆携带外源基因片段 （4）P/E 启动子/增强子 （5）Terms 终止信号 （6）加poly（A）信号可以起到稳定mRNA 作用 选择载体主要依据构建的目的，同时要考虑载体中应有合适的限制酶切位点。如果构建的目 的是要表达一个特定的基因，则要选择合适的表达载体。 载体选择主要考虑下述3点： 【1】构建DNA 重组体的目的，克隆扩增/基因表达，选择合适的克隆载体/表达载体。 【2】.载体的类型：
（1）克隆载体的克隆能力－据克隆片段大小（大选大，小选小）。如<10kb 选质粒。 （2）表达载体据受体细胞类型－原核/真核/穿梭，E.coli/哺乳类细胞表达载体。 （3）对原核表达载体应该注意：选择合适的启动子及相应的受体菌，用于表达真核蛋白质时注意克服4个困难和阅读框错位；表达天然蛋白质或融合蛋白作为相应载体的参考。 【3】载体MCS 中的酶切位点数与组成方向因载体不同而异，适应目的基因与载体易于链接，不能产生阅读框架错位。 综上所述，选用质粒（最常用）做载体的5点要求： （1）选分子量小的质粒，即小载体（1－1.5kb）→不易损坏，在细菌里面拷贝数也多（也有大载 体）； （2）一般使用松弛型质粒在细菌里扩增不受约束，一般10个以上的拷贝，而严谨型质粒<10个。 （3）必需具备一个以上的酶切位点，有选择的余地； （4）必需有易检测的标记，多是抗生素的抗性基因，不特指多位Ampr（试一试）。 （5）满足自己的实验需求，是否需要包装病毒，是否需要加入荧光标记，是否需要加入标签蛋白，是否需要真核抗性（如Puro、G418）等等。 无论选用哪种载体，首先都要获得载体分子，然后采用适当的限制酶将载体DNA 进行切割，获得线性载体分子，以便于与
完整版后进生转化工作计划及措施.doc
后进生转化工作方案和措施107班 贾芳，东华初级中学甲级，一年级 新学年又开始了。今年，我是头儿 七年级七班的老师。通过对学生的分析 我们可以通过观察来理解它。我发现了很多聪明的好学的孩子，但也有很多学生 对学习感兴趣 这很难。后进生的转化是一个重要环节 课堂作业。在班级管理中，必须转变观念 后进生 可以说，后进生应该投入更多的时间和精力 把精力放在首位，通过老师和家人 长期积极努力， 积极帮助后进生。 1、课堂情境分析 这个班的大多数学生都能跟上节奏 学校无论在学习还是行为习惯上 他们都有良好的学习和行为习惯，但也有一些学生小学学习基础差，
学习明显落后，尤其是数学，所以 十几个学生跟不上这个班 大约有十个后进生，有些学习成绩很差， 他们中有些人的行为习惯不好。所有这些都需要脑袋老师和你 有了老师的积极配合，只要老师 正确引导，多鼓励，多引导， 我们可以 达到理想效果 。 2、后进生形成的原因如下 1家庭原因： 家长教育的错误观念。 作为一个家长，希望孩子成为一条龙和一个孩子是对的女儿变成凤凰 有些家长，不管孩子的学习基础和 智力水平，无条件放弃一切愿望 他们都要依靠自己的孩子，而“严格控制”会导致“怕学”和“厌学”。有一个 两代人之间的代沟，
彼此之间很难沟通。家长们忙着 他们终日工作，在长辈的带领下， 谁宠爱你 太多了 这个班有些学生被宠坏了。意识 学习很差。 2学生原因：有些学生智力相对较低 学生们，进入初中一年级 从那以后，我们学到了越来越多的知识，学生们也越来越多 害怕学习。鉴于这个问题，我们应该 一 积极鼓励学生帮助他们建立信心 在学习上。 3、解决方案： 1聚焦目标，找出落后的根源。只有有明确的目标，我们才能达到一百个目标。我必须专注于 这些学生一个个都有了全面的了解 他们。 当我想到这些学生， 我看到我面前的新面孔
植物表达载体转化农杆菌操作步骤
植物表达载体转化农杆菌操作步骤 来源：郭庆水的日志 植物表达载体转化农杆菌操作步骤 第一部分：农杆菌介导转化水稻 1、农杆菌选择：LBA4404、EHA105、GV3101 2、农杆菌活化：将保存的农杆菌在固体LB培养基上画线（或加或不加抗生素，LBA4404:Rif 或Str；EHA105：Rif或Str；GV3103：庆大霉素。如果不加抗生素就有可能造成这些菌株的Ti质粒丢失，导致农杆菌缺乏侵染性），抗生素浓度为：50μg/ml。28℃培养。 3、农杆菌感受态细胞的制备： 1）挑取单菌落接种于3ml LB液体培养基中，220rpm 28℃振荡培养至OD600 =0.5。 2）吸取1.5ml菌液于离心管中，冰浴10min； 3）5000（13000）rpm离心30s，弃去上清液； 4）沉淀用1.5 ml 0.5M NaCl悬浮,冰浴20min； 5）5000（13000）rpm离心30s，弃去上清液； 6）每管用100μl 20mMCaCl2悬浮，用于转化； 制备好的感受态细胞可马上使用，也可按每管200ul分装于无菌离心管中，于4℃保存48小时内使用，长期贮存时必须在液氮中速冻后转一70℃保存。使用时从一70℃取出，置冰上融化后使用。 4、DNA直接转化农杆菌： 1）50μl农杆菌感受态细胞中加入质粒DNA 0.1～1μg（5－10ul），之后冰浴30 min； 2）放入液氮中5min（或1min），然后立即放入37℃水浴锅中水浴5min； 3）取出离心管，加入0.5mlLB，28℃、220rpm振荡培养3～5hr； 4）取出菌液于含相应抗生素的LB平板上涂板，在培养箱中28℃条件下倒置培养。2天左右菌落可见。 （pEmu载体：AMP+Rif/Str；pK载体：Kan＋Rif/Str；pTCK载体：Kan＋Rif/Str） 5、重组农杆菌鉴定： 1）挑取单菌落，接种于含相应抗生素的LB液体培养基中，28℃振荡培养过夜。（pEmu载体：AMP+Rif/Str；pK载体：Kan＋Rif/Str；pTCK载体：Kan＋Rif/Str） 2）小量提取质粒DNA，加GTE同时加5μL溶菌酶（50μg "ml -1，贮藏浓度为50mg/ml或10mg/ml）。 3）质粒酶切或PCR鉴定。 6、三亲交配法： 参考一： 1）接种含重组质粒的大肠杆菌于含的LB平板，于37℃培养； （pEmu载体：50μg"ml -1AMP；pK载体：50μg"ml -1Kan；pTCK载体：50μg"ml -1Kan）2）接种含动员质粒pRK2013的大肠杆菌于不含抗生素的LB平板上，于37℃培养； 3）接种受体农杆菌EHA105/LBA4404于50μg"mL-1 Rif/Str的LB平板上28 ℃培养； 4）分别挑取上述平板单菌落，分别于LB液体培养基中震荡培养； 5）待三种菌生长到对数期时，各取50μL，混匀，涂布于无抗生素的LB 平板上，28℃培养过夜； 6）挑取长出的小块菌，接种于含相应抗生素的LB液体培养基中，28℃振荡培养24h；（pEmu载体：50μg"ml -1AMP＋50μg"mL-1 Rif/Str；pK载体：50μg"ml -1Kan＋50μg"mL-1
初二(2)班后进生转化工作计划及措施
初二（2）班后进生转化工作计划及措施 新的学年又开始了，今年我担任初二（2）班的班主任和语文老师。通过半年来对学生的观察了解。我发现了不少聪明好学的孩子， 但也有不 少学生学习起来感到吃力。后进生转化工作是班级工作的重要环节，是班主任作好班级工作的关键。本学期本人在班级管理上，要把转化后进生放到到首位，可以说在时间及精力的投入上要多，通过教师和家长的积极努力，积极帮助后进生。 一、班级后进生情况分析： 从后进生家长的情况来看，大部分家长工作比较忙，文化层次较低，对学生的辅导基本没有。那么本班的后进生大部分属于家长不管，学习不自觉的情况。我班学习较差的学生有：黎志峰，叶文婷等。纪律较差的有严威达，谢上杰等。学生虽然处于青春叛逆期，但争当个好学生的愿望却是人人都有的，他们单纯、比较听老师的话。只要老师恰当引导，多鼓励，多辅导，就能取得理想的成绩，本学期我主要制定以下计划。 二、后进生形成的原因： （一）、家庭原因： 1、家长教育观念上的错误。作为家长望子成龙盼女成凤的愿望是对的，但有的父母不顾及子女的学习基础和智力水平，把自己的一切愿望无条件地全部寄托在子女身上，“严管”导致“怕学”、“厌学”。 2、家庭教育的失职。父母是孩子的第一任老师，父母的言行将直接影响着孩子。有的父母忙于工作，忙于买卖，无瑕顾及子女的学习，或将子女的教育“全权委托”给学校，家庭从不管教，任其发展。更有不少父母对子女缺乏正确的引导，要么过于溺爱袒护，百依百顺，要么严加管束，不准越雷池一步，稍有不顺，动辄打骂、恫吓，这些会使学生缺乏安全感和归属感，形成不健全的个性，无法养成良好的学习习惯。 ３、两代人之间存在着代沟，相互之间的沟通困难。父母整天
载体构建流程
载体构建SOP流程: GenBank查询目的基因序列→根据ORF序列利用引物设计软件设计引物→表达目的基因的组织或细胞总RNA提取→RT-PCR获取目的基因→酶切目的基因和载体→分别纯化酶切的目的基因和载体并建立连接反应→转化→初步筛选阳性克隆→阳性克隆测序→测序正确的质粒保种并重提质粒 I.获取目的基因/序列片段 一.获取序列信息 通过GENBANK数据和生物信息的方法设计目的基因或目的片段引物（shRNA、miRNA）。 PCR引物的设计原则： ①引物应用核酸系列保守区内设计并具有特异性。 ②产物不能形成二级结构。 ③引物长度一般在15~30碱基之间。 ④G+C含量在40%~60%之间。 ⑤碱基要随机分布。 ⑥引物自身不能有连续4个碱基的互补。 ⑦引物之间不能有连续4个碱基的互补。 ⑧引物5′端可以修饰。 ⑨引物3′端不可修饰。
⑩避免在引物的3’端使用碱基A。 在实际设计引物中由于ORF两末端序列本身的限制，不能完全按照上述理想的设计原则，但也切记引物不能过长或过短。过长的引物不容易打开其二级结构，与模板结合缓慢，也容易形成引物二聚体，通常不超过35bp(不包括酶切位点和保护碱基)。过短的引物特异性差，扩出其它不相关片段，最终很难得到目的片段，通常不短于18bp(不包括酶切位点和保护碱基)。要将目的基因定向克隆至相应载体，需要在上下游引物两端设计不同的酶切位点，由于酶切位点位于线性末端时酶对其识别切割能力大大降低，需依据NEB目录添加相应保护碱基，酶切时可相应增加时间。 二.制备模板 1.分离高质量RNA：成功的cDNA合成来自高质量的RNA。高质量的RNA至少应保证全长并且不含逆转录酶的抑制剂，如EDTA或SDS。RNA的质量决定了能够转录到cDNA上的序列信息量的最大值。现在实验室通常使用Trizol试剂法提取总RNA，可以从多种组织和细胞中提取高质量的非降解RNA。Trizol试剂法可以从最少100个细胞或1mg组织中提取RNA。在逆转录反应中经常加入RNase抑制剂以增加cDNA合成的长度和产量。RNase抑制剂要在第一链合成反应中，在缓冲液和还原剂（如DTT）存在的条件下加入，因为cDNA合成前的过程会使抑制剂变性，从而释放结合的可
后进生转化工作计划及措施
2008学年后进生转化工作计划及措施 陈丽佳 二（8）班新的学年又开始了，今年我担任二年级的班主任和语文课。通过半年来对学生的观察了解。我发现了不少聪明好学的孩子，但也有不少学生学习起来感到吃力。后进生转化工作是班级工作的重要环节，是班主任作好班级工作的关键。本学期本人在班级管理上，要把转化后进生放到到首位，可以说在时间及精力的投入上要多，通过教师和家长的积极努力，积极帮助后进生。 一、班级情况分析： 本班的学生大部分在学前阶段接受的幼儿教育比较少，知识面比较狭窄。从家长的情况来看，大部分家长工作比较忙，文化层次较低，对学生的辅导基本没有。那么本班的后进生大部分属于家长不管，学习不自觉的情况。我班学习较差的学生有：段虹宇、李坚、李源、張德科等。纪律较差的有卢凯、钱程、杨震等。学生年龄虽小，但争当个好学生的愿望却是人人都有的，他们单纯、比较听老师的话。只要老师恰当引导，多鼓励，多辅导，就能取得理想的成绩，本学期我主要制定以下计划。 二、后进生形成的原因： （一）、家庭原因： 1、家长教育观念上的错误。作为家长望子成龙盼女成凤的愿望是对的，但有的父母不顾及子女的学习基础和智力水平，把自己的一切愿望无条件地全部寄托在子女身上，“严管”导致“怕学”、“厌学”。 2、家庭教育的失职。父母是孩子的第一任老师，父母的言行将直接影响着孩子。有的父母忙于工作，忙于买卖，无瑕顾及子女的学习，或将子女的教育“全权委托”给学校，家庭从不管教，任其发展。更有不少父母对子女缺乏正确的引导，要么过于溺爱袒护，百依百顺，要么严加管束，不准越雷池一步，稍有不顺，动辄打骂、恫吓，这些会使学生缺乏安全感和归属感，形成不健全的个性，无法养成良好的学习习惯。
载体构建的基本步骤
载体构建 一．原理 依赖于限制性核酸内切酶，DNA连接酶和其他修饰酶的作用，分别对目的基因和载体DNA进行适当切割和修饰后，将二者连接在一起，再导入宿主细胞，实现目的基因在宿主细胞内的正确表达。 二．操作步骤 1．摇菌 取装有液体培养基的3ml试管两支（依情况而定），每管加40-100μl菌种，过夜摇。2．提质粒 依照提质粒试剂盒中的说明书操作（根据情况最后一步洗脱时可以多洗1-2次）。 3．酶切 按下表加入试剂。 反应所需试剂体积（单位：ul） 质粒10 所需内切酶反应缓冲液 2 所需限制性内切核酸酶 1 H2O 7 将加好的EP管置于37℃保温1-2h。（依照提酶切的具体步骤操作；为了达到最佳酶切的效果，最好根据所选用的酶确定所需要的反应温度） 4．电泳检测 将酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，检测酶切是否成功。 5．连接 如果电泳检测酶切成功的话，则仔细将所需的片段切割下来，将胶体回收（依照胶回收试剂盒说明书操作）；之后将回收的片段和载体连接，连接体系如下： 双蒸水5μL 10×T4 DNA连接缓冲液1μL 载体2μL 酶切后的目的基因1μL T4DNA连接酶1μL 总体积10μL 置于温箱，12-16℃，保温8-16h 6．转化 依照转化具体操作步骤做感受态，将上述连接产物进行转化实验，涂板培养，37℃，12-16h。 7．单克隆检测 （1）挑单克隆
先将AMP从冰箱中取出，待融化后，在3ml装有LB液体培养基的试管中加入3μL的AMP，用枪头混匀；取1.5 mlEP管5支（依情况可以多挑几管），给每支管中加500μL上述培养液，然后用接种环（或黄枪头）挑单克隆，挑完后用枪吹打；之后，将挑好的菌摇4-5小时，至混浊即可。 （2）单克隆检测 以每管摇好的菌液为模板，以原有的引物进行PCR，然后将PCR产物跑电泳，观察电泳图像中那几管的条带正确，将正确条带相对应管的菌液再抽取100μL，加到3ml（有LB液体培养液，AMP+）试管中，过夜摇；第二天重摇，将摇好的菌取1ml于1.5mlEP管中送测序，并保种。 注：①挑单克隆时，一定要挑单一圆润的菌落，有卫星斑的不挑。 ②别忘记往培养基中加AMP。 ③用接种环挑菌后，要在酒精灯上反复灼烧，然后再进行下一次挑菌。 三．注意事项 1．连接产物可短时间在-20℃保存，使用时可以取出进行后续实验； 2．在细胞转化时，冰浴和热激要严格控制好时间； 3．连接反应是DNA重组过程中的关键步骤，其成败的重要参数之一就是温度，因此要控制好连接温度。 4．进行黏末端连接时，会产生一定数量的载体自身环化分子，导致转化菌中过高的假阳性克隆背景。针对这一问题，常采用牛小肠碱性磷酸酶（CIP）去掉载体的5’-磷酸以抑制DNA 片段的自身环化。 参考： 1.刘进元，常智杰，赵广荣,等.分子生物学实验指导[M].北京:清华大学出版社，2002 2.周俊宜.分子生物学基本技能和策略[M].北京：科学出版社，2003：117-120 3.李海英，杨峰山，邵淑丽,等.现代分子生物学与基因工程[M].北京:化学工业出版社，2008:138-142 4.朱旭芬.基因工程实验指导[M].北京：高等教育出版社，2006:134-139
克隆载体表达载体构建详细版
一、稀释引物 1、4℃，15min、13000转离心（先等离心机降温） 2、根据OD值加DD水。 3、静置30min（冰上） 4、准备1.5毫升EP管，并加90ulDD水。 5、向EP管中加10ul引物，震荡离心，-20℃保存。 二、跑MIX检测引物（20ul体系）、 上引物0.8ul 下引物0.8ul Mix 10ul DNA（日本晴）1ul DD水7.4ul 三跑高保真酶（50ul体系） DNAorCDNA 2ul 上引物2ul 下引物2ul 5*buffer 10ul dNTPs 5ul DD水28ul Pfu（最后加）1ul 四胶回收流程 1、在紫外线下切胶，用牙签装入2ml的EP管中。 2、按量加XP2，放在55℃水浴锅中10min，每2min摇匀1次，涡旋，短离。 3、将液体冷却到室温，转移到平衡住中，离心10000转，1min30s，倒掉滤液。 4、加入xp2 300ul，离心10000r，1min30s，倒掉滤液。 5、加入spw700ul，离心10000r，1min，倒掉滤液（重复一次） 6、空转2min，13000r，之后换1.5mlEP管。 7、套上保鲜膜放入37℃烘箱中，30min。 8、加入DD水10ul，静置2min，离心2min，13000r，重复3次，-20℃保存。 五、胶回收产物检测（10ul）体系 上引物0.4ul 下引物0.4ul Mix 5ul 回收产物1ul DD水 3.2ul 六、构建blunt cloning 载体（克隆载体）（4ul 体系） 胶回收产物 3.5ul Blunt cloning 0.5ul 混匀后，PCR：25℃15min 盖子温度50℃
(完整版)后进生转化工作计划及措施
107班后进生转化工作计划及措施 东华初级中学初一A级贾芳 新的学年又开始了，今年我担任七年级7班的班主任。通过对学生的观察了解。我发现了不少聪明好学的孩子，但也有不少学生学习起来感到吃力。后进生转化工作是班级工作的重要环节，在班级管理上，要把转化后进生放到首位，可以说在时间及精力的投入上要更多，通过教师和家长的积极努力，积极帮助后进生。 一、班级情况分析 本班的学生大部分无论在学习与行为习惯上都能跟上学校节奏,一个学期下来都具有良好的学习与行为习惯,但由于有些同学在小学阶段学习基础差,在学习上明显落后,尤其数学这一门,就让十几个同学无法跟上班级.所以班级有十来个后进生,有些是学习差,有些是行为习惯差.这些都需要班主任与各位科任老师积极配合,只要老师恰当引导，多鼓励，多辅导，就能取得理想的成绩。 二、后进生形成的原因： 1、家庭原因： 家长教育观念上的错误。作为家长望子成龙盼女成凤的愿望是对的，但有的父母不顾及子女的学习基础和智力水平，把自己的一切愿望无条件地全部寄托在子女身上，“严管”导致“怕学”、“厌学”。两代人之间存在着代沟，相互之间的沟通困难。父母整天忙于工作，由长辈带，长辈过于溺爱，导致本班有的学生过于娇惯。学习自觉性较差。 2、学生原因：有的学生属于智力相对低一点的学生，进入初一年级以后，学习的知识越来越多，学生出现了怕学的情况。针对这样的问题，要
对学生进行积极的鼓励，帮助他树立学习的信心。 三、解决措施： 1、聚焦对象，查明落后根源。 有的放矢，才能百发百中。我必须逐个聚焦、全面地认识这些学困生。一想到这些学生，我的眼前就出现了一个个鲜活的面孔。把这些暂时在我心中定位为学困生一组一组地集中坐在一起，不管是上课和下课，尽量做到：目光多关注，机会多给予，鼓励多用心，纪律多重复，奖励多偏心，谈心高频率等。 2、找准突破口，稳步提高 学困生的学习之所以落后，比较根本的因素是学习方法和方式上存在问题。我对观察结果作了归纳：一、观察不仔细，盲目信任自己；二懒惰思想严重，不舍得花时间逐个对照课本中的词语，将所有的词语都先带个头，然后撇开课本自顾自写，这样往往导致要错就错一长串。三、没有检查习惯，写好后合上本子就完事。所以写好作业后必须仔细检查。 3、树立榜样，激发兴趣 树立榜样，激发学生学习兴趣，塑造“赶、帮、超”的学习氛围是许多教师的一项绝招。在学困生的辅导上，也要用“赶、帮、超”三个字。每节课表扬那些及时做作业，字迹工整的学生，而且这被表扬的学生对象不断地更换。这样，给学困生一个暗示：同学们一个个都能养成良好的习惯，受到老师的称赞，我也要努力这样做！ 4、家校合力，共同促进。 通过和几个学困生的家长个别接触，我发现他们大都有破罐子破摔的
慢病毒载体包装构建过程
慢病毒载体包装构建过程 原理：慢病毒载体可以将外源基因或外源的shRNA有效地整合到宿主染色体上，从而达到持久性表达目的序列的效果。在感染能力方面可有效地感染神经元细胞、肝细胞、心肌细胞、肿瘤细胞、内皮细胞、干细胞等多种类型的细胞，从而达到良好的的基因治疗效果。对于一些较难转染的细胞，如原代细胞、干细胞、不分化的细胞等，使用慢病毒载体，能大大提高目的基因或目的shRNA的转导效率，且目的基因或目的shRNA整合到宿主细胞基因组的几率大大增加，能够比较方便快捷地实现目的基因或目的shRNA的长期、稳定表达。 概念：慢病毒载体是指以人类免疫缺陷病毒-1 (H IV-1) 来源的一种病毒载体，慢病毒载体包含了包装、转染、稳定整合所需要的遗传信息，是慢病毒载体系统的主要组成部分。携带有外源基因的慢病毒载体在慢病毒包装质粒、细胞系的辅助下，经过病毒包装成为有感染力的病毒颗粒，通过感染细胞或活体组织，实现外源基因在细胞或活体组织中表达。 辅助成分：慢病毒载体辅助成分包括：慢病毒包装质粒和可产生病毒颗粒的细胞系。 慢病毒载体包含了包装、转染、稳定整合所需要的遗传信息。慢病毒包装质粒可提供所有的转录并包装RNA 到重组的假病毒载体所需要的所有辅助蛋白。为产生高滴度的病毒颗粒，需要利用表达载体和包装质粒同时共转染细胞，在细胞中进行病毒的包装，包装好的假病毒颗粒分泌到细胞外的培养基中，离心取得上清液后，可以直接用于宿主细胞的感染，目的基因进入到宿主细胞之后，经过反转录，整合到基因组，从而高水平的表达效应分子。 基本原理：慢病毒载体系统由两部分组成，即包装成分和载体成分。
包装成分：由HIV-1基因组去除了包装、逆转录和整合所需的顺式作用序列而构建，能够反式提供产生病毒颗粒所必需的蛋白。包装成分通常被分开构建到两个质粒上，一个质粒表达Gag和Pol蛋白，另一个质粒表达Env蛋白，其目的也是降低恢复成野生型病毒的可能。将包装成分与载体成分的3个质粒共转染细胞(如人肾293T细胞)，即可在细胞上清中收获只有一次性感染能力而无复制能力的、携带目的基因的HIV-1载体颗粒。 载体成分：与包装成分互补，即含有包装、逆转录和整合所需的HIV顺式作用序列，同时具有异源启动子控制下的多克隆位点及在此位点插入的目的基因。 为降低两种成分同源重组恢复成野生型病毒的可能，需尽量减少二者的同源性，如将包装成分上5′LTR换成巨细胞病毒(CMV)立即早期启动子、3′LTR换成SV40 polyA等。 一、实验流程（1和2为并列步骤） 1.慢病毒过表达质粒载体的构建 设计上下游特异性扩增引物，同时引入酶切位点，PCR(采用高保真KOD酶，3K内突变率为0%)从模板中（CDNA质粒或者文库）调取目的基因CDS区（coding sequence）连入T载体。将CDS区从T载体上切下，装入慢病毒过表达质粒载体。 2.慢病毒干扰质粒载体的构建 合成siRNA对应的DNA颈环结构，退火后连入慢病毒干扰质粒载体 3. 慢病毒载体的包装与浓缩纯化 制备慢病毒穿梭质粒及其辅助包装原件载体质粒，三种质粒载体分别进行高纯度无内毒素抽提，共转染293T细胞，转染后6 h 更换为完全培养基，培养24和48h后，分别收集富含
后进生转化计划与措施
后进生转化计划及措施 一、指导思想 为了进一步贯彻“两全”方针，实施素质教育，营造全社会关心、支持教育发展的良好氛围，让每一位学生健康、和谐发展，提高教育质量，根据本段的实际情况，做好后进生转化工作。 二、后进生转化工作领导小组 略 三、工作目标 1、力争后进生转化面达到40%； 2、九年级毕业考试合格率达80%以上； 3、培养后进生树立远大的理想，养成良好的学习习惯和行为习惯； 4、七、八年级各科成绩合格率达75%以上。 四、我校后进生情况分析 后进生比率占全校30%左右，后进生的特点主要表现： 1、自卑感强。后进生由于各方面较差，受到批评多，父母的训斥、怒骂，同学的讽刺、挖苦，加上某些教师的“另眼相看”，使他们感觉低人一等，进而自暴自弃； 2、逆反心理较强。因为深感别人对自己的轻视，例如：学生认为违反纪律是“勇敢”，向老师反映是“出卖朋友”等，他们在处理同学关系时重感情、讲义气。在日常道德行为上言行不能统
一。 3、认识特征上特别是认识能力低下，对道德、法纪愚昧无知，常常是非常模糊或颠倒，形成错误的人生观。 4、表现学习上，学习水平、能力水平、基础都比较差，学习习惯及学习心态偏差，普遍缺乏自信心、意志力和成就动机。 学校后进生产生的主要原因有： 1、学生本身素质差，不求上进，觉悟低。 2、家庭的不良影响和社会的不良影响。 3、教师教育不得法，师生关系紧等造成的恶果。 4、后进生的形成固然与家庭、社会学生等因素有关系，但与教师的教育思想、教育态度和方法更有直接的关系，正如霍姆林斯基所说：“教育才能的基础在于深信有可能成功地教育每个儿童，我不相信有不可救药的儿童、少女和男女青年，事实上，后进生也有其长处和闪光点，教师应该能够做好每一个后进生的转化工作。 工作措施与方法： ㈠动之以情，消除戒备心理。 消除戒备心理的唯一途径是教师对后进生爱得真，爱得深，将严格要求渗透在爱之中，教育实践告诉我们，爱是一种最有效的教育手段，教师情感可以温暖一颗冰冷的心，可以使浪子回头，当学生体验到老师对自己的一片爱心和殷切期望时，他们将变得“亲其师而信其道”。
植物遗传转化方法和转基因植株的鉴定
植物遗传转化方法和转基因植株的鉴定 金万枚 巩振辉 李桂荣 张桂华 (西北农业大学 陕西杨陵 712100) 提 要 对现有主要植物遗传转化方法和转基因植株的鉴定进行了比较分析,并对它们在植物遗传转化中的前景进行了展望。 关键词 植物;遗传转化方法;转基因植株;转基因植株鉴定 人们可通过有性杂交,物理化学诱变或自然变异来创造新物种和新品种。但常常存在着杂交不亲和或杂种不育而造成的生殖隔离,也存在诱变的非定向性。采用遗传转化技术,将所要求的外源目的基因导入受体植株,并通过对转化植株的鉴定选择,从而创造出人类所需要的新品种或新物种。植物遗传转化方法和转基因植株的鉴定是植物遗传转化的重要环节。关 3国家自然科学基金资助,项目编号39770522。 优质小麦品质的决定性因素;其次要有较强的生活力,保证营养生长健壮。 3.3.2 播种 研究表明,适当晚播和增加密度能在稳定产量的基础上提高小麦品质。根据我省实际,关中优质专用小麦播量应控制在每亩6～8kg,渭北应控制在9kg。播期可依据实际情况较当地常规适播期推迟2～3d。提倡机械以精量半精量播种。 3.4 灌水 灌水对小麦品质的影响比较复杂,尤以抽穗至成熟期间影响最大,此期灌水会降低蛋白质含量,对沉淀值等加工品质也不利,但如果氮量充足或灌水与施氮结合则蛋白质含量不下降或下降很慢。因而施肥上的前氮后移也为后期合理灌水提供了条件。中国农业大学曾研究出一套节水高产栽培技术,小麦春季可只灌一次,并将灌水时期移至孕穗期;若特别干旱,可在拔节期和开花期分别灌水。这种灌水制度与前氮后移的施肥方法配合起来,有利于优质专用小麦生产。 3.5 地膜覆盖 地膜覆盖栽培能使小麦产量大幅度提高,对品质的影响这方面研究还较少。陕西省农科院小麦中心的初步研究表明,小麦覆膜后籽粒容重有不同程度提高;蛋白质含量与正常露地播种没有差异;覆膜不影响不同生态类型品种的干、湿面筋值和沉淀值;但不同生态类型品种之间籽粒容重、蛋白质含量、干、湿面筋值和沉淀值存在较大差异。优质专用小麦可以采用地膜栽培,但不应忽视地膜覆盖后对小麦生育期及农艺性状的影响,比如植株增高,应采取化控措施,在小麦返青～起身期,喷施壮丰安防止倒伏;再如部分病虫害发生的提前与危害加重问题,应及时开展病虫防治,减少对产量和品质的影响。同时提供麦收前一个月揭膜,减少地膜污染。 3.6 病虫害防治 优质专用小麦病虫害的防治,应尽量减少化学药品残苗,不要影响食用品质。应坚持综合防治的原则,要采用农业防治、物理防治和生物防治措施,减少化学药剂防治次数;选用高效低毒低残留农药;收获前20d以内严禁施药;使用农药增效剂,提高防治效果。 3.7 收获 收获是优质专用小麦栽培的最后一个环节;也是比较关键的环节。要做到单收、单贮、单独销售,实现优质优价优加工。
后进生辅导主要措施4篇
后进生辅导主要措施4篇 后进生辅导主要措施第1篇 后进生的智力因素体此刻感知笼统，思维缓慢，他们对所学资料的理解、应用等本事较差，因而学生往往出现英语太难了，我是学不好的。这节课我听不懂。我比别人笨，怎样也学不会。长期发展下去，势必造成成绩落后。就随即产生自卑、畏惧等心理。所以，教师应根据后进生的特征进行转化，因势利导，做到因材施教。后进生非智力因素体此刻学习上没有兴趣，上课好动、注意力不易集中、不求甚解，解决困难问题意志薄弱，没有养成良好的学习习惯等。他们并不是朽木不可雕的差生。他们的差主要是行为、习惯、态度等方面的缺陷。 一、情景分析 本班后进生占有必须的比例，造成他们成绩差的原因是多方面的。基础打得不够扎实，遗忘性差，记忆力差，家长不够重视其学习等等综合因素。这部分学生大多有共同的特点，主要表现为：一是自卑感强。后进生由于各方面较差，受到批评较多，进而产生自暴自弃心理，总觉得自我低人一等。二是作业完成得较差，怕受批评又学会了撒谎，上课发言也不进取。 二、转化措施： 针对班中这些后进生，我确定了如下的辅导措施： 1、学校与家庭齐抓共管。作为教师应当顺应时代的要求，切实
转变教育观念，树立适应时代要求的现代教育观。要认真学习教育法规和教育理论，认识到转化一个后进生比培养一个三好生更为重要、更有价值。要主动与家庭密切联系，可利用家长会，汇报该生在校的学习情景，让家长协助教师教育和督促自我的孩子努力学习。使学校教育与家庭教育有机地结合起来，构成齐抓共管、立体化、全方位的教育工作网络。 2、课后多和差生交谈，态度要和蔼，使后进生愿意接近教师，经常和教师说说心里话，有利于教师对学生的了解，有利于做好后进生的转化工作。 3、开展互帮互学的活动，座位的排列尽量让中、差生创设一个好的学习环境，充分发挥课后小教师的作用。 4、对差生的缺点批评要恰当得体，切忌不可伤害，不能让其他同学嘲笑他们，嫌弃他们。 5、分从次设计目标，给差生制订能够完成的目标，使其能真正感到成功的喜悦。 6、利用课余时间帮忙差生辅导，尽力使他们的成绩有所提高，让他们认识到我能行。 7、激发学习兴趣。古人云：知之者不如好之者，好之者不如乐之者。所以仅有具有了动机和兴趣才能去从事各种活动，从而到达必须的目的。兴趣是人们进取探究某种事物的认识倾向，是学生进行认识活动的动力之一。课堂教学必须有教强的吸引力，才能调动学生的学习进取性。这就要靠教师很好地组织、精心设计。同时适度的开展
表达载体的构建方法及步骤
表达载体的构建方法及步骤 一、载体的选择及如何阅读质粒图谱 目前，载体主要有病毒和非病毒两大类,其中质粒DNA 是一种新的非病毒转基因载体。一个合格质粒的组成要素： （1）复制起始位点Ori 即控制复制起始的位点。原核生物DNA 分子中只有一个复制起始点。而 真核生物DNA 分子有多个复制起始位点。 （2）抗生素抗性基因可以便于加以检测，如Amp+ ,Kan+ （3）多克隆位点MCS 克隆携带外源基因片段 （4）P/E 启动子/增强子 （5）Terms 终止信号 （6）加poly（A）信号可以起到稳定mRNA 作用 选择载体主要依据构建的目的，同时要考虑载体中应有合适的限制酶切位点。如果构建的目 的是要表达一个特定的基因，则要选择合适的表达载体。 载体选择主要考虑下述3点： 【1】构建DNA 重组体的目的，克隆扩增/基因表达，选择合适的克隆载体/表达载体。【2】.载体的类型： （1）克隆载体的克隆能力－据克隆片段大小（大选大，小选小）。如<10kb 选质粒。（2）表达载体据受体细胞类型－原核/真核/穿梭，E.coli/哺乳类细胞表达载体。
（3）对原核表达载体应该注意：选择合适的启动子及相应的受体菌，用于表达真核蛋白质时注意克服4个困难和阅读框错位；表达天然蛋白质或融合蛋白作为相应载体的参考。【3】载体MCS 中的酶切位点数与组成方向因载体不同而异，适应目的基因与载体易于链接，不能产生阅读框架错位。 综上所述，选用质粒（最常用）做载体的5点要求： （1）选分子量小的质粒，即小载体（1－1.5kb）→不易损坏，在细菌里面拷贝数也多（也有大载 体）； （2）一般使用松弛型质粒在细菌里扩增不受约束，一般10个以上的拷贝，而严谨型质粒<10个。 （3）必需具备一个以上的酶切位点，有选择的余地； （4）必需有易检测的标记，多是抗生素的抗性基因，不特指多位Ampr（试一试）。（5）满足自己的实验需求，是否需要包装病毒，是否需要加入荧光标记，是否需要加入标签蛋白，是否需要真核抗性（如Puro、G418）等等。 无论选用哪种载体，首先都要获得载体分子，然后采用适当的限制酶将载体DNA 进行切割，获得线性载体分子，以便于与目的基因片段进行连接。 如何阅读质粒图谱 第一步：首先看Ori 的位置，了解质粒的类型（原核/真核/穿梭质粒） 第二步：再看筛选标记，如抗性，决定使用什么筛选标记。 （1）Ampr 水解β－内酰胺环，解除氨苄的毒性。 （2）tetr 可以阻止四环素进入细胞。 （3）camr 生成氯霉素羟乙酰基衍生物，使之失去毒性。 （4）neor（kanr）氨基糖苷磷酸转移酶使G418（长那霉素衍生物）失活
后进生转化工作计划及措施
后进生转化工作计划及措施 根据学校提出的“一切为了学生，为了学生的一切，为了一切学生”的办学思想，学校教育应遵循“面向全体学生”、“不求个个成材、力求个个成人”的办学宗旨，针对学校“后进生”群体，采取切实可行的措施，努力培养德、智、体、美、劳全面发展的社会主义建设者和接班人。 一、班主任工作 每学期由政教处负责定时召开班主任会议，专门研究后进生转化工作，并检查各班落实后进生转化工作的实际效果。要求每位班主任在学期初拟定本班后进生转化名单并制定相关措施，学期结束向学校作出对这部分学生开展工作的情况汇报（文字材料），学校将对班主任在这项工作的业绩进行量化评估并纳入其本年度工作考核，各班可根据本班学生特点，制定切实有效的办法，但应注意以下几点： 1、要有高度责任心，并且具备一定的耐心，切忌一曝十寒，半途而废。
2、要对学生差的原因进行深入细致的了解，对其家庭情况、社会交往情况进行调查，全面、详细地掌握学生的第一手资料。 3、对待后进生应尊重他们“用放大镜看学生的优点，用缩小镜看学生的缺点”。应采取正面教育为主，教育方法切忌简单、粗暴。 4、多管齐下，充分利用学校、家庭、社会网络教育的功能，尤其要密切与家长的联系，加强家庭教育。 二、课任老师工作 各任课老师对待本年级、本班后进生的学习绝不能不管不问、放任自流，而应努力遵循学校提出的“绝不放弃一名学生，让三中每一名学生都能得到尊重、都能感悟成功”的口号，对后进学生采取帮扶措施，使他们学习成绩得以提高，特提出以下几方面要求： 1、课任老师不能歧视任何一名成绩落后的学生，而应主动关心帮助他们努力提高学习成绩。 2、每名老师每学期应选定若干名后进生进行重点帮扶，如采取个别辅导、面批面改等形式，对这些学生的学习方法、学习习惯进行科学指导。
后进生转化措施
（一）后进生转化措施 1、取得任课教师的协助，学生家长的配合（经常上门家访）。 2、感情投资 （1）多与后进生交流，了解后进生的思想、学习和生活。 （2）对他们取得的成绩即时表扬，让他们树立起信心。 （3）对他们所犯错误和缺点即时指出和批评。 （4）多注重后进生的学习 A、课堂提问、练习多给机会（难度较浅的）。 B、课后作业的布置与众不同。 C、作业尽量面批。 D、利用课余时间辅导功课。 3、坚持不懈，持之以恒。 后进生的思想波动较大，各方面表现反反复复，这样教师必须经常不间断实行转化。我相信只要我们教师有一份爱心和耐心后进生一定能迎头赶上。 （二）优秀生提升措施 1、增强对优秀生的思想教育。 优秀生学习成绩好，经常得到学生的赞扬、敬慕，家庭、学校宠爱、呵护，这样易使他们产生优越感，总觉得自己已经是很好了，而忽视了自我提升，自我超越的过程。所以，我们要在本学期增大对优秀生的理想教育、人际关系教育、心理健康教育等各方面的工作，增强对优秀生的培养和教育。 2、要适当评价，准确引导。 教师对优秀生的评价要有针对性和适当性，对优秀生学习成绩的评价要适当，不能好到极处，也不能不予理睬，要具体公正。对优秀生其他方面的成绩要多注意留心，并指出哪点好，为什么好。教师要有意识地经常和优秀生谈心、沟通，传输一些观点，让他们知道教师赞扬什么推崇什么。如，奉献爱心、关心同学、协助后进、平等待人、谦虚谨慎、志存高远都是老师推崇和向往的。 3、培养优秀生的团队精神和合作意识。 优秀生应作为班级体中的普通一员，不能越出界外，要树立班级的集体感和荣誉感，要经常组织他们参加集体完成的项目和活动，感受到集体意识和成功的
质粒构建流程
质粒构建流程 一、引物设计 1）取得目的基因序列，可选用数据库NCBI 2）软件分析目的基因可用酶切位点。使用primer5分析出序列不包含的酶切位点，即为可用没切位点。 3）选择载体。根据转染细胞和实验室资源，选择合适载体。如pcDNA3.1(+)， 4）选择酶切位点。对照目的基因可用酶切位点和载体上的酶切位点，选择二者共有的作为备选。载体上两个酶切位点的距离应有几十bp以上，选实验室常用酶切位点。 5）使用primer5设计目的基因引物，目的产物应包含从启动子到终止子全部碱基。 6）根据选择的酶切位点，查找对应的酶切位点保护碱基，将对应片段添加到设计的引物两端，注意酶切位点的前后顺序。一般选择三个保护碱基。 7）引物设计完成，送公司合成。 二、目的片段获取 1. RNA提取 试剂盒：Bioteke 高纯总RNA快速提取试剂盒离心柱型（裂解液RL 4℃、漂洗液RW -20℃保存） 准备：冰盒、4℃预冷离心机、EP管2套、吸附柱RA一套 操作步骤： 1）将1000μl裂解液RL加入细胞中，混合5min。 2）加200μl氯仿混合，震荡15s，室温孵育3min。 3）4℃，12000rpm离心10min。 4）最上层水相转移至新EP管中（体积约550μl） 5）加入1倍体积（550μl）70%乙醇，混匀 6）全部转移到套收集管的吸附柱RA中，4℃，10000rpm离心45s 7）弃废液，重套收集管，加500μl去蛋白液RE，12000rpm离心45s 8）弃废液，重套收集管，加700μl去漂洗液RW，12000rpm离心60s 9）弃废液，重套收集管，加500μl去漂洗液RW，12000rpm离心60s 10）弃废液，重套收集管，12000rpm空离2min 11）吸附柱放入新EP管，加50μl RNase free water于膜上，室温放置2min 12）4℃，12000rpm离心60s 13）点样：5μl RNA+ 1μl 10×buffer，1.5%琼脂糖凝胶电泳，100V，3min，可见3条亮带。14）-20℃保存 2.RNA反转录 试剂盒：TaKaRa primescript RT reagent kit with gDNA eraser（-20℃保存） 准备：冰盒，②④⑤⑥取出解冻，①③为酶不可取出，预冷离心管 操作步骤： 1）基因组DNA去除（10μl体系） ② 5×gDNA eraser buffer 2μl ① gDNA eraser 1μl
后进生生转化方案及措施
兰溪中学后进生转化方案及措施 一、总体思想： 对后进生的管理是当前我校管理中十分棘手而又极为重要的内容之一，转化不 力的原因是缺乏对其真正、足够的了解，难以对症下药。因此，我们应首先找出造 成后进生现象的四大影响因素，即学校因素、家庭因素、社会因素和自身因素，并 分别对各种因素的影响进行具体分析，采取应对之策。后进生工作任重道远，尤其 是作为学校教学管理者应充分认识现今后进生的心理特征，从实际出发，因材施教， 制定一套行之有效的管理体系和做好后进生的转化工作。 二、帮扶领导小组 组长：金才亮 副组长：7-9年级组李又明 4-6年级组吴燕 1-3年级组邱云 年级蹲点负责人：鄢小春郑勤民王申平王森胡建平李新文张怡球 王宇春袁小涓 成员：全体教师 三、完善后进生管理体系建立制度，明确职责 根据县局有关文件要求，结合我校实际，在原有的后进生、特长生档案建立的基础上，进一步强化机制，建立健全有效的教育和转化后进生工作方案。 1、建立后进生个人档案。 以班级为单位，对学生进行全面调查，认真排查后进生现状，按学习、行为规范等后进状况排查分类，建立个人档案。 2、制定后进生结对帮扶转化制度。 对已确认的后进生，各班分类组织安排结对帮扶，实行承包职责制，行政人员包班级，班主任、任课教师包人头，做到明确转化目标，职责落实到人。 3、强化跟踪流程管理。 对于后进生的转化工作，各班级要实行跟踪调查反馈制度，建立后进生转化状况记载簿，建立后进生流程管理记录，对其在家庭、社会、学校的成长过程进行跟踪调查，及时鼓励与引导。 四、具体转化措施 1、正确认识和看待后进生转化的重要性。每个学期初召开转化后进生专题会，进行思想动员。因兰溪中学周边环境造成特殊的学生资源，故转化后进生成功与否问题对学校提高教学质量的效果尤为重要，所以我校对后进生的转化工作让老师们必须有正确的思想认识，必须放在教学工作首要位置。 2、分层走班，因材施教。每学期初分层走班都以上一个学期期末考试文化课摸 底结果为依据，按照各学科学生知识和综合智力能力水平，同时结合学生的意愿把 部分学科（语、数、外）分成三个层次，组成A、B、C三个层次的新教学班。但“走 班”并不打破原有班及，只是在学习这些部分学科文化课的时候，按学生各自的知