细胞培养工作流程

一、Vero细胞复苏流程

1、准备

1、1工作地点检查:

检查台面、地面就是否洁净,确认无不相关物品。

1、2设施检查:

确认空调、传递窗工作状态完好。

1、3层流罩准备:

开启层流罩,观察其运行就是否正常,用消毒剂将台面、墙面、地面、保护帘及层流罩内设备进行清洁消毒。并运行30分钟后开始生产操作。

1、4操作工具与试剂检查:

检查本次操作所用灭菌物品外包装就是否严密,就是否在效期内。检查本次操作所用溶液/试剂瓶内就是否有异物,瓶表面就是否有裂纹,瓶塞就是否松动,溶液名称、批号、数量、有效期就是否符合要求。合格后用消毒剂擦拭外表面后拿入层流罩。复苏、换液用液体:MEM液、新生牛血清、3%谷氨酰胺溶液、庆大霉素、7、5%NaHCO3溶液。

1、5复苏用水准备:

(1)融化种子用溶液:按1L/1支种子准备39±1℃含0、1%新洁尔灭溶液。

(2)百级内消毒种子用水:1L/1支种子准备36、5±1℃含0、1%新洁尔灭溶液。

1、6操作人员进入层流罩:

穿一层无菌连体服并戴无菌手套,静止5分钟后方可操作。

1、7溶液使用前处理:

辅助人员用止血钳夹酒精棉球点燃后消毒瓶塞外表面,旋转1周,操作人员将翻塞翻开,再用点燃的酒精棉球消毒瓶口及瓶塞。

2、配液

配方

辅助人员将配制所需的液体按顺序打开后放至盐水瓶架上,操作人员按配方加量用吸管依次吸取新生牛血清等溶液至MEM液中,每吸完一种液后辅助人员应立即用无菌翻塞将其盖紧,在其瓶身用记号笔注明用量、日期等。复苏液及生长液配完后辅助人员立即用无菌翻塞将其盖紧,充分混匀待用。

辅助人员打开混匀后的复苏液,放置盐水瓶架上。操作人员将培养瓶(T175)盖打开,倾斜或直立放置酒精灯附近,将复苏液用吸管吸取或直接倒入其中(加量:0、3～0、4 ml/cm2),拧紧瓶盖并放在恒温室待用。

3、种子支领

依据种子库管理规定进行支领,依据生产指令按数量支领。本操作规格按复苏1支细胞种子到1个T75 cm2瓶规定各项操作。若支领数量变化培养瓶面积按比例调整,后续操作各项用量按比例调整。

4、种子速溶

种子库管理员从细胞库刚取出细胞种子时,在液氮罐颈部停留几秒,核对所支领的种子标签内容与细胞种子申领单上的内容就是否一致。核对无误后,迅速全部浸入39±1℃含0、1%新洁尔灭溶液(1000ml /支种子),顺时针不停摇动直至融化,将每次的速融时间控制在1分钟内。然后用75%的酒精消毒容器外表面,放置在传递窗内风淋2分钟。同时马上通知细胞区人员将种子从传递窗取走。迅速传递并浸入百级内36、5±1℃含0、1%新洁尔灭溶液中,百级内操作人员取出擦干。

5、移种

操作人员左手拿冻存管,右手打开,用1ml的吸管将融化后细胞种子吸出,缓慢滴加到1个T75 cm2培养瓶中,拧紧瓶盖。

6、培养

辅助人员在培养瓶上注明细胞名称、批号、代次、复苏日期、瓶编号等信息后及时放置恒温室静置培养。24小时内(细胞贴壁80%)进行换液。

7、清场

将废液倒入下水道,废物、待清洗物品由传递窗传到粗洗间, 层流罩内用75%酒精消毒,再用纯水清洁整个房间。

8、复苏后观察

第二天观察培养液颜色(PH)就是否正常,在显微镜下观察细胞形态数量。

9、换液

换液前准备与复苏前相同。观察培养液颜色就是否正常,有无漏液,瞧细胞就是否生长良好。用消毒剂擦拭表面后放入层流罩,操作人员进入层流罩换好无菌连体服后静止5分钟方可操作。

辅助人员用酒精棉球外焰消毒瓶塞外表面,操作人员将翻塞翻开,再用火焰消毒瓶口及瓶塞。操作人员右手拿住培养瓶底部,左手拧开瓶盖,轻轻翻转培养瓶使上清液沿其顶面流至废液缸。辅助人员打开装生长液的瓶口,并将其在火焰外焰旋转1圈后,放置盐水瓶架上待用。操作人员将培养瓶盖拧松放置酒精灯附近,将生长液用吸管吸取或直接倒入其中(加量:0、3～0、4 ml/cm2)。拧紧瓶口,平放到恒温室培养。最后按规定清场