特定微生物的检测(附录62)USP32-中文翻译

<62>非无菌供试品的微生物检测：指定微生物的检测

介绍

以下描述实验适用于确定指定微生物的不存在或者有限存在，这些指定微生物可能要在特定条件下才能被检测出来。

该实验最初设计来确定是否一个物质或者制剂符合确定的微生物质量标准。当出于此目的时，按照以下指导进行，包括取样的数量，并且按照下面所述解释结果。

此外的微生物程序包括自动化方法也可以被使用，只要证明该方法与药典方法具有等效性。

一般程序

样品的制备按照“<61>非无菌产品的微生物检查：微生物计数实验”的描述进行。

如果供试品具有抗菌活性，尽可能按照“<61>非无菌产品的微生物检查：微生物计数实验”中描述去除或中和。

如果样品制备使用了表面活性物质，那也必须按照“<61>非无菌产品的微生物检查：微生物计数实验”中描述的证明表面活性物质对微生物的无毒性，以及他们与抑制剂之间的兼容性。

培养基的生长促进和抑菌性，测试的适应性

必须确定在供试品存在的情况下该方法检测微生物的能力。

如果检验过程中发生变更或者供试品变更，且这些变更可能影响检验结果，适应性必须被确认。

检验菌株的制备

使用如下所述的稳定的标准菌悬液。使用菌种保存技术（种子批系统），以便用于接种的可萌发微生物从最初的主种子批开始不超过5代。

需氧微生物

将每个细菌检验菌株单独置于装有大豆酪蛋白消化物肉汤或者大豆酪蛋白消化物琼脂的容器内，在温度30～35℃之间培养18至24小时。将白色念珠菌的检验菌株单独置于沙氏葡糖琼脂或者沙氏葡糖肉汤中，在温度20～25 ℃之间

使用pH值7.0的缓冲氯化钠—蛋白胨溶液或pH值7.2的磷酸盐缓冲液来制备检测供试悬浮液。悬浮液在2小时内使用，或在存放于2～8℃的情况下，24小时内使用。

梭状芽孢杆菌

使用梭状芽孢杆菌如ATCC 11437 (NBRC14293, NCIMB 12343, CIP 100651) 或ATCC 19404 (NCTC 532或CIP 79.3)。于温度30～35℃，厌氧条件下，在梭状芽孢杆菌强化培养基里将梭菌检验菌株培养24至48小时。作为制备然后稀释新鲜的梭状芽孢杆菌体细胞悬浮液的替代方法，一种稳定的孢子悬浮液被用于检测接种。此稳定孢子悬浮液可以在2～8℃温度内保存，期限需验证。

阴性对照

为确认测试条件，用选定的稀释液代替供试制备品进行阴性对照实验。此试验中必须没有微生物的生长。

培养基的生长促进和抑菌性能

检测每批已制备的培养基和每批由脱水培养基或培养基成分制备培养基。按表1中所描述的内容来验证相关培养基的适用性能。

对生长促进性能的检测，液体培养基—接种少量（不多于100cfu）适当的微生物到一部分合适的培养基上。在指定的温度下进行培养，且时间不多于检测中规定的最短时间。发生了清晰可见的微生物生长，且与用此前检验并批准过的培养基批次所得到的微生物生长相当。

对生长促进性能的检测，固体培养基—用表面铺展法（见<61>非无菌产品的微生物检查：微生物计数实验下的平板计数法），用少量（不超过100cfu）适当的微生物给每个平皿接种。在指定的温度下培养，且时间不超过测试中规定的最短时间。发生了微生物生长，且与用此前检验并批准过的培养基批次所得到的微生物生长相当。

对抑菌性能的检测，液体或固体培养基—用至少100cfu适合的微生物接种合适的培养基。在指定的温度下进行培养，且时间不少于检测中规定的最长时间。应没有发生供试微生物的生长。

对指示性能的测试—用表面铺展法（见<61>非无菌产品的微生物检查：微生物计数实验下的平板计数法），用少量（不多于100cfu）的适当的微生物给每个平皿接种。在指定温度下进行培养，且时间为在检测中规定的时间范围内。菌落在外观和指示反应上与从此前已检测并批准的培养基批次所获得的菌落是相当的。

检查方法的适用性

按照“产品检测”下相关段落里的描述，对每种新供试品进行样品制备。混合的时候，在指定的增长培养基里加入每种供试菌株。单独接种供试菌株。在被接种的供试制备品中，使用数量相当于不多于100cfu的微生物。

按照“产品检测”下相关段落里的描述，使用所规定的最短接种时间进行检测。

规定的微生物必须按照“产品检测”下的描述，以指示反应进行检测。

供试品的任何抗菌活性会使修改检测规程（见<61>非无菌产品的微生物检查：微生物计数实验下的抗菌活性的中和/去除）成为必要。

对某个特定的供试品，如果其对于检测所指定的微生物的抗菌活性不能被中和，则可以假定为在供试品中不会存在此种被抑制微生物。

产品检测

胆汁耐受革兰氏阴性菌

样品的制备和预培养—按照“<61>非无菌产品的微生物检查：微生物计数实验”制备样品，将不少于1克的供试品以1:10稀释来制备样品，但是使用大豆酪蛋白消化物肉汤培养基作为所选择的稀释剂，混匀，并在20o至25 o时培养一段时间，此时间段足以使细菌复苏但不足以促进微生物的繁殖（通常2个小时而不超过5小时）。

确认微生物不存在的检测—除非另有规定，否则按“样品的制备和预培养”项下规定制备相当于1克的该供试品，接种至肠道菌增菌肉汤培养基Mossel。在温度30～35 ℃下培养24至48小时。再次在紫红色胆汁葡萄糖琼脂培养基平皿上培养。在温度30～35 ℃下培养18至24小时。

如果没有菌落生长，则供试品符合该检测的要求。

定量检测—

选择和再次培养—将在“样品的制备和预培养”项下规定的制备品和/或分别包含0.1克，0.01克，和0.001克（或0.1毫升，0.01毫升，和0.001毫升）该供试品的稀释液，接种于适量的肠道菌增菌肉汤培养基Mossel。在温度30～35℃下培养24至48小时。在紫红色胆汁葡萄琼脂培养基的平皿上对培养物进行再次培养。在温度30～35℃下培养18至24小时。

说明—菌落的生长构成了阳性结果。记录产生阳性结果的最少量供试品和产生阴性结果的最大量供试品。从表2中大概确定细菌的数量。

大肠杆菌

样品的制备和预培养—按照“<61>非无菌产品的微生物检查：微生物计数实验”制备样品，将不少于1克的供试品以1:10稀释来制备样品，并使用10毫升或对应1克或1毫升的数量，接种于适量（按照“检查方法的适用性”项下的内容来确定）的大豆酪蛋白消化物肉汤培养基，混匀，并在温度30～35℃下培养18至24小时。

选择和再次培养—摇动容器，转移1毫升大豆酪蛋白消化物肉汤培养基至100毫升的麦康凯（MacConkey）肉汤培养基，并在温度42～44 ℃下培养24至48小时。在温度30～35℃下，于麦康凯（MacConkey）琼脂培养基的平皿上再次培养18至72小时。

说明—菌落的生长表明了大肠杆菌存在的可能性。这需通过鉴别检测来证明。

如果没有菌落存在或如果确认鉴别检测为阴性，则该供试品符合该检测的要求。

沙门氏菌

样品的制备和预培养—按照“<61>非无菌产品的微生物检查：微生物计数实验”制备供试品，并使用对应不少于10克或10毫升的数量接种于适量（按

照检查方法的适用性项下内容来确定）的大豆酪蛋白消化物肉汤培养基，混合，在温度30～35℃下培养18至24小时。

选择和再次培养—转移0.1毫升大豆酪蛋白消化物肉汤培养基至10毫升氯化镁孔雀绿沙门氏菌富集肉汤培养基，并在温度30～35℃之间培养18至24小时。在木糖赖氨酸脱氧胆盐琼脂培养基的平皿内再次培养。在温度30～35℃之间培养18至48小时。

说明—可能存在的沙门氏菌通过生长良好的红色菌落，带有或没有黑色中心来识别。这由鉴定试验来确认。

如果所描述类型的菌落不存在或如果确认鉴别检测为阴性，则该供试品符合该检测的要求。

绿脓杆菌

样品的制备和预培养—按照“<61>非无菌产品的微生物检查：微生物计数实验”制备样品，将不少于1克的供试品以1:10稀释来制备样品，并使用10毫升或对应1克或1毫升的数量，接种于适量（按照“检查方法的适用性”项下描述来确定）的大豆酪蛋白消化物肉汤培养基，混匀。当检测贴剂时，通过无菌膜过滤器来过滤对应一贴制备品的样品（见<61>非无菌产品的微生物检查：微生物计数实验章节中样品的制备项下贴剂），并置于100毫升大豆酪蛋白消化物肉汤培养基。在温度30～35℃之间培养18至24小时。

选择和再次培养—在十六烷三甲基溴化铵琼脂培养基的平皿内再次培养，并在温度30～35℃之间培养18至72小时。

说明—菌落的生长表明了绿脓杆菌存在的可能性。这需通过鉴别检测来证明。

如果菌落不存在或如果确认鉴别检测为阴性，则该供试品符合该检测的要求。

金黄色葡萄球菌

样品的制备和预培养—按照“<61>非无菌产品的微生物检查：微生物计数实验”制备样品，将不少于1克供试品以1:10稀释来制备样品，并使用10毫升或对应1克或1毫升的数量来接种适量（按照“检查方法的适用性”项下的描述来确定）于大豆酪蛋白消化物肉汤培养基，并使其均匀。当检测贴剂时，通过无菌膜过滤器来过滤对应一贴制备品的样品（见<61>非无菌产品的微生物检查：微生物计数实验章节中样品的制备项下贴剂），并置于100毫升大豆酪蛋白消化物肉汤培养基内。在温度30～35℃下培养18至24小时。

选择和再次培养—再次培养在甘露醇氯化钠琼脂培养基的平皿上，并在温度30～35℃之间培养18至72小时。

说明—金黄色葡萄球菌存在的可能性通过由黄色区域环绕的黄色或白色菌落的生长来识别。这需通过鉴别检测来证实。

如果所描述类型的菌落不存在或如果确认鉴别检测为阴性，则该供试品符合该检测的要求。

梭状芽孢杆菌

样品的制备及热处理—按照“<61>非无菌产品的微生物检查：微生物计数实验”制备供试品，分别取两等份相当于不少于1g或1ml的供试品。将其中一份在温度80℃加热10分钟，并快速冷却。不要加热另外一份。

选择和再次培养—分别将两份混合好的供试品放入两个容器（38mm×200mm）或者其他盛有100ml梭状芽孢杆菌强化培养基的容器中，在无氧的条件下、30～35℃之间，培养48小时。培养之后，将来自每个试管的培养物在哥伦比亚琼脂培养基上进行再次培养，并在无氧条件下、30～35℃之间，培养48小时。

说明—杆菌（带有或没有内生孢子）厌氧性生长出现阴性过氧化氢酶反应的现象，表明了梭状芽孢杆菌的存在。

如果哥伦比亚琼脂没有检测出厌氧微生物的生长或过氧化氢酶检测呈阳性，则供试品符合该检测要求。

白色念珠菌

样品的制备和预培养—按照“<61>非无菌产品的微生物检查：微生物计数实验”制备供试品，使用10毫升或对应不少于1克或1毫升的数量，接种于100毫升沙氏葡萄糖肉汤培养基，并混匀。在温度30～35℃之间培养3至5天。

选择和再次培养—在沙氏葡萄糖琼脂培养基的平皿中进行再次培养，并且在温度30o至35o之间培养24至48小时。

说明—白色菌落的生长可以表明白色念珠菌的存在。这需通过鉴别检测来证明。

如果这样的菌落不存在或者如果确认鉴别检测为阴性，则供试品符合该检测的要求。

建议的溶液和培养基

[注—本节作为资料提供。]

以下溶液和培养基已经证实能够令人满意地用于药典微生物污染检测中所规定的用途。如果其他培养基具有类似的生长促进和抑制性能，则也可以使用。

贮备缓冲溶液—将34克磷酸二氢钾转移到一只1000毫升容量瓶内，溶解在500毫升纯净水中，用氢氧化钠调整pH值为7.2±0.2，加入纯净水至刻度，并混匀。分装在容器中，并灭菌。在温度2℃到8℃之间贮存。

磷酸盐缓冲液pH值7.2—制备纯净水与贮备缓冲溶液（800:1 v/v）的混合

调整pH的值，以使在灭菌后，温度为25℃时，pH值为7.3±0.2。在高压灭菌器内以经过验证的周期进行灭菌。

内以经过验证的周期进行灭菌。

内以经过验证的周期进行灭菌。

内以经过验证的周期进行灭菌。

内以经过验证的周期进行灭菌。

持续30分钟，立即冷却。

不得在高压灭菌器内加热。

内以经过验证的周期进行灭菌。

且持续摇动，然后在高压灭菌器内以经过验证的周期进行灭菌。

行灭菌。在加热和高压灭菌后，温度25℃时，pH值为5.2±0.2。

冷却到50℃，并倒进Petri培养皿内。不得在高压灭菌器内加热。

值为7.2±0.2。在高压灭菌器内以经过验证的周期进行灭菌。

值为7.4±0.2。在高压灭菌器内以经过验证的周期进行灭菌。

以使在灭菌后，温度为25℃时，pH值大约为6.8±0.2。在高压灭菌器内以经过验证的周期进行灭菌。

以使在灭菌后，温度为25℃时，pH值为7.3±0.2。在高压灭菌器内以经过验证的周期进行灭菌。静置冷却到温度为45℃至50℃之间；如需要，加入相当于20 mg庆大霉素盐基的硫酸庆大霉素，并倒进Petri培养皿内。