8微生物与血库作业指导书要点

ISO15189质量管理体系范本文件（第八册）

微生物与血库

作业指导书

文件编号：ABCD-3-WS-01~10

ABCD-3-WS-01~05

第A版

编制：

审核：

批准：

生效日期：2009年8月8日

ABCD医院检验科

修订页

结核分支杆菌药敏和初步菌种鉴定

1 检验目的

做疾病的病原学诊断，查找于疾病有关的病原菌以及了解微生物与疾病的关系，指导临床治疗及预后和流行病学的调查。

2 原理

若接种的MGIT培养管中有分支杆菌生长，管中的营养成分和氧气将不断被消耗，MGIT 培养管中的荧光显示剂将随着管内氧气浓度的变化而发生反应。一旦培养管内氧气被利用，管内荧光指示剂将在特定光源的激活下释放荧光。BACTEC MGIT960荧光强度记忆探测器将每隔60min连续测定培养管内荧光强度，从而判断管内分支杆菌生长情况。

3 标本要求

（1）标本类型：深部痰液。

（2）标本采集：见标本采集手册

（3）标本储存和运输：室温放置，室温运输并立即送检。

（4）标本拒收状态：非无菌方式采集的标本。

4 容器和添加剂类型

使用灭菌器皿盛放标本，不加任何防腐剂。

5 试剂

（1）试剂名称：Middlebrook7H9培养肉汤，OADC营养添加剂，抑菌剂PANTA。

（2）试剂生产厂家：美国BD生物技术有限公司

（3）包装规格：7X100

（4）试剂盒组成：培养肉汤，营养添加剂，抑菌剂

6仪器设备：

BACTEC MGIT960全自动分支杆菌培养仪；美国BD生物技术有限公司。

酒精灯

显微镜、超净工作台、台式离心机

7校准程序

(送XX市计量质量检测研究所校准)

8操作步骤

见仪器操作维护规程：BD960结核分支杆菌培养仪操作维护规程；

9质量控制：

参加我科质量管理小组组织的各项质量控制活动

10 生物参考区间

阴性

11 患者检验结果的可报告区间

阴性/阳性，

药敏及菌种鉴定见BD960结核分支杆菌培养仪操作维护规程；

12 临床意义：

分支杆菌的药敏试验有助于筛选有效的抗结核药物，提示药物所需的治疗剂量，供临床医生和防痨医生参考；同时，还可了解耐药株的流行情况，为抗结核药物的合理应用提供试验依据。

涂片找抗酸杆菌操作规程

（改良碱性复红法）

1 检验目的

检验样本中是否含有抗酸杆菌，为临床提供诊断依据。

2 原理

结核菌、麻疯杆菌、耻垢菌等抗酸性菌，因其菌体表面有一层脂或脂质之皮膜不易着色，但一经着色后酸或乙醇的作用亦是不容易把它脱色。利用这特性并以增强的染色液予染色，然后再以酸及乙醇加以处理，使其脱色后再对比染色，此时抗酸性菌仍是固定着最初色素的颜色（红色）。

3标本要求

（1）标本类型：病人的痰、穿刺关节液、腹水、胸积液、组织、脑脊液、分泌物、尿液等

（2）标本采集：见标本采集手册（一般须得深咳痰，其它无特殊要求。）

（3）标本储存和运输：可室温保存、室温运送。病人标本须密封运送以避免污染环境。

4 容器和添加剂类型

痰盒、尿杯、试管等

6 试剂

（1）试剂名称：结核菌染色液

（2）试剂生产厂家：广东省结核病研究所统一配制

（3）包装规格：3X500ML

（4）试剂盒组成：

试剂1：石碳酸复红液

试剂2：酸性酒精溶液

试剂3：亚甲基蓝溶液

7仪器设备：

CHKIKO320 奥林巴斯双目显微镜 BH-2奥林巴斯落射荧光显微镜

8 校准程序

送XX市计量质量检测研究所校准

9操作步骤

⑴涂片经火焰固定，加石碳酸复红液染色5分钟或更久（需加温）。

⑵水洗（之后尽可能将水沥干）。

⑶加酸性酒精溶液，脱色1-2分钟。

⑷水洗（假如标本面还可以看到残存红色时，再加酸性酒精溶液脱掉红色为止）。

⑸加亚甲基蓝溶液染色30秒，水洗，干燥。

(6)镜检。

10质量控制：

参加我科质量管理组的质量控制活动。

11干扰和交叉反应

麻风菌可能对检验结果产生影响。

12 生物参考区间

涂片未见抗酸杆菌

13 患者检验结果的可报告区间

涂片未见抗酸杆菌/涂片见细长、红色抗酸杆菌

14 临床意义：

结核分枝杆菌不产生内毒素和外毒素，其毒力主要是在机体中细胞内、外生长与大量繁殖的能力，细菌成分与其代谢产物引起免疫反应（Ⅳ型）导致一系列组织学上的意义。

普通细菌培养鉴定操作规程

1 检验目的

做疾病的病原学诊断，查找于疾病有关的病原菌以及了解微生物与疾病的关系，指导临床治疗及预后和流行病学的调查。

2 原理

人体很多部位与外界相通，存在栖息菌群，但不致病，当菌群失调或分离到致病菌则具有临床意义；另外机体某些部位是无菌的，如检出细菌则视为致病菌。并排除采样及操作污染。

3 标本要求

（1）标本类型：血液，骨髓，脑脊液，胸水，腹水，尿液，等体液；痰液，前列腺液，脓液，组织分泌物或穿刺液等。

（2）标本采集：见标本采集手册

（3）标本储存和运输：室温放置，室温运输并立即送检。人泌尿生殖道标本如白带前列腺液等需临床标本接种于巧克力平板或特殊的运送培养基并置保温设备中送检。

（4）标本拒收状态：非无菌方式采集的标本或未按要求部位采取的标本。

4 容器和添加剂类型

均使用灭菌器皿盛放标本

5 试剂

（1）试剂名称：革兰氏染液、氧化酶试剂、3%触酶、血平板、麦康凯平板、相关生化试剂等

（2）试剂生产厂家：珠海黑马生物技术有限公司

6仪器设备：

（1）接种针、接种环、酒精灯、

（2）BACT-IST黑马微生物鉴定系统。

（3）显微镜、GNP-P270隔水式恒温培养箱、SW-CJ-IF超净工作台、MCO-15A三洋牌二氧化碳培养箱、0414-1台式离心机、FA1004电子天平

7 校准程序

(送XX市计量质量检测研究所校准)

8操作步骤

（1）血液、骨髓、脑脊液等标本按照培养目的增菌培养12-18小时后盲目接种或待自动分析仪报警后接种。

（2）接种：以上增菌标本及其他临床标本用接种环取标本接种环划线血平板及其他选择性培养基上,35℃培养过夜，观察结果。

（3）涂片：肉眼见细菌生长，取生长物涂片做革兰氏染色；

（4）纯培养：根据需要接种血平板、巧克力、中国蓝/麦康凯或厌氧平板过夜培养以获得纯培养。

（5）鉴定：按照鉴定仪要求调配菌液浓度，细菌的鉴定见BACT-IST黑马微生物鉴定系统

12质量控制：

参加我科质量管理小组组织的各项质量控制活动

11 生物参考区间

血液，骨髓，脑脊液等无菌部位采取的标本未见细菌生长；其他标本如大便，痰液为正常菌群或未见致病菌。

12 患者检验结果的可报告区间

细菌鉴定到种或属；菌群调查报告比例。

13 临床意义：

为医生提供病原学诊断，并为进一步药敏实验提供依据。

尿液培养操作规程

1 检验目的

做疾病的病原学诊断，查找于疾病有关的病原菌以及了解微生物与疾病的关系，指导临床治疗及预后和流行病学的调查。患有泌尿系感染时，尿中的细菌数高于104/mL，以此作为诊断泌尿系感染依据。

2 原理

使用BACT-IST黑马微生物鉴定系统，原理见鉴定系统操作规程。

3 标本要求

（1）标本类型：中段尿液。

（2）标本采集：见标本采集手册

（3）标本储存和运输：室温放置，室温运输并立即送检。

（4）标本拒收状态：非无菌方式采集的标本。

4 容器和添加剂类型

使用灭菌器皿盛放标本，不加任何防腐剂。

5 试剂

（1）试剂名称：革兰氏染液、氧化酶试剂、3%触酶、血平板、麦康凯平板、相关生化试剂等

（2）试剂生产厂家：珠海黑马生物技术有限公司

（3）包装规格：4X500Ml

（4）试剂盒组成：试剂1：龙胆紫液试剂2：碘溶液试剂3：脱色液试剂4：沙黄溶液

6仪器设备：

（1）接种针、接种环、酒精灯、

（2）BACT-IST黑马微生物鉴定系统

（3）显微镜、GNP-P270隔水式恒温培养箱、SW-CJ-IF超净工作台、MCO-15A三洋牌二氧化碳培养箱、0414-1台式离心机、FA1004电子天平

7 校准程序

(送XX市计量质量检测研究所校准)

8操作步骤

（1）细菌的分离培养：用接种环取1uL标本接种于血平板及麦康凯琼脂培养基，35℃培养过夜，观察结果。菌落生长者做菌落计数，并挑取优势菌菌落做纯培养。（若初次分离菌落单一且生长较多时可直接做鉴定）

（2）涂片：取菌落涂片做革兰氏染色，确认时G+或G-以及是球菌还是杆菌（球杆菌）。

（3）细菌鉴定及药敏实验:革兰氏阴性杆菌做氧化酶试验（必要时做动力试验），氧化酶试验阳性或氧化酶试验阴性但不利用葡萄糖不产酸者使用非发酵鉴定测试板；氧化酶试验阴性者则使用肠杆菌科细菌测试板；革兰氏阳性球菌（主要是成簇或四联排列），触酶试验阳性者接种葡萄球菌、微球菌鉴定/药敏测试板；触酶试验阴性者则接种链球菌鉴定/药敏测试板；革兰氏阴性双球菌，氧化酶试验阳性者使用淋球菌鉴定/药敏试剂盒测试。

（4）鉴定：按照鉴定仪要求调配菌液浓度，见BACT-IST黑马微生物鉴定系统、PHOENX100全自动细菌鉴定药敏分析系统操作规程。

9质量控制：

参加我科质量管理小组组织的各项质量控制活动

10 生物参考区间

正常人体膀胱中尿液无菌。

11 患者检验结果的可报告区间

细菌鉴定到种或属，菌落计数高于104/mL。

12 临床意义：

为医生提供泌尿系感染的病原学诊断。

血液培养操作规程

1 检验目的

做疾病的病原学诊断，查找于疾病有关的病原菌以及了解微生物与疾病的关系，指导临床治疗及预后和流行病学的调查。

2 原理

使用BACT-IST黑马微生物鉴定系统，原理见鉴定系统操作规程。

3 标本要求

（1）标本类型：血液

（2）标本采集：给患者用抗生素前抽取。见标本采集手册

（3）标本储存和运输：室温放置，室温运输并立即送检。

（4）标本拒收状态：非无菌方式采集的标本。

4 容器和添加剂类型

使用灭菌器皿或鉴定仪配备的血培养瓶盛放标本，不加任何防腐剂，抗凝剂。

5 试剂

（1）试剂名称：革兰氏染液、氧化酶试剂、3%触酶、血平板、麦康凯平板、相关生化试剂等

（2）试剂生产厂家：珠海贝索生物技术有限公司

（3）包装规格：4X250Ml

（4）试剂盒组成：试剂1：龙胆紫液试剂2：碘溶液试剂3：脱色液试剂4：沙黄溶液

6仪器设备：

（1）接种针、接种环、酒精灯、

（2）BACT-IST黑马微生物鉴定系统

（3）显微镜、GNP-P270隔水式恒温培养箱、SW-CJ-IF超净工作台、MCO-15A三洋牌二氧化碳培养箱、0414-1台式离心机、FA1004电子天平

7 校准程序(送XX市计量质量检测研究所校准)

8操作步骤

（1）细菌的分离培养：血培养瓶经12-18小时35℃孵育后，肉眼若见生长则转种血平板及麦康凯琼脂培养基，35℃培养过夜，观察结果。菌落生长者挑取优势菌菌落做纯培养。（若初次分离菌落单一且生长较多时可直接做鉴定）

（2）涂片：取菌落涂片做革兰氏染色，确认时G+或G-以及是球菌还是杆菌（球杆菌）。

（4）鉴定：按照鉴定仪要求调配菌液浓度，见BACT-IST黑马微生物鉴定系统、PHOENX100全自动细菌鉴定药敏分析系统操作规程。

9质量控制：

参加我科质量管理小组组织的各项质量控制活动

11 生物参考区间

正常人体血液无菌。

12 患者检验结果的可报告区间

细菌鉴定到种或属，同时报告药物敏感试验结果。

13 临床意义：

为医生提供感染的病原学诊断。

黑马Bact-ist微生物分析系统操作维护规程

1 主要技术指标

Bact-IST微生物鉴定／药敏分析系统融合了自动化、电脑化及微生物微量生化反应测

试方法，可同时进行微生物分析鉴定（ID）与药敏（MIC）检测，使细菌鉴定／药敏分析规

范化、标准化、现代化。

1.1完善的分析系统：

微生物鉴定分析系统，微生物药敏分析系统

统计分析／院内感染监测专家系统

联网功能

1.2药物种类：

呋喃类，磺胺类，喹诺酮类，青霉素类

大环内酯类，氨基糖甙类，头孢菌素类

1.2鉴定范围：

肠杆菌科，非发酵菌，葡萄球菌属，真菌，

微球菌属，链球菌属，肠球菌属，弧菌属

1.3院内感染检测

环境空气，物体表面，医疗用品，

消毒剂及保存液，血液透析

2 适用范围

黑马Bact-ist微生物分析系统(包括微生物鉴定和药敏分析两大功能)；是对己分离培

养出来的细菌、真菌等微生物进行种、属鉴定，并同时测定该菌对各种抗菌药物敏感/耐药

程度的专用设备。

3 工作原理

自1880年郭霍(Koch)发明固体培养基，对细菌的研究技术有了重大的突破之后，一个多

世纪以来，人类对细菌的研究和认识已经得到了极大的成就，对细菌分类的理论根据和方

法已趋成熟，命名已经统一，对繁浩的各种细菌众多的生物学、物理学特性己基本明确，

从20世纪初开始，形成了利用各种细菌之间生物学、物理学特性的差异或不同，来区别

和鉴定细菌种类的方法，不断丰富发展，沿用至今，成为细菌鉴定的常规方法。

但由于细菌种类繁多，生物学性状错综复杂，实验操作繁琐、费时，不仅初学者不易掌握，有经验者也常感困惑。20世纪70年代，由于电子计算机的发展，有人首先利用信息编码来签定细菌，将复杂的各种细菌的生物学性状建立数据库，被检菌的各种生物性状测出后，输入电脑与贮存信息相比较即刻可判断未知菌的种属。八十年代初己设计出各种多项生物学试验的套装组合，与电脑贮存的项目内容相对应，即细菌的编码鉴定法，很快在全球得到了重视，迅速推广应用。随后，在上述编码鉴定的基础上，又开发研究了各种类型的半自动和全自动的细菌鉴定药敏分析仪器。

黑马微生物鉴定/药敏分析系统，与国际上的其他同类仪器一样，都是按照上述的原则和技术基础而设计和投产的，设计时，细菌的分类、命名、各种细菌的生物学特性和鉴定依据，各项鉴定试验，特别是“关键性试验”的方法和标准，抗生素药物与浓度的选择和敏感度判断标准等，全部按卫生部印发的《全国临床检验操作规程第二版》、《NCCLS 药敏试验法规(2001)》等权威性文献执行，这些文献己与国际接轨，因此，它和国外同类产品的性质和功能基本上是一致的。

4 试剂

采用珠海黑马原配试剂

5 操作步骤与功能特点

黑马微生物自动鉴定／药敏分析系统分为“半自动”和“自动”两种，半自动系统由电脑软件和测试板两部分组成：自动系统是在半自动的基础上再加自动判断装置。使用半自动系统时，先将被测菌制成菌液加注到测试板微孔内，经孵育后，将板上的各项测试结果(阳性或阴性)输入电脑软件的相应界面，便可即刻判定被测菌的种、属名称及其对各种抗菌药物的敏感度，同时生成和打印一份完整的报告。如使用自动系统，则将孵育后的测试板插入自动判读槽内，由仪器自动读取各项试验结果，从而省却人工判读和输入的手续。

黑马微生物鉴定/药敏分析系统具有以下几种功能和特点:

1、细菌鉴定功能：可以将与医学和人类有关的绝大部分细菌及真菌鉴定到“种”及“亚种”水平，这些细菌包括：肠杆菌科中的20个菌属、非发酵菌中的8个菌属、弧菌科中的3个菌属、奈瑟菌科中的2个菌属、微球菌科的3个菌属以及酵母样真菌中的6个菌属，合计近200种细菌(或真菌)。另外，还有性传播疾病(STD)的鉴定／药敏分析系统。

2、抗生素敏感度分析功能：可以根据被检细菌在不同浓度的各种药物中生长状态，分析判断其对各种抗菌药物的敏感／耐药程度，测定的结果以MIC(最小抑菌浓度)表示，并根据所测的MIC，按国际的统一规定(NCCLS)给出S(敏感)、MS(中度敏感)和R(耐药)的判断，还可提示被测菌是否存在β-内酰胺酶、超广谱β-内酰胺酶和耐甲氧西林的状况。同

时，还按NCCLS文件提供每种细菌的选药原则和方法，用户也可以用纸片法或稀释法自行测试，将结果（抑菌圈直径或MIC）输入后，软件可按NCCLS的标准判断其敏感度并打印报告。

本软件还设置了比较完善的“专家系统”，对测试结果进行分析审核和解释。对药敏结果出现的“异常表型”、药物选择和报告中的不合理现象、以及检验者如何正确操作、临床医师用药时要注意的问题等给予提示。同时根据提高疗效、防止滥用的原则，还设置了药敏结果的选择性报告功能。这些对保证药敏结果的可靠性、科学性，对提高药敏试验的“含金量”，以及对临床用药的指导作用，防止滥用、扼制耐药菌株的蔓延等，均有着重要意义。

3、对不合理、可信度低的鉴定试验结果具有提示功能，提出重复试验或加做某顶试验的建议。

4、院内感染和医院环境细菌学监测的分析功能：按照卫生部规定的关于院内感染6种监测而设计，只要将被检病区(或科室)及其生长的菌落数输入后，即可自动生成和打印报告。提示被检单位的菌落总数，国家规定的标准数，并同时给予“及格”或“不及格”的判定。该系统还有完善的院内感染监测的统计分忻系统，可定期将各科室的监测结果统计分析后，向上级主管部门汇报或供院内感染委员会研究。

六种监测是：环境空气的细菌学监测、物体表面的细菌学监测、医务人员手的细菌监测、医疗用品的细菌学监测、使用中的消毒剂及无菌器械保存液的细菌学监测、血透室及透析液的细菌学监测。

5、贮存、查询和联网功能：所有的检验结果资料全部可以长期贮存，随时可以查询回放，已有联网的医院，可以和全院联网，更为方便。

6、统计分析功能：统计分析项目全面，且与WHO推荐的WHONET5软件接轨，具体项目有：

不同标本细菌检出率的统计分析

不同标本中细菌检出百分比率的统计分析

不同病区(病房)细菌发生率的统计分析

不同病区(病房)细菌发生率的月趋势分析

不同菌种的月份比率趋势分析

不同月份不同细菌百分比的统计分析

各种细菌对各种抗菌药物的耐药性分析

各细菌同型生化反应谱的统计分析

耐甲氧西林/β-内酰胺酶葡萄球菌统计分析超广谱β-内酰胺酶统计分析

工作量及经济收入统计

7、手工试验结果输入功能：某些特殊种类的细菌需要用传统的手工试验得以鉴定，或特殊的抗菌药物需要用手工法或纸片法作敏感度测定，也可利用此功能输入结果，生成和打印报告，同时存储资料，参与统计分析。

8 注意事项

1、学习和掌握医学微生物学的专业知识，熟练微生物检验技术。

2、使用仪器和各种测试板之前，仔细阅读《操作说明书》和《用户手册》。

3、建立严格的无菌操作制度，操作时避免杂菌污染检测板，严防致病性的被测菌染及自身和周围环境。

4、分离培养技术过关，严禁将两种或两种以上的细菌混在一齐检测。

5、做好细菌的涂片染色、镜检观察、形态及动力观察、氧化酶、凝固酶等板外操作。

6、遇有比较疑难或有问题的菌株，不应轻易放过，应保留菌种作进一步试验观察，把问题搞清。

9 仪器维护

(1)严格按照仪器的关机程序关机。

(2) 仪器不使用时请罩防尘罩。

(3) 注意检查仪器的运行情况，并填写《仪器使用登记表》。

10 期间核查

由XX市计量质量检测研究所执行

11 相关记录

(1)仪器使用登记表

GNP-9270型隔水式恒温培养箱操作维护规程

1 仪器原理和适用范围

1.1 采用电热器加热、精制双金属片热控温度原理。具有钢板外壳和内箱，中填玻璃棉隔

热等设计特点。

1.2 适用于中小实验室作干燥、恒温培养等工作。

1.3 仪器工作条件——电源220V；50Hz；5A；400W功率；接地良好、桌面稳定；

1.4 环境条件——防震、通风。

2 技术参数

2.1 温度调节范围室温加3℃～60℃；

2.2 温度波动范围±1℃、温度均匀性±1℃；

2.3 最大容量为420×420×500mm3；

3 操作步骤

3.1 接通电源，调节温度旋钮至工作所需温度，观察温度计是否达到，多次微调后定位

3.2 搁置工作物后关上箱盖，直到需取用时拿出；

3.3 放长假不工作前，应拔出电源插头，确保安全。

4 注意事项

4.1 为确保培养目的实现，外插温度计应为合格品，并随时观察温度是否正确；

4.2 为确保仪器内钢制金属内壳与搁板不受腐蚀，酸碱试剂不得置于箱内；

4.3 箱壳必须有效接地,若有电感，应立即切断电源,检查排除故障；

5 仪器维护

5.1 日常维护——保持机外清洁，每月用消毒液清洗机内，经常注意温度变动；

5.2 定期、期间核查按《仪器设备管理程序》进行,定期每年一次、其间1～2次，主要了

解温度恒定、钢制内壳和搁板锈蚀状况等。

6 相关记录

《仪器使用登记表》

BD960结核分支杆菌培养仪操作维护规程1 技术参数

适用于该仪器操作手册所列的分支杆菌的培养鉴定和药敏。

3 工作原理

4 试剂

（1）试剂名称：Middlebrook7H9培养肉汤，OADC营养添加剂，抑菌剂PANTA。

（2）试剂生产厂家：美国BD生物技术有限公司

（3）包装规格：7X100

（4）试剂盒组成：培养肉汤，营养添加剂，抑菌剂

5 操作步骤

（1）标本的采集和处理：吸1ml的痰液加1 ：1的4%的氢氧化钠消化15分钟，取消化液离心10分钟。弃去上清液，加入PH6.8的无菌PBS液5ml，温和混匀。再离心，弃去上清液，加入无菌PBS液1ml充分混匀。

（2）胃液、脑脊液、骨膜液、胸膜液和膀胱穿刺尿等标本要先去污染处理。

（3）在MGIT管标签上直接标记，在无菌条件下用滴管加入0.5mlMGIT OADC营养添加剂；在无菌条件下加入0.1mlMGIT PANTA抗菌素混合溶液。

（4）加入0.5ml处理好的标本（注意：标本量超过0.5ml会增加污染机会）。

（5）旋紧管盖、适当混匀。

（6）将MGIT培养管置入BACTEC MGIT960全自动分支杆菌培养仪孵育培养。

（7） BACTEC MGIT960荧光强度记忆探测器每隔60min连续测定培养管内荧光强度，从而判断管内分支杆菌生长情况。

（8）阳性标本进行涂片，确认为分枝杆菌进行药敏试验后发出报告。

样品要求：

（1）标本类型：深部痰液。