生物化学实验原理与技术

生物化学实验原理与技术

中国农业科学院研究生院

生物化学与分子生物学教研室

1999年 12月

目录

蛋白质化学部分

实验一多酚氧化酶（PPO）的分离纯化 (4)

实验二多酚氧化酶（PPO）的活性测定 (8)

实验三考马斯亮蓝G－250法测定蛋白质浓度 (10)

实验四 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳测蛋白质分子量

及蛋白质的纯度鉴定 (12)

实验五等电聚焦电泳法测定蛋白质等电点 (16)

实验六多酚氧化酶（PPO）的同功酶检测 (19)

免疫学部分

实验七多酚氧化酶（PPO）抗体的制备 (24)

实验八多酚氧化酶（PPO）扩散免疫电泳 (31)

实验九多酚氧化酶（PPO）火箭免疫电泳 (33)

实验十 Western bloting技术 (40)

实验十一亲和层析法分离纯化胰蛋白酶 (44)

核酸化学部分

实验十二植物染色体DNA的提取 (52)

实验十三质粒DNA的提取与纯化 (54)

实验十四 DNA片断的酶切技术 (57)

实验十五 DNA片断的连接技术 (59)

实验十六受体菌感受态细胞的制备 (61)

实验十七重组DNA片断的转化、克隆及筛选 (62)

作业

实验结束后按实验指导的格式写出实验报告，其中包括：实验目的与原理；材料与方法；实验结果与分析；实验结果讨论。实验结果照片、图表等要附在实验报告中。

蛋白质化学部分

实验一多酚氧化酶（PPO）的分离、纯化

一、实验原理与目的

多酚氧化酶（儿茶酚酶），它是植物组织内广泛存在的一种含铜氧化酶，位于质体、微体内，可参与植物生长、分化和种皮透性的调节。植物受到机械损伤和病菌侵染后，PPO催化酚与O

2

氧化形成为醌，使组织形成褐变，以便损伤恢复，防止或减少感染，提高抗病能力。醌类物质对微生物有毒害作用，所以伤口醌类物质出现是植物防止伤口感染的愈伤反应，因而受伤组织一般这种酶的活性就会提高。多酚氧化酶的活性与植物抗病有一定联系，植物免疫与动物免疫的机理不同，后者是抗体与抗原的关系，前者的免疫机理现在认为主要是产生对病源有害物质。已发现具有免疫作用的有害物质是多种多样的，概括为两种类型，其中的一种类型就是原有的有毒物质，植物本身含有的一些对病菌有抑制作用，使病菌无法在寄主中生长。很早就发现酚类化合物与抗病有明显的相关，例如原儿茶酸与儿茶酚对有色洋葱磷茎炭疽病菌的抑制作用。多酚氧化酶也可与细胞内其他底物氧化相偶联，起到末端氧化酶的作用：

＋+醌

2O

底物+酚

2

但是PPO的存在是水果、蔬菜褐变的主要原因之一，影响一些经济植物产品的质量。在制茶加工工业中这种酶有重要作用，在制茶时要立即杀青，防止多酚氧化酶的活性，避免醌类物质的产生，保持茶色清香。因此，许多学者对此进行研究，并从一些植物组织中分离纯化这种酶，研究酶的理化性质和生化特性。

本实验将采用马铃薯为主要材料，通过细胞组织破碎匀浆、过滤、离心、硫酸铵沉淀、透析等步骤获得PPO的粗酶液；再经过阴离子交换柱DEAE

－纤维素DE－52柱层析、聚乙二醇反渗透浓缩、葡聚糖凝胶Sephadex G-200柱层析获得PPO的纯酶液；然后对其进行酶蛋白含量检测、酶活性测定、聚丙烯酰胺凝胶电泳和PPO同功酶的分析，以及通过免疫学的分析对多酚氧化酶（PPO）进行理化、生化特性进行鉴定。

通过本项实验，学习和了解蛋白质的提取、分离、纯化、鉴定的基本原理和方法，掌握相关仪器设备的操作使用，以及蛋白质的提取、分离、纯化、鉴定的系统技术。

二、材料

（1）马铃薯（大约每小组100-200g）

（2）试剂：

0.03M磷酸缓冲液pH6.0

（内含0.02M巯基乙醇，0.001M EDTA，5％甘油，1％的聚乙烯

吡咯烷酮）配制时配×10倍的浓缩液1000ml；

固体硫酸铵；

0.03M磷酸缓冲液pH6.0

（内含0.02M巯基乙醇，0.001M EDTA，0.005M MgCl2）配制时配

×10倍浓缩液100ml；

0.02M Tris-HCl缓冲液pH7.4（内含0.001M EDTA）配制时配×10

倍浓缩液1000ml；

NaCl:

聚乙二醇：

DEAE－纤维素 DE52；

葡聚糖凝胶Sephadex G-200:

（3）实验器械与仪器设备：

试管与试管架；

烧杯、玻璃搅棒；

移液管、滴管等；

试剂瓶；

透析袋：

过滤纱布；

层析柱；

植物组织匀浆器；

pH计和pH试纸；

恒流泵；

梯度混合仪；

核酸蛋白检测议；

GL－20C 高速冷冻离心机；

DL－7A 大容量低速冷冻离心机：

三、方法与步骤

（1）粗酶提取：

水果肉组织按1:1（W/V）比例与0.03M磷酸缓冲液pH6.0（内含0.02M巯基乙醇，0.001M EDTA，5％甘油，1％的聚乙烯吡咯烷酮）混合，匀浆后4层纱布过滤，滤液以6000rpm离心10min，弃除沉淀获得酶提取液。

（2）硫酸铵沉淀：

在酶提取液中加入固体硫酸铵使其达到40％饱和度（边加边搅拌达到充分溶解），然后6000rpm离心20min弃除沉淀；离心上清液再加入固体硫酸铵达到70％饱和度（边加边搅拌达到充分溶解），再以6000rpm离心20min，弃除上清液，收集粗酶沉淀；沉淀用0.03M磷酸缓冲液pH6.0（内含0.02M巯基乙醇，0.001M EDTA，0.005M MgCl2）溶解，装入透析袋中用0.02M KCl 溶液透析至无硫酸铵根离子，获得粗酶液供上柱使用。

（3）DEAE－纤维素DE 52离子交换柱层析（DE 52的材料处理、装柱方法、层析方法和原理见实验讲义附）：

选用0.02M Tris-HCl缓冲液pH7.4（内含0.001M EDTA）预先将DE－52柱进行平衡，然后将粗酶液上柱，用0.02M Tris-HCl缓冲液pH7.4（内含0.001M EDTA）洗脱杂蛋白，再换用含NaCl（0.2-0.6 M）的

0.02M Tris-HCl缓冲液pH7.4（内含0.001M EDTA）进行梯度洗脱；收集PPO

活性部分洗脱液，采用聚乙二醇反渗透法浓缩酶液2倍供羟基磷灰石柱层析用。

（4）葡聚糖凝胶Sephadex G-200凝胶柱层析（Sephadex G-200凝胶的材料处理、装柱方法、层析方法和原理见实验讲义的第5页）：

用0.02M Tris-HCl缓冲液pH7.4（内含0.001M EDTA）预先平衡Sephadex G-200凝胶,然后将酶液上柱，用0.02M Tris-HCl缓冲液pH7.4（内含0.001M EDTA）洗脱，收集洗脱液进行酶活性、蛋白质浓度、聚丙烯酰胺凝胶电泳分子量的基本性质分析测定。

实验二多酚氧化酶（PPO）活性测定

一、原理与方法

PPO催化各种酚与0

氧化为醌。本实验是采用邻苯二酚为底物，在 0.2M

2

磷酸氢二钠－0.1M柠檬酸缓冲液pH5.8的反应体系中，PPO催化邻苯二酚形成褐色的醌，在分光光度计410nm处使反应体系的OD值产生变化，通过OD值上升的读数变化确定PPO的酶活大小。

其方法是，在含有4ml pH5.8的0.2M磷酸二氢钠－0.1M柠檬酸缓冲液试管中加入0.05ml 0.05M邻苯二酚溶液,在30℃恒温水浴中预热后加入0.05ml 酶液，反应5分钟，在分光光度计410nm处读取吸光值。在上述条件下，以A410读数，以每分钟增加0.01 OD值定义为一个酶活单位（U）。

二、材料

（1）样品：

多酚氧化酶粗酶液

硫酸铵沉淀组份

DE－52洗脱组份

羟基磷灰石洗脱组份

Sephadex G-200的组份

（2）底物：

邻苯二酚：0.01M邻苯二酚溶液

（3）反应体系：

0.2M磷酸氢二钠－0.1M柠檬酸缓冲液pH5.8

（4）器皿与仪器：

试管、恒温水浴等

分光光度计

三、酶蛋白的比活性

比活性＝酶活单位（U）/mg 酶蛋白

四、记录实验结果

（1）结果列表

多酚氧化酶的提取、分离、纯化表

（2）根据实验结果绘制DE－52和G－200的柱层析洗脱曲线图。

实验三考马斯亮蓝G－250法测定蛋白质浓度

一、实验原理与目的

生物化学实验中，经常需要测定蛋白质的含量，一般常用的蛋白质测定方法有紫外吸收法，双缩脲法和Lawry法等。另一种方法是蛋白质－染料结合法，即考马斯亮蓝G－250法。此方法试剂简单、经济。测定简便快速。具有与Lawry法相当的灵敏度，受溶液中其他物质的干扰很小，可采用对照来消除。

考马斯亮蓝G－250法测定蛋白质浓度的基本原理是：当考马斯亮蓝G－250染料与蛋白质结合时，其存在两种不同颜色（红色与蓝色），红色就转变为蓝色，使染料的最大吸收峰从465 nm移动到595 nm，染料与蛋白质的结合与595 nm的吸收值在一定蛋白质浓度下呈线性相关，其蛋白结合反应在2－3 min内即可完成，而反应生成的复合物在1 h内比较稳定地存在于溶液中，因此，用标准浓度的蛋白测得O.D595值绘制标准曲线，即可求得待测样品的蛋白质浓度。

二、材料与方法

1.材料：

经硫酸铵沉淀获得PPO粗酶液，DEAE－纤维素DE 52分离的酶液和Sephadex G－200分离纯化的酶液样品。

2.仪器与器皿：

分光光度计，分析天平，容量瓶，移液管和试管等。

3.试剂：

（1）考马斯亮蓝G－250蛋白试剂：

称取100 mg考马斯亮蓝G－250溶于50 ml 90％的乙醇中，加入85％（V/V）磷酸100 ml，最后加无离子水或蒸馏水定溶到1000 ml，此溶液可在常温下放置一个月。

（2）蛋白标准液：

称取牛血清蛋白100 mg定溶于100 ml的无离子水或蒸馏水中，制成1000 μg / ml贮备液。再配制成分别为20 μg/ml、40 μ g/ml、60 μg/ml、80 μg/ml、100 μg/ml的蛋白标准液。

4.测定方法与操作步骤：

（1）标准曲线的绘制：

0－100 μg/ml蛋白标准曲线：准确吸取0.5 ml含20、40、60、80、100 μg蛋白标准液，分别放入10 ml的试管中，加5.0 ml考马斯亮蓝G－250蛋白试剂，将溶液混匀，2 min后在分光光度计594 nm处测定其消光值，空白以无离子水或蒸馏水代替。以消光值为纵坐标，蛋白含量为横坐标，绘制标准曲线。

100－1000 μg/ml的蛋白标准曲线的制作方法上述相同。

（2）样品中蛋白质浓度的测定：要求待测样品中的蛋白浓度范围为1－1000 μg/ml之间，若浓度过高时，需要对其进行适当的稀释，再用制作标准曲线的方法对样品进行测定，测定的O.D595值结果由标准曲线求出样品的蛋白质浓度。

实验四 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳测蛋白质

分子量及蛋白质的纯度鉴定

一、实验目的与原理

蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中电泳时，它的迁移取决于它所带电荷以及分子大小和形状等因素。1967年Shapiro等人发现，如果在聚丙烯酰胺系统中加入阴离子去污剂十二烷基磺酸钠（SDS），大多数蛋白质能与SDS按一定比例结合，即每克蛋白质结合1.4 g的SDS，由于十二烷基硫酸根带负电，使各种蛋白质的SDS－复合物都带上相同密度的负电荷，它的量大大超过了蛋白质分子原有的电荷量，因而消除了蛋白质原有的电荷差别，使蛋白质分子电泳的迁移率主要取决于本身的分子量，而与所带电荷无关，在一定条件下，蛋白质的分子量与电泳迁移率间的关系，可用下式表示：

MW＝K（10 -－b m

）

MW－为蛋白质分子量

K－为常数

b－为斜率

m－为迁移率

不同浓度的凝胶适用于不同蛋白质分子量范围，在5％的凝胶中分子量25000～200000的蛋白质；在10％的凝胶中，分子量10000～70000的蛋白质；在15％的凝胶中，分子量10000～50000的蛋白质，其分子量的对数与迁移率呈直线关系。因此，所测分子量范围要选择最适合的凝胶浓度，并尽量选择分子量范围和性质与待测样品相近的蛋白质作标志蛋白。

本实验的目的是对多酚氧化酶的纯化度鉴定及其分子量的测定，通过实验，学习和掌握SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳法蛋白质纯度和分子量的鉴定。

二、材料与方法

1.材料：

硫酸铵盐析沉淀的多酚氧化酶粗酶样品； DEAE－纤维素 DE 52 柱层析的样品；Sephadex G－100柱层析的样品。

2.试剂：

（1）丙烯酰胺（Acr）凝胶贮液：

30g Acr,668mg Bis,加水至100 ml。

（2）10％的SDS溶液

（3）10％的过硫酸铵溶液

（4）四甲基乙二胺（TEMED）

（5）分离胶缓冲液：

将18.15 g Tris溶解后，加5 ml 6 N HCL溶液，定容至100 ml，pH 8.8。

（6）浓缩胶缓冲液：

6 g Tris溶解后，加10 ml 6 N HCL溶液定容至100 ml，pH 6.8。（7）电极缓冲液：

6 g Tris,28.8 g甘氨酸和1 g SDS，加水溶解定容至1000 ml，pH 8.3。（8）样品缓冲液：

1 g SDS，

2 ml 巯基乙醇，5 ml甘油，1 ml 0.1％的溴酚蓝，1 ml 上层胶缓冲液，定容至50 ml。

（9）染色液：

0.25 g 考马斯亮蓝250，溶于含有45％的甲醇，10％的冰醋酸的水溶液中。

（10）脱色液：

7.5％的冰醋酸和10％的甲醇水溶液。

（11）已知分子量的标准蛋白。

3.仪器设备：

电泳仪，垂直电泳槽等。

4.实验方法与步骤：

（1）凝胶制备：

用两块电泳玻璃板制成垂直板槽（注意不能漏胶），垂直放置。将下表列出的的配方，配成分离胶溶液，立即倒入垂直槽，并慢慢加入无离子水，将凝胶液面压平，20 min后凝聚。倒出无离子水，用吸水纸吸干，倒人按表配成的浓缩胶，再插入梳子。

SDS聚丙烯酰胺凝胶的配制（10％）分离胶

浓缩胶

（2）点样：

分别取样品0.1 ml于离心管中，各加入0.1 ml样品缓冲液，在沸水浴中加热2 min，取出待用。将电泳槽接通电源，调节控制器电流达到5 mA。用微量注射器分别吸取0.1 ml不同浓度的标准蛋白样品和实验样品注入样品槽。点样结束后，调节电泳仪电流升到15 mA，当溴酚蓝进入分离胶将电源加到28～30 mA（2～3 mA/em）,保持电流稳定不变，当溴酚蓝迁移到离分离胶底1～2 cm时，即可停止电泳。

（3）染色：

电泳完毕后，取出凝胶板，浸入染色液中，在37℃温箱中保温1 h。倒掉染色液，用脱色液，用脱色液脱掉剩余染料后，倒人脱色液第二天换一次脱色液，24 h后，即可看到清晰的蛋白质条带。

（4）蛋白质迁移率的计算，并与标准蛋白比较：

蛋白质迁移率Rm ＝d2 /d1

d1—溴酚蓝迁移率距离

d2—蛋白质迁移率

以标准蛋白迁移率为横坐标，以其分子量为纵坐标，在半对数坐标纸上作图，可得标准曲线，并估计未知样品蛋白的分子量。

实验五等电聚焦电泳法测定蛋白质等电点

一、实验目的与原理

蛋白质分子在电场中的迁移性质早就用来分离和鉴定蛋白质。但常规的电泳用于受介质成份，pH和离子强度的影响，其分辨率受到限制。而且用蛋白电泳时的迁移率来表征蛋白质的特征并非对所有蛋白质都合适。等电点聚焦（IEF）是在电场中分离蛋白质技术的一个重要发展，等电聚焦实质是在稳定的pH梯度中按等电点的不同分离两性大分子的平衡电泳方法。

在电场中充有两性载体和抗对流介质，当加上电场后，由于两性载体移动的结果，在两极间逐步建立稳定的pH梯度，当蛋白质分子或其他两性分子存在于这样的pH梯度中时，这种分子便会由于其表面电荷在此电场中运动，并最终到达一个使其表面静电荷为0的区带，这时的pH则是该分子的pI，聚焦在等电点的分子也会不断扩散，一旦偏离其等电点后，由于pH环境的改变，分子又立即得到正电荷或负电荷，从而又向pI迁移。因此，这些分子总会是出于不断扩散和抗扩散的平衡之中，在pI处得以“聚焦”。 IEF技术的关键是得到一定范围的稳定的pH梯度，即找到合适的两性载体。根据氨基酸的两性电解质的特点，最初有人用组氨酰组氨酸溶液，但其pH范围很窄，应用受到限制。1969年，Vesterbery合成了一系列脂肪酸族聚氨基聚羧基的异构物，这些异构物具有不同的pK和pI。在pH 3－10的范围内构成了一个连续的系列。通过改变电性基团的成份与数量，可以得到各种pH范围的两性载体。其商品名为“Ampholine”，“Pharmalyte”等。 IEF目前已可区别等电点仅差0.01单位的成份，这样高的分辨率用一般电泳和离子交换层析技术是达不到的。因此，IEF是鉴定电荷不均一性的，通报是区别非常相似的分子的理想方法。另外，由于经过IEF的分离，能够使相同pI的分子都浓缩到一个区带，因而可用于蛋白质的制备。

IEF所使用的抗对流介质最早主要是用蔗糖梯度，这种系统耗时多，操作麻烦。因此，现在多采用聚丙烯酰胺或葡聚糖凝胶在抗对流介质，前者用于分析IEF和少量样品的制备，后者用于制备。应用凝胶等电点聚焦法不仅能测定两性电解质的等电点，而且能将具有不同等电点的混合物质进行分离鉴定。

通过实验了解等电点聚焦电泳的原理，学习和掌握蛋白质凝胶等电点聚焦电泳的方法技术，为学习掌握双向电泳技术打下良好的基础。

二、材料与方法

1.材料：

蛋白样品

2.试剂：

聚丙烯酰胺、甲叉聚丙烯酰胺、两性电解质、尿素、NP－40、

triton x-100、1M 磷酸、1M氢氧化钠、磺基水杨酸、

三氯乙酸、考马士亮兰 R－150、乙醇、冰乙酸

3.方法与操作步骤：

（1）样品制备：

用IEF样品缓冲液提取待分析样品，如其他缓冲液提取的样品则应透析后，冷冻干燥、再复溶于IEF样品缓冲液。充分溶解后，离心去除不溶杂质。

（2）制模具：

洗净两块IEF专用玻璃板，取一块IEF专用塑料垫板，确定好疏水和亲水面。在厚玻璃板放上塑料垫片，亲水面朝上，在垫板两边放上夹条，再在上面小心盖上簿玻璃板，玻璃板疏水面朝下。夹子夹好。

（2）配胶：

按配方混合胶溶液，抽气，加入TEMED。

（3）灌胶：

配好的胶迅速灌入模具。

（5）电泳：

等胶凝固后，小心揭去上下玻璃板，将塑料垫片底部擦干，小心放于电泳槽上。在胶面两边各放一根浸透电极缓冲液的电极条。在胶面上任意位置放上小擦镜纸片，在纸片上加样，盖上盖子，恒功率25W电泳，约10分钟后，暂停电泳，取下纸片，继续电泳约30分钟，待电流达4mA以下，停止电泳。

（6）固定：取出塑料片，放入固定液中15分钟

（7）染色：取出塑料片放入染色液中65℃染色，直至条带出现。（8）干燥保存。

实验六、多酚氧化酶同功酶分析检测

一、实验原理

同功酶是指能催化同一种化学反应，但其酶蛋白本身的分子结构组成及分子量却有所不同的一组酶。由于蛋白质分离技术的发展，特别是凝胶电泳的应用，使同功酶可以从细胞提取物中分离出来。这类酶由两个或两个以上的肽链聚合而成，它们的生理性质及理化性质，电泳的行为都是不同的。由于酶分子的大小、构象、所带电荷的不同，在一定条件下，在电场中泳动的方向速度各不相同，分离出不同的区带，因此通过凝胶电泳的图谱可对同功酶进行分析。本实验将提取的PPO进行电泳分析，并观察PPO 同功酶电泳图谱。

二、材料：

（1）样品：

硫酸铵沉淀的PPO粗酶样品和G－200纯化的样品

（2）PPO同功酶染色液：

1％邻苯二酚、0.05 M 磷酸缓冲液pH6.8、o.o6％对苯二胺溶液（用0.01 N 草酸配制）以3:1:1的混合液。

（3）电泳所需材料仪器设备参见实验讲义的凝胶电泳实验部分。

三、方法步骤

电泳方法与实验四的操作方法相同。

PPO同功酶的染色方法：将电泳完毕的凝胶放入染色液中1－2h，然后用乙醇:水:醋酸（10:15:15）溶液洗脱，至出现棕色谱带。其他凝胶电泳的制胶、上样、电泳等操作见实验讲义的凝胶电泳部分。

四、作业：画出PPO的的同功酶图谱。

附：

一、凝胶层析法

1.原理

凝胶层析法（gel chromatography）有几种名称，如凝胶过滤（gel filtration）、分子筛过滤（molecular sieve filtration）、凝胶透析层析（gel permeation chromatography）等。它的基本原理是利用凝胶把分子大小不同的物质分离开的一种方法。凝胶本身是一种分子筛，它可把分子按大小不同进行分离，好象过筛一样，将凝胶颗粒在适宜的溶剂中浸泡，使其充分吸液膨胀，然后装入层析柱中，加入欲分离的混合物后，再以同一溶剂洗脱，在洗脱过程中，大分子不能进入凝胶内部而沿凝胶颗粒间的空隙最先流出柱外，而小分子进入到凝胶内部，流速较慢，以致最后流出柱外，从而使样品中分子大小不同的物质得到分离纯化。

具有分子筛作用的凝胶主要有：葡聚糖（商品名为Sephadex G系列）、琼脂糖（商品名为Sepharose系列）、聚丙烯酰胺凝胶（商品名Bio－gel）等。

2.柱材料的处理

称取一定量的Sephadex G－200干粉，加无离子水或蒸馏水浸泡溶胀24 h－36 h，去掉悬浮的细微颗粒，为防止凝胶颗粒中的空气存在，影响层析效果，凝胶装柱前一定要将凝胶液中的气体除掉，其办法是将凝胶液放进抽滤瓶中，进行抽真空处理，直到凝胶液中没有气泡出现为止，凝胶材料就处理好了。

3.装柱方法

将层析柱清洗干净垂直固定到层析架上，加1/3体积的无离子水，打开下出液口，水流畅通，即刻将小烧杯中装有适宜浓度的凝胶液（凝胶的浓度过高会产生气泡，影响蛋白质分离速度，浓度过低易产生凝胶分层，影响蛋白质的分离效果）轻轻倒入层析柱中，凝胶自然慢慢沉降在层析柱底部，凝胶沉积直到离层析柱上端1.5－2 cm处，停止装柱。层析柱上端进液口连接恒流泵，下出液口连接蛋白检测议，待层析柱的平衡。

4.层析柱的平衡方法

在柱层析上样前必须对层析柱进行平衡，所谓平衡就是将层析柱中的