流式细胞术及其应用教程
流式细胞术及其应用教程
The course of flow cytometry and its application
课程简介
该课程包括理论和实习两部分，理论课程重点介绍与流式细胞术密切相关的基本原理、结构及其在临床和科研工作中的应用。内容包括流式细胞术的基本原理、流式细胞仪数据的采集和分析、血细胞分化发育过程、流式细胞术在免疫学、血液学、肿瘤学及科研工作中的应用。通过理论授课使研究生能够掌握上述领域的基本理论和最新研究进展，达到提高研究生流式细胞术应用水平、拓展研究生思路、开阔眼界，为培养复合型人才打下基础。实习内容包括标本制备、仪器的调节与质控、淋巴细胞亚群分析、HLA-B27检测、胞膜、内抗原检测、红细胞CD55、CD59检测、血小板膜糖蛋白分析、DNA倍体分析及细胞因子检测。通过实习使研究生进一步熟悉流式细胞仪的使用程序，操作规程，为今后的工作、学习提高帮助。
This course includes in lecture teaching and practice lesson. The lecture teaching will be focused on flow cytometric basic theory, structure, data collection and analysis, application in clinic and research. The practice lesson will be focused on sample preparation, instrument setting, analysis of lymphocytes, HLA-B27，extracellular antigen and intracellular antigen, analysis of CD55,CD59, DNA ploidy analysis and cytokine detection.
教学大纲
一、课程名称：流式细胞术及其应用教程
二、总学时数：38学时，2学分
理论课18学时
实验课20学时
三、授课对象：
博士生、硕士生，专业不限
四、教学目的与要求：
掌握流式细胞术基本原理、工作程序、临床及科研工作中的用途，了解相应领域的最新进展，为临床和科研工作奠定基础。
五、理论课内容：
第一章流式细胞术工作原理（3学时）
第一节流式细胞术发展简史
要求：了解流式细胞术的基本概念、发展简史、流式细胞仪的基本结构、工作原理。第二节流式细胞仪的基本结构、工作原理
要求：了解流式细胞仪的基本结构、工作原理
第三节流式细胞仪的数据分析
要求：了解并熟悉CellQuest分析软件主界面、流式细胞仪数据采集与储存，掌握流式细胞仪数据分析方法。
1．设门技术
2．散射光信号及荧光信号
3．直方图
4．双参数散点图
第二章淋巴细胞的分化发育过程（6学时）
第一节淋巴细胞的分化发育过程
要求：了解T/NK淋巴细胞、B淋巴细胞发育过程，熟悉各阶段淋巴细胞的抗原表达情况。
第二节髓细胞的分化发育过程及白细胞分化抗原
要求：了解髓细胞的分化发育过程，熟悉各阶段髓细胞的抗原表达情况，了解白细胞分化抗原的组成及应用。
第三章流式细胞术的临床应用（6学时）
第一节血液淋巴细胞免疫表型分析及其应用
要求：了解淋巴细胞亚群数量及免疫表型变化的意义，掌握CD4＋细胞计数在艾滋病诊断与治疗中的价值，HLA-B27与强直性脊椎炎的关系。
第二节干细胞工程与流式细胞术干细胞分析
要求：了解干细胞（包括胚胎干细胞、造血干细胞、间充质干细胞等）发育、抗原表达过程，掌握流式细胞术干细胞检测设门技术、注意事项、干细胞绝对数的计算方法。第三节白血病/淋巴瘤免疫分型及其应用
要求：了解急性白血病、淋巴瘤的WHO分类、熟悉几种特殊类型急性白血病和淋巴瘤的免疫分型特征。
第四节流式细胞术粒细胞、红细胞、血小板分析及其应用
要求：了解各类细胞CD55/CD59表达情况，了解血小板糖蛋白的种类、意义，了解流式细胞术分析红细胞、血小板的注意事项；掌握流式细胞术分析红细胞、血小板的设门技术及CD55/CD59在诊断PNH中的价值。
第四章流式细胞术在科研工作中的应用（3学时）
第一节细胞周期与DNA倍体分析
要求：了解流式细胞术分析DNA/RNA的常用染料、熟悉ModFit LT DNA分析软件使用方法，掌握细胞周期/DNA倍体分析方法。
第二节CBA分析系统
要求：了解CBA分析系统及其检测原理
六、实验课内容：20学时
1．流式细胞术的标本处理(3学时)
要求：掌握流式细胞术标本制备方法
2．仪器的调节与质控(3学时)
要求：熟悉仪器的操作规程及软件额使用方法，了解质控品的使用方法与操作规程3．淋巴细胞亚群分析；HLA-B27检测(3学时)
要求：掌握淋巴细胞亚群、HLA-B27自动分析软件操作规程
4．胞内抗原检测(3学时)
要求：熟悉胞内抗原标记方法
5．红细胞CD55、CD59检测（3学时）
要求：熟悉红细胞表面抗原的检测方法，掌握设门技术
6．血小板膜糖蛋白分析(2学时)
要求：熟悉血小板膜糖蛋白分析方法、注意事项
7．DNA倍体分析（3学时）
要求：熟悉DNA染色步骤，ModFit自动分析软件的使用方法
七、重点、难点：
八、授课方式：
理论授课与实验操作，多媒体教学
九、考试方式：
理论课笔试结合实验操作评分
十．教材及主要参考资料：
1．血液病学，张之南，杨天楹，郝玉书主编，2003年第一版，人民卫生出版社2．白血病，陆道培，卞寿庚主编，2003年第一版，中国医药科技出版社
3．临床流式细胞分析，王建中主编，2005年第一版，上海科学技术出版社
4．医学免疫学,毕爱华主编，2000年第二版，人民军医出版社
5．流式细胞术原理与应用教程，吴后男主编，2008年第一版，北京大学医学出版社6．流式细胞术基本原理与实用技术，梁智辉，朱慧芬，陈九武编著，2008年第一版，华中科技大学出版社
7．Maryalice Stetler-Stevenson, Ejaz Ahmad, David Barnett,et al. Clinical Flow Cytometric Analysis of Neoplastic Hematolymphoid Cells;Approved Guideline-Second
Edition.Clinical and Laboratory Standards Institute.
8．Brent. Wood, Maria Arroz, David Barnett, et al. 2006 Bethesda Internation Consensus Recommendation on the Immunophenotypic Analysis of Hematolymphoid Neoplasis by Flow Cytometry:Optimal Reagents and Reporting for the Floe Cytometric Diagnosis of Hematopoietic Neoplasia. Cytometry Part B,2007,,72B:s14-s22.
十一、开课单位及负责人：
首都医科大学第一临床医学院血液科教研室
教研室主任：徐娟
课程负责人：徐娟
联系电话：83198476
流式细胞术临床应用
流式细胞术的临床应用 一、在肿瘤学中的应用 这是FCM在临床医学中应用最早的一个领域。首先需要把实体瘤组织解聚、分散制备成单细胞悬液，用荧光染料(碘化吡啶PI)染色后对细胞的DNA含量进行分析，PI可以与细胞内DNA和RNA结合，采用RNA抑制剂将RNA消化后，通过流式细胞术检测到的与DNA结合的PI的荧光强度直接反映了细胞内DNA含量的多少。由于细胞周期各时相的DNA含量不同，通常正常细胞的G1 / GO期具有二倍体细胞的DNA含量((2 N)，而G2/ M期具有四倍体细胞的DNA含量((4 N)，而S期的DNA含量介于二倍体和四倍体之间。因此，通过流式细胞术PI 染色法对细胞内DNA含量进行检测时，可以将细胞周期各时相区分为G1 / GO 期，S期和G2/ M期，并可通过特殊软件计算各时相的百分率，DNA含量直接代表细胞的倍体状态，非倍体细胞与肿瘤恶性程度有关。 1、发现癌前病变，协助肿瘤早期诊断 人体正常组织发生癌变要经过一个由量变到质变的漫长过程，而癌前细胞即处于量变过程中向癌细胞转化阶段。人体正常的体细胞均具有比较稳定的DNA二倍体含量。当人体发生癌变或具有恶性潜能的癌前病变时，在其发生、发展过程中可伴随细胞DNA含量的异常改变，FCM可精确定量DNA含量的改变，作为诊断癌前病变发展至癌变中的一个有价值的标志，能对癌前病变的性质及发展趋势作出估价，有助于癌变的早期诊断。有资料证实，癌前病变的癌变发生率与细胞不典型增生程度有密切关系，增生程度越重，癌变发生率越高。随着细胞不典型增生程度的加重，DNA非整倍体出现率增高，这是癌变的一个重要标志。 2、在肿瘤的诊断、预后判断和治疗中的作用 FCM在肿瘤诊断中的重要作用已经被认可，DNA非整倍体细胞峰的存在可为肿瘤诊断提供有力的依据，FCM分析病理细胞具有速度快、信息量大，敏感度高等优点，已被用在常规工作中。肿瘤细胞DNA倍体分析对病人预后的判断有重要作用，异倍体肿瘤恶性病变的复发率高、转移率高、死亡率也高，而二倍体及近二倍体肿瘤的预后则较好。FCM不仅可对恶性肿瘤DNA含量进行分析，还可根据化疗过程中肿瘤DNA分布直方图的变化去评估疗效，了解细胞动力学变化，对肿瘤化疗具有重要的意义。临床医师可以根据细胞周期各时相的分布情况，依据化疗药物对细胞动力学的干扰理论，设计最佳的治疗方案，从DNA直方图直接地看到瘤细胞的杀伤变化，及时选用有效的药物，对瘤细胞达到最大的杀伤效果。 3、FCM在细胞凋亡和多药耐药基因的研究中的作用 研究如何用药物诱导癌细胞死亡。通过对细胞体积、光散射、DNA含量及特异性抗原基因(如bcl-2, Fas等)测定分析出细胞凋亡情况。如可用Annexin V结合PI或7- AAD双染色法进行细胞凋亡分析。在凋亡的早期阶段，胞浆膜磷脂的不对称性丧失，导致膜内侧磷脂酞丝氨酸(PS)从细胞膜内层暴露于外层，从而可被PS特异的Annexin- V探针所标记。PS转移到细胞膜外不是细胞凋亡特有的，也可发生在细胞坏死中。但在凋亡的早期细胞膜是完整的，而细胞坏死时细胞膜的完整性被破坏。由于碘化丙锭(PI)或7-AAD对细胞膜完整的活细胞和早期凋亡细胞是拒染的，而对膜完整性被破坏的晚期凋亡细胞或坏死细胞可以染色。因此，Annexin- V结合PI或7-AAD进行双染色可以用于检测活细胞、凋亡细胞和坏死细胞。正常活细胞不会被染色，凋亡细胞可被标记上Annexin-V，坏死和凋亡晚
流式细胞仪的原理及应用
山西大学研究生学位课程论文（2013 ---- 2014 学年第一学期） 学院（中心、所）：生物技术研究所 专业名称：微生物学 课程名称： 论文题目：流式细胞仪的原理及其应用 授课教师（职称）：崔晓东 研究生姓名：常姣 年级：研一 学号：201323001003 成绩： 评阅日期： 山西大学研究生学院 年月日
流式细胞仪的原理及其应用 姓名常姣专业微生物学 摘要本文简要论述了流式细胞仪( flowcyt ometry, FCM) 的工作原理, 并对其某些科学领域研究中的应用进行阐述, 包括在生物学、免疫学、临床学中的研究应用。 关键词 FMC；生物学；免疫学；临床学 流式细胞仪( fl o w c y to me tr y, F CM) 研制、发展、革新和应用领域的扩展，都是由生物学、生物技术、计算机科学、电子工程学、流体力学、激光技术、分子生物学、有机化学和物理学等多个学科综合发展和应用而实现的。近代流式细胞仪，由于单克隆抗体技术、定量细胞化学和定量荧光细胞化学的应用，使其在生物学、临床医学等众多研究领域的应用愈来愈广泛和重要，尤其在生物学中对细胞周期的动力学分析、细胞因子、细胞凋亡、信号传导、R N A / D N A 的分析、细胞表面受体及特异性抗原的分析等领域发挥着独特作用，具有操作简单、分析精确、重复性好、费用低廉、分析速度快等优点。 1流式细胞仪的构成及工作原理 流式细胞仪主要由液流系统、光学系统、电子系统、分析系统和细胞分选系统五个部分组成。将待测细胞制成单细胞悬液, 经荧光染料染色后加入样品管, 在一定气体压力下待测样品被压入流动室。待测细胞在鞘液的包裹下单行排列, 依次通过检测区, 被荧光染料染色的细胞受到强烈的激光照射后, 产生散射光和荧光信号。这两种信号同时被前向光电二极管和90°方向的光电倍增管(PMT) 接收。散射光分为前向角散射(forwardscatter, FSC) 和侧向角散射(sidescatter, SSC) 。前者主要反映被测细胞的大小, 后者主要反映被测细胞的胞质、胞膜、核膜的折射等, 以及细胞内颗粒的性状。光信号通过波长选择通透性滤片后, 经光电倍增管接收后转为电信号, 再经数/模转换器转换为可被计算机识别的数学信号, 以一维直方图或二维点阵图及数据表或三维图形显示出来[1,2]。 流式细胞仪还可以对分析中的目的细胞进行分选, 它是通过分离含有单细胞的液滴而实现的。流动室的喷嘴上安装有超高频的压电晶体, 可以产生高频振荡, 使液流断裂为均匀的液滴, 待测细胞就包含在液滴之中。将这些液滴充上正或负电荷, 当带电液滴通过电场, 便会在电场的作用下发生偏转, 然后落入相应的收集器中, 从而实现细胞分选[2]。 2流式细胞仪的应用 流式细胞术的应用，简单用一句话概括就是，凡能被荧光分子标记的细胞或微粒均能用流式细胞仪检测。其中细胞生物学领域是流式细胞术在基础研究中应用范围最广泛的领域，因为最初这个技术就是为此目的而设计的。 2.1流式细胞仪在生物学中的应用 流式细胞仪在生物学中的应用越来越广泛,如在细胞生物学、细胞遗传学、分子生物学、神经生物学、微生物学、分子免役学、植物学等等许多生物学基础学科的应用和在细胞凋亡、细胞周期调控、细胞因子及细胞分型等研究中的应用[3]。 2.1.1 对凋亡细胞的分析 细胞凋亡是生物体生长发育过程中出现的正常现象, 在生物体形态构成、正常细胞更替以及维持
自己总结：流式细胞仪的原理和用途
流式细胞仪（Flow Cytometry） 1 流式细胞仪的概念及其发展历史 1．1 流式细胞仪的基本概念流式细胞仪（flow cytonletry，FCM）是对高速直线流动的细胞或生物微粒进行快速定量测定和分析的仪器，主要包括样品的液流技术、细胞的计数和分选技术，计算机对数据的采集和分析技术等。流式细胞仪以流式细胞术为理论基础，是流体力学、激光技术、电子工程学、分子免疫学、细胞荧光化学和计算机等学科知识综合运用的结晶。流式细胞术是一种自动分析和分选细胞或亚细胞的技术。其特点是：测量速度快、被测群体大、可进行多参数测量，即对同一个细胞做有关物理、生物化学特性的多参数测量，且在统计学上有效。 1．2 流式细胞仪的发展简史最早的流式细胞仪雏形诞生于1934年，Moldavan提出使悬浮的单个血红细胞流过玻璃毛细管，在亮视野下用显微镜进行计数，并用光电记录装置测量的设想。1953年Crosland-Taylor根据牛顿流体在圆形管中流动规律设计了流动室。其后又经过Coulter、Parker & Horst、Kamentsky、Gohde、Fulwyler、Herzenberg等人的不断改进，设计了光电检测设备和细胞分选装置、完成了计算机与流式细胞仪的物理连接及多参数数据的记录和分析、开创了细胞的免疫荧光染色及检测技术、推广流式细胞仪在临床上的应用。近20年来，随着流式细胞仪及其检测技术的日臻完善，人们越来越致力于样品制备、细胞标记、软件开发等方面的工作，以扩大FCM的应用领域和使用效果。 宋平根的《流式细胞术的原理和应用》是迄今为止对流式细胞仪及其技术阐述的最为详尽和透彻的中文著作。这本书非常详细地介绍了流式细胞术的历史、结构、原理、技术指标等，例举了其在医学和生物工程中的应用，非常适合从事此方面专业研究的人。由于这本书是13年前出版的，所以基本上没有涉及植物流式细胞仪检测技术。此外对于只需要对流式细胞仪有些基本认识的人士来说，这本书太复杂太深奥。谢小梅主要介绍了流式细胞仪在生物工程中的应用。杨蕊概括了流式细胞仪的工作原理，简单提及了流式细胞仪的应用。本文在分析这三篇论著或文章的优缺点后，用比较通俗的语言介绍了掌握流式细胞仪检测技术必须了解的一些原理，并对目前市场上的主流型号进行了客观的性能概括。 2 流式细胞仪的工作原理和技术指标 2．1 流式细胞仪工作原理除电源外，流式细胞仪主要由四部分组成：流动室和液流系统：激光源和光学系统；光电管和检测系统；计算机和分析系统，其中流动室是仪器的核心部件。这四大部件共同完成了信号的产生、转换和传输的任务。 流动室和液流系统
流式细胞术及其应用教程
流式细胞术及其应用教程 The course of flow cytometry and its application 课程简介 该课程包括理论和实习两部分，理论课程重点介绍与流式细胞术密切相关的基本原理、结构及其在临床和科研工作中的应用。内容包括流式细胞术的基本原理、流式细胞仪数据的采集和分析、血细胞分化发育过程、流式细胞术在免疫学、血液学、肿瘤学及科研工作中的应用。通过理论授课使研究生能够掌握上述领域的基本理论和最新研究进展，达到提高研究生流式细胞术应用水平、拓展研究生思路、开阔眼界，为培养复合型人才打下基础。实习内容包括标本制备、仪器的调节与质控、淋巴细胞亚群分析、HLA-B27检测、胞膜、内抗原检测、红细胞CD55、CD59检测、血小板膜糖蛋白分析、DNA倍体分析及细胞因子检测。通过实习使研究生进一步熟悉流式细胞仪的使用程序，操作规程，为今后的工作、学习提高帮助。 This course includes in lecture teaching and practice lesson. The lecture teaching will be focused on flow cytometric basic theory, structure, data collection and analysis, application in clinic and research. The practice lesson will be focused on sample preparation, instrument setting, analysis of lymphocytes, HLA-B27，extracellular antigen and intracellular antigen, analysis of CD55,CD59, DNA ploidy analysis and cytokine detection. 教学大纲 一、课程名称：流式细胞术及其应用教程 二、总学时数：38学时，2学分 理论课18学时 实验课20学时 三、授课对象： 博士生、硕士生，专业不限
流式细胞术及其应用_百替生物
流式细胞术及其应用 作者：贾宇臣 第一部分流式细胞术的一般介绍 概念 流式细胞术（Flow Cytometry，FCM）利用流式细胞仪对处在快速、直线、流动状态中的单细胞或生物颗粒进行多参数、快速定量分析，同时对特定群体加以分选的现代细胞分析技术。 流式细胞仪（Flow Cytometer)集激光技术、电子物理技术、光电测量技术、电子计算机技术、细胞荧光化学技术、单克隆抗体技术为一体的一种新型高科技仪器。 流式细胞仪特点
FACSCalibur 临床型（台式机） 特点： 光路调节系统固定 自动化程度高 操作简便 使用寿命长 配备1-2根激光 细胞分选速度慢，主要用于细胞分析
BD LSR
FACS Vantage DiVa 科研型（大型机） 特点： 多数字化 适用用各类细胞分选 4路分选
FACSAria 科研型 特点： 分辨率高 选配多种波长和类型激光器 可把感兴趣细胞分选到特定培养孔或板上（4路和24孔板）适用于高速分选和多色分析 流式细胞仪检测范围
临床研究 淋巴细胞亚群测定、血小板分析、网织红细胞分析、白血病和淋巴瘤免疫分型、HLA-B27分析、PNH诊断、人类同种异体器官移植中应用、细胞因子测定、AIDS诊断与治疗和疗效评价、flow-FISH法测定端粒长度 基础研究 淋巴细胞功能、树突状细胞（DC）研究、造血干细胞研究、细胞周期分析、细胞凋亡分析、凋亡相关蛋白分析、细胞功能研究、多药耐药基因研究（MDR）、肿瘤相关基因表达研究、RNA测定、DNA测定、总蛋白测定、癌基因和抑癌基因表达产物测定、血管内皮细胞研究 流式细胞仪的工作原理 -光学系统 激光光源 光收集系统 -液流系统 流动室 液流驱动系统 -电子系统 光电转换 数据处理系统 -细胞分选系统 激光光源 单波长、高强度、高稳定性 多采用氩离子激光器或氦氖激光器
流式细胞仪工作原理与应用范围
流式细胞仪工作原理与应用范围 2008-11-01 10:30 流式细胞仪就是进行流式细胞分析的仪器，它集电子技术、计算机技术、激光技术、流体理论于一体，是一种非常先进的检测仪器，被誉为试验室的“CT”。 流式细胞术（Flow CytoMeter，FCM）是一种在功能水平上对单细胞或其他生物粒子进行定量分析和分选的检测手段，它可以高速分析上万个细胞，并能同时从一个细胞中测得多个参数，与传统的荧光镜检查相比，具有速度快、精度高、准确性好等优点，成为当代最先进的细胞定量分析技术。 工作原理 将待测细胞染色后制成单细胞悬液。用一定压力将待测样品压入流动室，不含细胞的磷酸缓冲液在高压下从鞘液管喷出，鞘液管入口方向与待测样品流成一定角度，这样，鞘液就能够包绕着样品高速流动，组成一个圆形的流束，待测细胞在鞘液的包被下单行排列，依次通过检测区域。 流式细胞仪通常以激光作为发光源。经过聚焦整形后的光束，垂直照射在样品流上，被荧光染色的细胞在激光束的照射下，产生散射光和激发荧光。这两种信号同时被前向光电二极管和90°方向的光电倍增管接收。光散射信号在前向小角度进行检测，这种信号基本上反映了细胞体积的大小；荧光信号的接受方向与激光束垂直，经过一系列双色性反射镜和带通滤光片的分离，形成多个不同波长的荧光信号。 这些荧光信号的强度代表了所测细胞膜表面抗原的强度或其核内物质的浓度，经光电倍增管接收后可转换为电信号，再通过模/数转换器，将连续的电信号转换为可被计算机识别的数字信号。计算机把所测量到的各种信号进行计算机处理，将分析结果显示在计算机屏幕上，液可以打印出来，还可以数据文件的形式存储在硬盘上以备日后的查询或进一步分析。 检测数据的显示视测量参数的不同由多种形式可供选择。单参数数据以直方图的形式表达，其X轴为测量强度，Y轴为细胞数目。一般来说，流式细胞仪坐标轴的分辨率有512或1024通道数，这视其模数转换器的分辨率而定。对于双参数或多参数数据，既可以单独显示每个参数的直方图，也可以选择二维的三点图、等高线图、灰度图或三维立体视图。 细胞的分选是通过分离含有单细胞的液滴而实现的。在流动室的喷口上配有一个超高频电晶体，充电后振动，使喷出的液流断裂为均匀的液滴，待测定细胞就分散在这些液滴之中。将这些液滴充以正负不同的电荷，当液滴流经带有几千伏特的偏转板时，在高压电场的作用下偏转，落入各自的收集容器中，不予充电的液滴落入中间的废液容器，从而实现细胞的分离。 应用范围 可用于白血病的分型、肿瘤细胞染色体的异倍性测定，以及免疫学研究，并已开
流式细胞术原理及功能介绍
流式细胞术详解 一. 流式细胞术概述 流式细胞术(Flow Cytometry, FCM)是七十年代发展起来的高科学技术 ,它集计算机技术、激光技术、流体力学、细胞化学、细胞免疫学于一体, 同时具有分析和分选细胞功能。它不仅可测量细胞大小、内部颗粒的性状,还可检测细胞表面和细胞浆抗原、细胞内DNA、RNA含量等,可对群体细胞在单细胞水平上进行分析, 在短时间内检测分析大量细胞,并收集、储存和处理数据,进行多参数定量分析; 能够分类收集(分选)某一亚群细胞,分选纯度＞95%。在血液学、免疫学、肿瘤学、药物学、分子生物学等学科广泛应用。 国内使用的流式细胞仪主要由美国的两个厂家生产:BECKMAN- COULTER公司和Becton-Dickinson公司(简称B-D公司)。流式细胞仪主要有两型:临床型（又称小型机、台式机）和综合型（又称大型机、分析型）。BECKMAN-COULTER公司最新产品为EPICS ALTRA和EPICS XL/XL-MCL, B- D公司最新产品为FACS Vantage和FACS Calibur。EPICS XL/XL-MCL和FACS Calibur是临床型;EPICS ALTRA和 FACS Vantage是综合型，除具备检测分析功能外,还具有细胞分选功能 ,多用于科学研究。 二.流式细胞仪主要技术指标 1．流式细胞仪的分析速度： 一般流式细胞仪每秒检测1000～ 5000个细胞,大型机可达每秒上万个细胞。 2．流式细胞仪的荧光检测灵敏度：一般能测出单个细胞上<600个荧光分子,两个细胞间的荧光差＞5%即可区分。 3．前向角散射（FSC）光检测灵敏度：前向角散射（FSC）反映被测细胞的大小,一般流式细胞仪能够测量到0.2μm～０.5μm。 4．流式细胞仪的分辨率：通常用变异系数CV值来表示，,一般流式细胞仪能够达到<2.0%,这也是测量标本前用荧光微球调整仪器时要求必须达到的。 5．流式细胞仪的分选速度：一般流式细胞仪分选速度＞1000个/秒，分选细胞纯度可达99%以上。 三.流式细胞仪主要构造和工作原理 流动室及液流驱动系统 流式细胞仪主要由以下五部分构成:①流动室及液流驱动系统②激光光源及光束形成系统③光学系统④信 号检测与存储、显示、分析系统⑤细胞分选系统。 流动室（Flow Cell或Flow Chamber）是流式细胞仪的核心部件，流动室由石英玻璃制成，单细胞悬液在细胞流动室里被鞘流液包绕通过流动室内的一定孔径的孔,检测区在该孔的中心，细胞在此与激光垂直相交，在鞘流液约束下细胞成单行排列依次通过激光检测区。流动室里的鞘液流是一种稳定流动，控制鞘液流的装置是在流体力学理论的指导下由一系列压力系统、压力感受器组成，只要调整好鞘液压力和标本管压力, 鞘液流包绕样品流并使样品流保持在液流的轴线方向，能够保证每个细胞通过激光照射区的时间相等，从而使激光激发的荧光信息准确无误。见图12.1流动室示意图。流动室孔径有60μm、100μm、150μm 、250μm等多种，供研究者选择。小型仪器一般固定装置了一定孔径的流动室。 图12.1流动室示意图(采自Coulter Training Guide) 四. 流式细胞仪主要构造和工作原理 激光光源及光束形成系统
成像流式细胞仪原理及应用
二代流式技术产品-成像流式细胞分析 邱又彬 Merck&Millipore旗下品牌Amnis于近期推出了新一代高速细胞成像系统ImageStreamX Mark II。这是第三代ImageStream成像流式细胞仪，具有无与伦比的细胞分析能力。 显微镜可提供详细的细胞图像和形态信息，是研究细胞功能的重要工具。然而，显微图像的解释却是主观、定性且费力的。流式细胞仪擅长定量的表型分析，可产生统计学上可靠的结果，不过，流式细胞仪却缺乏成像能力，因此无法了解亚细胞定位。 ImageStream系列开创性地将流式细胞检测与荧光显微成像结合于一体，既能提供细胞群的统计数据，又可以获得单个细胞的图像，从而提供了细胞形态学、细胞结构和亚细胞信号分布的完整信息。 ImageStreamX Mark II能实时捕获每个流动细胞最多12幅高分辨率图像，检测速率可达5000细胞/秒，并具有更强荧光灵敏度。ImageStreamX Mark II的这些功能可以对细胞形态、荧光探针的强度和定位进行检测，进而为科学家提供广泛的图像分析应用，包括细胞间相互作用、吞噬、凋亡和自噬、核易位、形态变化等。 ImageStreamX Mark II的特征如下： ?速度更快：Mark II对进样速度进行了提升，每秒可以分析多达5000个细胞，简单易用的补偿向导可以指导您轻松完成多色补偿运算。 ?操作更简单：全新而直观的用户界面提供了每一个细胞的图像及实时绘图相关的图形化控件。 ?样品适应性更强：Mark II可选配7个激光；样品容量20-200 μl，增加了实验的灵活性，适用于多用户实验室。 ?样品利用率更高：Mark II将样品利用率提高到了95%，更适用于稀有的细胞样品，而且未使用的样品也可回收用于进一步分析。 从2005年开始，Amnis量化成像流式分析仪被广泛应用于各个研究领域。其中超过300篇的文章发表在高水平的同行评议杂志（peer-reviewed journal）上。这些研究领域包括生物化学、药物研发、血液、免疫、微生物、海洋、肿瘤、寄生虫、干细胞、毒理、病毒等等。并且由于Amnis与众不同的实验理念和卓越性能，使得这个名单不断变长。 1.生物化学： 经典的生物化学技术主要用于分子定位和共定位检测，这非常适合使用Amnis量化成像流式分析系统，比如转录因子从细胞质到细胞核的转位、分子在亚细胞器间的运输、蛋白质在细胞内和细胞间的共定位。它可以获取复杂样品每个细胞中探针定位和共定位的统计学结果，这对于传统生物化学研
流式细胞术原理及应用
流式细胞术原理 1a 4b 2c 3d 样品荧光标记的影响因素不包括（）b 抗体使用原则有（）c 以下不属于流式细胞术特点的是（）c 流式细胞术分选指标不包括（）d 流式细胞仪的组成部分包括（）d 流式细胞仪检测荧光信号的特征是（）b 流式细胞仪种类包括（）b 流式细胞仪细胞分选系统的分选方式有（）b 流式细胞仪光收集系统的滤光片种类不包括（）d 流式细胞术研究的对象为（）a 流式细胞术的临床应用 2a 1b 3c 4d 白血病和淋巴瘤免疫表型分析的设门方案为（）c 用来监测肿瘤发生发展和判断预后的指标是（）a 髓系特异标志是（）d 所谓的Ⅲ型细胞就是CD59表达（）d 判断血小板活化状态的指标是（）c 巨核细胞白血病一般表达的分化抗原不包括（）d 可以评价贫血治疗前后和移植前后红细胞生成情况的是（）d 用来诊断阵发性睡眠性血红蛋白尿症（PNH）及鉴别其他贫血的重要的指标是（）c 当HIV感染病情凶险的时候，CD4+的T细胞通常低于（）个/mm3 a 对T淋巴细胞白血病比较特异的是（）b
流式细胞术在细胞凋亡检测中应用 2a 2c 6d 流式细胞术的应用技术分为：细胞表面分子或抗原的检测、细胞内分子或抗原的检测和（）检测 d 下述说法中，错误的是（）a 有关CBA在临床应用中的说法，错误的是（）c CBA的标本不能是（）a 利用细胞膜结构改变检测凋亡细胞时，采用的染料为（）d 新型细胞凋亡常用的染料是（）d 通过DNA含量分析所获取的、信息包括两个参数:（），和细胞周期当中其它时相的百分率 d 下列有关CBA的原理的说法中，错误的是（）d 进行细胞因子检测时，应用（）进行处理 c 有关细胞内分子或抗原分析的说法中错误的是（）d 流式细胞术质量控制 1a 3b 2c 4d 关于免疫荧光染色制备样本的保存说法错误的是（）b 荧光信号脉冲面积和宽度散点图的应用不包括（）c 关于直标抗体的说法错误的是（）c 理论上是理想的对照的是（）a 性能指标的评价顺序是（）d 关于细胞内免疫荧光染色说法错误的是（）d 关于组织标本制备的说法错误的是（）b 关于分析和报告参数说法错误的是（）d 细胞量与抗体量需要达到最适比例，待测靶细胞的最佳浓度是（）b 关于精密度及其校准微球（）d
流式细胞术的应用
第三节流式细胞术的应用 节概述 流式细胞术以其快速、准确、灵敏度高等优点，广泛应用于生物细胞周期和动力学的分析、各种肿瘤性抗原、肿瘤性蛋白、致癌基因、检测凋亡、免疫学的理论研究和临床诊断。 知识点导航 一、流式细胞术在细胞生物学中的应用 流式细胞术最早被应用于生物学研究领域，就是生物细胞周期和动力学的分析。Gohode和Dittrich第一个用流式细胞术测量细胞核DNA含量，以了解细胞周期的变化来研究药物干扰细胞周期动力学。目前，流式细胞术在细胞生物学研究中应用最广泛的是生物细胞增殖周期的定量分析。流式细胞术为生物细胞增殖周期的研究带来了全新的分析手段。 1．DNA倍体研究的理论依据在生物细胞中，DNA含量是比较恒定的参量，DNA参量随着细胞增殖周期各时相而发生变化(图17－6)。G0期细胞被认为是不参与增殖周期循环的一群细胞，即静止期细胞，DNA含量是较为恒定的2C，G1期的细胞具有增殖活性，是参与细胞周期循环的一群细胞，G1 期细胞的DNA含量与G0期细胞DNA含量相同，均为2倍体DNA含量，当细胞进入S期后(细胞合成期)， 图18-6 细胞增殖周期与DNA含量分布直方图 DNA含量逐渐增加，从2C变化到4C值，直到细胞DNA倍增结束进入G2期，最终进入M期，在M期分裂为两个子细胞之前，G2和M期细胞的DNA含量均为恒定的4C值，即为恒定的4C细胞群。 荧光染料(如PI)与细胞DNA能够特异性结合，它们有一定的量效关系：1 DNA含量与荧光染料的结合成正比；2 荧光强度与DNA吸收荧光分子多少成正比；3荧光脉冲与DNA直方图的通道值成正
比。因此，流式细胞术可根据细胞的DNA含量将细胞分为三部分：G0/G1、S期和G2/M期。G0/G1期和G2/M期细胞峰的DNA分布均成正态分布，S期可认为是一个加宽的正态分布。其中，G2/M期的DNA 含量是G0/G1期的2倍，S期的DNA含量介于G0/G1期与G2/M期之间。 流式细胞仪配有分析细胞各时相相对细胞数的拟合软件，它可将其测定的DNA直方图进行拟合，计算出细胞周期各时相的百分比及DNA含量。 2．DNA指数FCM 定量分析一个细胞群，用DNA指数(DNA index，DI)衡量细胞的变异情况，DI 可用下式计算： DI=样品G0(G1)期的均值／正常2倍体细胞G0(G1)期均值 从上式可知，正常2倍体细胞的DI=1，如果DI > 1则说明该群细胞异常。因此，DI是FCM进行肿瘤早期诊断的主要指标。 3．DNA分析的意义 (1)通过DNA的倍体分析可鉴别良、恶性肿瘤：良性肿瘤或良性增生时不会出现非整倍体细胞(DI> 1)，而恶性肿瘤则伴有相当数量的非整倍体出现。所以出现非整倍体细胞是恶性肿瘤诊断的有力证据。 (2)药物对细胞周期的影响：在抗肿瘤药物的研究中，对其作用机理的研究，一般要观察药物作用在细胞周期的哪个时相，运用流式细胞术可使这方面的工作变得方便、快速、客观。例如推测某种药物作用于细胞的DNA合成期，通过流式细胞仪的检测，发现G2/M期数量减少，则有力地支持了推测的正确性。 二、流式细胞术在肿瘤病理中的应用 近年来流式细胞术已引起了肿瘤研究工作者的极大关注，尤其是以细胞DNA含量的测定最受重视，而荧光探针的发展，为流式细胞术研究各种肿瘤性抗原、肿瘤性蛋白、致癌基因等开辟了新的途径，极大地提高了肿瘤学的研究水平，使得流式细胞术在肿瘤的鉴别、诊断、治疗和预后方面得到了广泛的应用。 以DNA非整倍体与癌前病变的流式细胞术检测为例说明这一技术的应用。 癌前病变是早期诊断恶性肿瘤的重要环节，一般认为，正常组织细胞发生癌变有一个从量变到质变的过程。癌前细胞处于量变过程中的转化阶段，细胞的增生程度与DNA含量的异常改变呈平行关系。有学者用流式细胞仪对食管、胃、结肠、宫颈、鼻炎、口腔黏膜、宫内膜等部位的癌前病变做了检测和研究分析，结果表明：1 DI在正常细胞中不超过1.05，而随着增生程度增高DI也增高；2在正常组织细胞中不会出现非整倍体细胞，S期和G2/M期的相对细胞数比例不高，当出现非整倍体后，一般DI会随非整倍体上升而上升。这对恶性肿瘤的诊断具有结论性意义。肿瘤细胞DNA的动态变化，可作为指导肿瘤的治疗、了解病情发展过程和判断预后的有力证据。 三、流式细胞术在凋亡研究中的应用 细胞凋亡又称细胞凋谢或程序性细胞死亡，是有别于细胞坏死而受基因控制的一种主动性细胞自杀过程，是当今生物学领域研究的热门课题之一。流式细胞术检测凋亡的主要方法有：1用荧光染料