卵黄抗体的研究进展
文献综述
卵黄抗体的研究进展
郑译
西南大学荣昌校区动物医学系，重庆，荣昌402460
摘要：抗体（免疫球蛋白，Ig）是指机体受到外来抗原物质刺激后，B细胞识别抗原后活化、增殖分化为浆细胞，由浆细胞合成和分泌的能与相应抗原特异性识别和结合的一类球蛋白。
关键词：卵黄抗体；免疫程序；研究进展
卵黄抗体（Immunoglobulin of yolk，IgY）经特定抗原免疫后的母鸡可产生相应的特异性抗体，有研究证实[1]，产蛋鸡的卵黄对抗体有浓集作用，使其不断储存于卵黄中，这种抗体称为卵黄抗体。
1 卵黄抗体的概念
卵黄抗体，英文名（vitelline antibody）
定义：从免疫禽蛋中提取出的针对特定抗原的抗体，是一种具有较强免疫功能的蛋白质，多为IgG。禽类免疫后在其卵黄中产生的大量高纯度IgG，其对某些禽类疫病具有明显治疗和紧急预防作用。
卵黄抗体是用特定抗原多次免疫产蛋母鸡，使机体产生相应的特异性抗体，并转移、贮存在卵黄中，经提取纯化的免疫球蛋白
卵黄抗体（Egg yolk antibodies eyAb），也称卵黄免疫球蛋白(Egg yolkimmunogbhin，IgY)。科学家在鸟类的血液循环壁发现三种免疫球蛋白(IgG、IgA 与IgM)，母鸡在细胞分裂产蛋的过程中，会将其免疫球蛋白转移至鸡蛋，母鸡血浆中之IgA与IgM，会在输卵管中与其他的蛋白质结合而构成鸡蛋蛋白的部分。
IgG：免疫球蛋白G (Immunoglobulin G，IgG)的缩写。IgG是血清主要的抗体成分，约占血清Ig的75%。其中40～50％分布于血清中，其余分布在组织中。
IGA：一种免疫球蛋白。异常情况下，在肾脏受到各种炎症反应刺激等因素下，导致IGA过度沉积在肾脏肾小球系膜区等部位，与抗原一起形成免疫复合物，造成肾脏结构病理损害，引起的一系列临床症状，称为IGA肾病。
IGM：免疫球蛋白M(Immunoglobulin M，IgM)的缩写。根据结构的不同将免疫球蛋白分为五种，IgM是三种免疫球蛋白之一，其他还有lgA、lgG、IgD和lgE.。
2卵黄抗体的性质和特点
2．1 产量高
产蛋母鸡是高效率、高质量IgY的“生产工厂”。产蛋母鸡经特定抗原免疫后，可产生持久性应答，效价可维持数月至1年以上。卵黄中IgY的含量超过哺乳动物血清抗体含量。每个卵黄的IgY含量可达100～250 mg(Leslie等，1969)。
2．2 性能稳定
鸡IgY耐酸、耐碱、耐热，理化性质较稳定性。Larsson等(1993)将IgY制剂在4℃条件下贮存5年或在室温下放置6个月，IgY抗体活性仍无明显下降。Hatta等(1993)检测了3种主要消化道酶对抗HRV IgY的影响．将胃蛋白酶和IgY在pH=2条件下温育1 h 后，几乎所有IgY均丧失；而在pH=4条件下温育1 h后保持91％的活性，温育1O h后仍有63％的活性。IgY分别与胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶温育8 h，活性分别保持39％和41％，这说明IgY对这3种酶有一定的抵抗作用。
2．3 安全性高
王忠泽等(2002)用治疗剂量(80～300 mg／kg)的1O～4O倍进行试验，没有发现毒性反应。美国食品和药品管理局(FDA)认为，卵黄免疫球蛋白作为食品比作为药物更有利，并将其列入“一般公认安全物质”范畴。说明规范生产使用卵黄抗体是安全的。
2-4 免疫测定中干扰小
IgY不能识别哺乳动物体内的补体和人Fc受体．不会和类风湿因子及HAMA (人抗鼠抗体)反应。此外，IgY也不会和IgA和IgG结合，可避免这些因素所造成假阳性或假阴性结果。
2-5易获得，适用性广
除上述理化特性外，IgY还有其他重要的生物学特性。卵黄IgG浓度高于血清IgG，单个卵黄(约15 mL)含100 mg以上的IgY，自卵黄中获得IgY较实验动物血清方便，且免去实验动物采血的痛苦。 Y不与哺乳动物补体、Fc受体结合，也不与葡萄球菌蛋白A(SPA)或链球菌蛋白G(SPG) 结合；IgY还不与血清中的类风湿因子(RF)结合，可提高免疫学检测的准确性。因而可用IgY检测粪便中的病毒，因为粪便中含有SPA，用IgY检测可避免假阳性结果。IgY是独特的IgG同种型抗体，同时哺乳动物组织结构较禽类组织具有高度免疫性，IgY用于哺乳动物检测具有明显的优势。许多高度保守的抗原，在哺乳动物中仅产生极小的免疫原性，却可用IgY进行区分。因而在许多方面卵黄抗体可替代哺乳动物抗体。
2-6 绿色无害，没有残留
IgY是禽蛋中天然存在的一种物质，化学本质是蛋白质，发挥作用后即可被机体作为营养物质分解利用，纯品不会残留任何有害物质。用IgY抑杀病原体，作用对象直接准确，不会产生广谱抗生素使用后有益微生物也被一起杀死、致使机体内微生物区系失调、引起继发反应的现象；使用IgY治病，病原微生物不会产生抗药性，不存在给动物用药而影响人类药物治疗效果的问题。多数禽类病原菌对哺乳动物无致病性IgY成为疾病传播媒介的可能性比哺乳动物血清抗体小；与基因工程抗体相比，IgY的生产过程是一个纯天然过程，不需使用肿瘤细胞系等可能造成潜在危险的物质，因此使用禽IgY基因工程抗体更安全。
3．1 制造用鸡的选择
选40—50日龄SPF鸡，用通过SPF鸡传代的野毒滴鼻、点眼，每只鸡接种0．2—0．3mL，在48～72h左右死亡的鸡，无菌采集其法氏囊，并作病变观察，将病变典型的法氏囊低温保存备用。
3．2 疫苗免疫
通常使用组织灭活苗，其制备过程如下：
3．2．1 制苗
取lOg病料加10OraL0．5％甲醛生理盐水，匀浆、冻融、过滤，滤液加8％甘油，置37~C18—24h灭活，即为水剂灭活苗，也可加白油等佐剂，制成油乳剂灭活苗。
3．2．2 无菌检验
取灭活苗0．5mL接种于普通琼脂斜面及厌氧肉汤培养基各一支，于37~C培养48h，应无菌生长。
3．2．3 安全试验及保护试验
经无菌检验合格的灭活苗，肌肉注射、滴鼻、点眼，接种0．3—0．5mL，观察半月，可用1：10强毒0．5mL／只攻毒，观察10～l4天，无发病者为安全有效。免疫程序：第一次免疫，每只鸡肌肉注射lmL，经7一l0天后进行第二次免疫，每只鸡2mL，7天后用琼脂扩散方法测定IgY效价，如已达到1：64以上，即可收集高免蛋，如效价不高，可隔7—1O天进行第三次加强免疫。
3．3 高免卵黄抗体的制备
3．3．1 高免蛋的处理
高免蛋用0．I％新洁尔灭溶液浸泡5分钟，洗涤干净，放人无菌室晾干备用。
3．3．2 分离卵黄
无菌操作，打破蛋壳，分离蛋黄。4．3．3 卵黄匀浆收集的蛋黄置无菌的组织匀浆器中，加等量灭菌生理盐水，并按每毫升加入青霉素、链霉素各1000单位，硫柳汞1．O／万，匀浆、过滤，分装消毒瓶内，4℃冷藏备用。
3．3．4 高免卵黄抗体的检验
无菌检验：取0．5mL高免IgY，分别接种于普通琼脂斜面和厌氧肉肝汤培养基，37cI=培养24—48小时，应无细菌生长。安全检验：取30日龄健康鸡1O只，每只鸡肌注IgY2mL，观察5—7天，应无任何不良反应。卵黄抗体效价测定：用琼脂扩散反应测定，抗体效价应在1：64以上。
1．诊断
如上所述，卵黄抗体较哺乳动物抗体具有明显的优势，诸如不与补体、Fc受体、SPA、SPG RF等结合，同时避免动物采血的痛苦，受到实验动物保护者的欢迎。因而越来越多的人倡议用卵黄抗体取代高免血清，将来会有更多的IgY被用于制备免疫学诊断试剂。目前国外关于此方面的报道较多，而国内相对较少。据报道卵黄抗体已在琼脂扩散试验、乳胶凝集试验、荧光免疫试验、ELISA等免疫学试验中应用于检测细菌、病毒、寄生虫、酶、激素、免疫球蛋白、受体、红细胞抗原等。如Davalos P L等报道利用IgY乳胶凝集方法和IgG蛋白吸附和解吸附、等电点、电动迁移率和胶体稳定性进行比较，证明IgY更有效，IgY比IgG更疏水，而且IgY包被的胶体分散颗粒比IgG更稳定。Cipolla A等分别利用IgY和IgG检测胎儿弯曲菌，IgY显色背景较浅，两者检测阳性率相近，但IgY比较简单易行。Staak C所述IgY用于
以下常规诊断：
(1)通过血蝇昆虫的腹腔血液检测宿主种：(2)利用ELISA检测马媾疣(3)FITC标记Ig 检测狂犬病；(4)FITC标记IgY检测禽病毒病，如NDV／IBV~BDV等。DuP．DH等利用间接夹 t~'ELISA能检测8 ng非洲马瘟病毒，马瘟单抗包被后加入病毒抗原，然后加入抗马瘟IgY个斗l作为二抗，再加入抗IgY酶标绵技l羊抗体进行检测。Hommel U 等动I利用鼠IgG或IgM免疫蛋鸡制备I IgY，作为鼠单抗检测中的二抗，Calzado G E 等报道应用抗人IgG的IgY制备特异性的Coombs试剂，利用人红细胞抗原免疫鸡制备IgY用于鉴定人血型系统
2．疾病防治
卵黄抗体应用于疾病防治的报道较多，范围也非常广泛，在动物、植物和人类疾病防治中均见报道。
(1)禽的病原
鉴于卵黄抗体来源于产蛋母鸡，因而卵黄抗体应用于禽病防治是研究最早、应用最广泛的。国内目前制备的卵黄抗体多数针对禽病防治，主要有抗新城疫病毒、传染性法氏囊病毒、减蛋综合症病毒、鸡脑脊髓炎病毒、鸡病毒性关节炎病毒、鸡传染性喉气管炎病毒、鸭病毒性肝炎病毒、小鹅瘟病毒、番鸭细小病毒等。通常应用卯黄抗体防治的病毒血清型比较单一，卵黄抗体经肌注后吸收进入血液，中和血液中的病毒，达到治疗的目的。这种被动免疫疗法作用较快，但作用时间短，只能应用于紧急治疗。在应用过程中应防止卯黄抗体本身携带污染病原，避免使卵黄抗体成为新的传染源。
(2)猪的病原
在猪的病原中，目前报道制备卵黄抗体的主要是引起胃肠道疾病的病原，特别是引起仔猪腹泻的病原，如产肠毒素性大肠埃希氏菌(ETEC)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)、轮状病毒等。如Yokoyama H等制备的抗ETEC(K88、K99、987P)卵黄抗体；肖池等和李学伍等制备的抗ETEC卵黄抗体；Kweon C等制备的抗PEDV卵黄抗体；本实验室制备的抗ETEC (K88、K99、987P)、TGEV、PEDV混合卵黄抗体。这些卵黄抗体在实验室和临床试验均证实具有明显的治疗效果。
(3)牛的病原
与猪的病原类似，针对牛病原的卵黄抗体主要用于治疗犊牛腹泻。如Kuroki M 等制备的抗牛轮状病毒卵黄抗体Yokoyama H等制备的抗犊牛沙门氏菌卵黄抗体等。卵黄抗体I：1服应用于犊牛，能增强犊牛肠道局部免疫力，防治犊牛肠道传染病。
(4)人的病原
Sarker SA等制备的针对轮状病毒的卵黄抗体应用于颓生婴儿腹泻的治疗具有明显的效果；Amaral JA等应用卵黄抗体治疗因EPEC病原引起的腹泻；Ji—Hyun Shin 等应用卵黄抗体治疗因幽门螺旋菌引起的胃炎。除此之外，Yang J等制备的卵黄抗体可作为携带癌症治疗药物的载体，来自人胃癌细胞的Pll0蛋白作为抗原免疫鸡制备IgY，可特异性识别胃肠道的癌症，因而有可能作为胃肠道癌症治疗药物的载体。
(5)其他抗原
除上述病原外，细胞因子、蛇毒素等也被用于制备卵黄抗体。如WorledgeKL等制备的抗肿瘤坏死因子(TNF)卵黄抗体，静脉注射可有效治疗肠炎；Hlinak A等制备的抗CD14卵黄抗体，CD14表达于单核细胞的表面，为内毒素的受体，制备其卵黄抗体可阻止内毒素的结合；Almeida CM 等制备的抗蛇毒素的卵黄抗体等。
5 卵黄抗体在水产及其他方面的应用
在水产上的应用
李肖梁等(2006)使用灭活的嗜水气单胞菌免疫产蛋鸡，将获得的卵黄加入一定的赋型剂干燥后添加到中华鳖饲料中，研究表明，添加2％抗嗜水气单胞菌卵黄组平均日增重比对照组和2‰无特异性IgY添加剂组提高0．148 g，差异显著，而平均死亡率降低了66．7％、45．5％，同时添加2‰抗嗜水气单胞菌卵黄组平均摄食时间比对照组缩短了24．15％。攻毒试验显示添加2‰抗嗜水气单胞菌卵黄组死亡率比对照组和2‰无特异性IgY组分别降低了80．8％和79．2％，肾脏中细菌数也明显减少。
雷勇(2006)制备的抗WSSV的卵黄抗体添加到对虾基础日粮中，结果20％的卵黄添加量能够在一定程度上延缓螯虾的死亡时间，而4O％的卵黄添加量则能使螯虾死亡率从100％降至30％。刘君君(2007)制备的wssv-igY，在对克氏螯虾攻毒保护性试验中，试验组死亡率为20％，添加有1％ WSSV—IgY蛋白粉和10％的WSSV一卵黄粉组的死亡率分别降低至53．3％、67．7％。在浸泡被动免疫试验中，WSSV—I 浸泡组的死亡率为26．7％。Lu等(2009)比较了抗WSSV的IgY和DNA疫苗的免疫保护效果，显示IgY能够有效保护小龙虾，无论是在使用IgY前，还是使用IgY后接种WSSV后，都能有效保护小龙虾，死亡率仅为20％，显著低于疫苗组的8O％。
其他方面
卵黄抗体在预防仔猪腹泻方面的应用
Hatta(1993)和Ebina(1996)等对121服抗轮状病毒卵黄抗体做了更进一步的研究，体内攻毒试验显示，口服卵黄抗体确实能中和病毒起保护作用。Yokeyama
f1998a．1998b)等进行了一系列特异性卵黄抗体抗沙门氏菌感染的研究，显示出鸡卵黄抗体的特异性保护。Robert等(1988)用卵黄及其提取物成功地抑制组织细胞培养的轮状病毒生长。
卵黄抗体在家禽上的应用
范玉芳等选择I临床无白痢的鸡场，以分离自11个发病鸡场的法氏囊病强毒制备灭活苗，皮下接种，供制备卵黄液，并经无菌及安全检查合格备用。试验表明，注射后12h鸡体内开始有抗体，并在体内维持5—7天，第8天全部转阴。应用该抗体早期预防对缺乏母源抗体的雏鸡可提高被动免疫水平。
卵黄抗体在养猪中的应用
李国平等(2001)¨列试验结果表明：断奶仔猪口服抗大肠杆菌菌毛Igy添加剂可以有效地提高断奶仔猪的生长性能。以断奶后第一周的效果最明显，平均日增重、平均耗料量和饲料报酬分别比不添加组提高76．8％、14．5％和35．1％，说明IgY 添加剂显著促进断奶仔猪的增重和饲料转化，有效地提高断奶仔猪的生长性能。
卵黄抗体在反刍动物中的应用
乳房炎是奶牛的一种常见多发病，是造成奶牛业损失最大的疾病之一。目前防治乳房炎主要采用抗生素法，但由于长期使用致使牛奶中残留了大量抗生素，严重影响牛奶品质。C~eman(1996)¨采用口服Igy法成功治疗了泌乳期如牛的乳房炎，并获得美国专利。
6卵黄抗体的优点和存在的问题
优点
母鸡易于饲养，费用不高，为制备大剂量抗体提供了经济可行的丰富资源；无需采血．只需收集免疫母鸡产下的蛋即可获得抗体．对鸡体无损伤，且符合现代动物保护规则：使用少量的抗原免疫禽类既可获得大量的质量均一的特异性卵黄抗体：由于种系发育距离相差很大，禽类卵黄抗体与哺乳动物免疫球蛋白之间不会发生交叉血清学反应；不激活哺乳动物的补体系统。不与蛋白A、G和Fc受体相结合，避免在免疫检测过程中产生假阴性或假阳性结果；卵黄抗体特异性聚集在卵黄．无IgA，IgM干扰；耐热、耐酸，巴氏灭菌温度下也不会失活：具有安全、高效且无公害的特点，是理想的兽医l临床药物：卵黄抗体制备方法简单。成本低，使用方便且不受时间、地域和季节的限制。
存在的问题
卵黄是良好的微生物培养基，卵黄内含有支原体、沙门氏菌、腺病毒及呼肠孤病毒等可以垂直传播给雏鸡的病原。对制品中可能带有的病原微生物的灭活技术不过关，可造成一些疾病的传播。在卵黄抗体的萃提精制过程中，既要保证抗体生化结构的完整和生物活性，又要彻底去除垂直传播病原，特别是如何保持口服抗体的活性成为亟待解决的～个问题(苏和平，1999)。生产卵黄抗体没有统一的质量标准，没有规范的操作规程，没有用于监测的质量标准。用于制备禽用抗体所选用的商品用家禽自身的抗体水平不，影响到卵黄抗体的效价水平。使用该类禽蛋制备的卵黄抗体时，常对正常的免疫发生干扰作用。另外由于卵黄抗体十分黏稠，所以注射困难、吸收慢，在注射部位易形成干酪样物质、肿大或坏死等，影响抗体的作用及商品外观(王德春，1995)。目前国内制品大多为液态，与微生态制剂混合后会产生腐败现象，其生产工艺是通过冷冻干燥技术提取抗体，大大增加了生产成本。因此该类产品质量有待于进一步提高，产品性状有待改善(胡子信，1994)。如能应用高免蛋纯化卵黄抗体，将它制成精制抗体或干粉抗体，同时寻找降低成本的制备方法，则可发挥其优势，具有很广阔的应用前景。
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卵黄抗体的制作和应用
卵黄杭体是治疗鸡新城疫（ND）和传染性法氏囊病(IBD）的一种特效药。 卵黄抗体的作用 诊断作用：卵黄抗体具有沉淀素的特性，当诊断时，若怀疑鸡群发生传染性法氏囊病，可采取病料5克，加灭菌生理盐水10毫升，研磨，加抗菌剂抑菌，置于冰箱过夜，作为未知抗原，制作备用琼脂板，打成梅花状七孔后，同时加入未知病料抗原和已知的卵黄抗体各一份，约0.5毫升，25℃放置24小时～72小时，出现肉眼可见白色沉淀线，为阳性反应。强阳性反应时,24小时后就可见到沉淀线，即可判定试验鸡群发生了传染性法氏囊病。https://www.360docs.net/doc/887398757.html, 治疗作用：当鸡群发生新城疫或传染性法氏囊病时，可立即皮下注射卵黄抗体1～2毫升，肉鸡可口服卵黄抗体2毫升／只，能阻止病毒进入细胞，形成再感染，中和病毒数量，经2小时就可发现鸡群精神好转，食欲增加，粪便恢复正常。目前，是治疗鸡新城疫、传染性法氏囊病的特效药物。 预防作用：卵黄抗体的使用，在免疫学理论中可成为被动免疫。当免疫缺陷、疫苗缺乏及免疫失败时，可利用卵黄抗体注射、口服替代主动免疫接种，发挥抗病作用。 制作方法：将新城疫I系苗、传染性法氏囊强毒苗连续注射健康无病产蛋鸡三次，第一次1个免疫量，第二次2个免疫量，第三次3个免疫量。待3周后收集母鸡所产的蛋，无菌术取蛋黄，加灭菌生理盐水稀释成1:20的混悬液，测定效价，加入抑菌剂，然后进行分装，在0℃以下保存备用。 卵黄抗体成分与效价卵黄抗体也称母源抗体,IgG抗体。是母体血液中小分子抗体IgG 通过胎盘、输卵管、滋养层传给后代。保存入卵的蛋黄中，若孵化出鸡雏，则对新城疫、传染性法氏囊有特异的抵抗作用。这种抵抗作用称为抗体，其分子结构称为单体Ig,由2条多肽重链和2条多肽轻链组成。沉淀系数7S，分子量160000 ～180000，含糖2.5%。现已发现有四种IgGT型重链同种异型，也称作四个亚型并含硫的半胱氨酸。具有抗感染、抗菌、抗病毒作用。由于氨基酸排列顺序具有高度可变性，能接触到抗原的物质，并发生特异结合，产生中和作用，从而体现特异作用。 卵黄抗体好与否的标准是用HA和HI试验测定的稀释倍数，称为效价，Iog2的指数越大，效价越高，通常把1:64效价称为高免卵黄抗体，其半衰期为4天左右，因此，用卵黄抗体替代主动免疫时间在2周～4周，应科学选择使用日期，注意半衰期，计算保护期，当降到临界线时，应及时补充。中国禽病网 应用方法 解冻．：一般包装有500毫升,250毫升、100毫升瓶装。要把药瓶放在新鲜井水中，浸泡2小时～4小时以上，反复振摇。用肉眼观察，瓶内无冰碴为宜。 注射：可将解冻后的卵黄抗体，在室温下放置半小时，接近室温时（15℃～20℃），再皮下注射1毫升～2毫升。先注射健康鸡群，再注射假定健康群，最后注射病鸡群。注射1只鸡要换1个针头。 注意事项卵黄抗体是生物制品，高温会失效，为方便生产与使用，须冷冻保存和运输，一般在-18℃条件下保存，运输时应特别注意温度变化，冷藏包装运输。 使用卵黄抗体前，一定要了解鸡群是否接种过同种疫苗，并要注意间隔时间；同时，应测定其效价，计算使用量和保护期。 在使用卵黄抗体防治鸡新城疫或传染性法氏囊病时，不得产生依赖思想，同时还要做好卫生、饲养管理和消毒工作，采取综合的防治措施，才能收到满意的效果。
鸡卵黄免疫球蛋白在畜禽生产中的应用前景
鸡卵黄免疫球蛋白在畜禽生产中的 应用前景 Williams等（1962）发现用某种抗原免疫产蛋母鸡，鸡血清中可产生相应抗体，产蛋母鸡又能以产蛋方式将血清免疫球蛋白有效地转移到卵黄中（ROse 和Orlans，1981）。鸡血液中能转移到卵黄中的免疫球蛋白只有免疫球蛋白G （IgG），至今尚未发现卵黄中存在免疫球蛋白A和M（IgA和IgM）（胡清林等，1997）。因此卵黄中的IgG又称为卵黄抗体或卵黄免疫球蛋白（简称1GG ）(Leslie和Clem，1969）。 与哺乳动物的Igh相比，鸡蛋的lgY具有取材方便、提取方法比较简单、产量高等优点。IgY的稳定性较好，可作为口服剂或饲料添加剂用于预防和治疗动物早期的消化道疾病。用禽卵大量制备多克隆抗体是近年来抗体制备技术中新兴的研究领域。本文简介一下IgY的分子结构、功能。特点及分离提纯方法，着重介 绍IgY在畜禽生产中的应用前景。 1 IgY的分子结构与功能 正常鸡的IgY分子量约为180KD，由两条重链和两条轻链组成，分子量分别为67000和2200。IgY的等电点接近5．2.尽管IgY同免疫球蛋白E（IgE）和LgY 有相似的结构特征，但从抗体产生特性及数量来看，IgY与哺乳动物IgG更相似。IgY的基本功能是与特异性抗原结合而发生免疫反应，增强机体的免疫力。 IgY通过口服方式，可用于预防和治疗哺乳动物早期的消化道疾病。 2 IgY的特点 2．l免疫的产蛋母鸡是高效率、高质量的IgY"生产厂"经用特定抗原免疫的
产蛋母鸡，对抗原可产生持久性应答。抗体在卵黄中出现的时间比在血清中约晚一周，一般在母鸡被免疫后15d左右出现，效价可维持数月至一年以上。Hatta 等（1993）报道，经轮状病毒（HRV）免疫成功的母鸡，其所产蛋中的抗HRVIgY 效价可维持一年以上。卵黄中IgY的含量超过哺乳动物血清抗体含量。 每个卵黄中lgY含量可达100～250mg（teslie和CIem，1969）。从一只兔子一个月可提取lgG约200mg，而-只母鸡一个月可提取lgY2000～2800mg（Schade 等，2001）。因此IgY生产效率是哺乳动物lgG的10倍。 2．2 IgY具有良好的稳定性，耐热、耐酸、耐碱较好Shimizu等（1988，1992，1993）研究lgY和哺乳类IgG（牛、山羊、兔）的热稳定性，结果表明IgY与哺乳类（除兔以外则外有着大致相同的热稳定性。发现热（＞75℃）或酸（pH＜3．0）能够降低IgY的抗体活性，温度65℃时IgY活性可保持24h以上，但70℃处理90min 后活性明显下降。Lasson等（1993）将IgY制剂在4℃贮存5年或在室温下放置6个月，经免疫扩散法检测，IgY抗体性仍无明显下降。 IgY对PH值和蛋白水解酶有较好的稳定性。IgY在pH 4．0～11．0时比较稳定，pH值为3．0～3．5时活性迅速下降，pH为12．0时活性也降低。Yolken等（1988）报道，IgY能够抵抗幼龄动物的胃酸屏障，抵抗肠道中胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶的消化。Hatta等（1993）检测了3种主要消化道酶对抗HRVIgY的影响。将胃蛋白酶和IgY在pH2．0温育l h后，几乎所有IgY丧失；而在pH 4．0温育lh后保持91％的活性，甚至温育10 h后仍有63％的活性。IgY分别与胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶温育8h，活性分别保持39％和41％，这说明IgY对这两种酶的消化在一定时间内有抵抗作用。由于幼畜胃内酸度不会太高，IgY在
卵黄抗体作用机理
卵黄抗体 科技名词定义 中文名称：卵黄抗体 英文名称：vitelline antibody 定义：从免疫禽蛋中提取出的针对特定抗原的抗体，是一种具有较强免疫功能的蛋白质，多为IgG。禽类免疫后在其卵黄中产生的大量高纯度IgG，其对某些禽类疫病具有明显治疗和紧急预防作用。 所属学科：免疫学（一级学科）；畜牧免疫（二级学科） 概述 卵黄抗体（yolk antibody, IgY）：通过免疫注射产蛋鸡，即可由其生产的蛋黄中提取相应的抗体，并可用于相应疾病的预防和治疗，这类制剂称为卵黄抗体。 IgY的性质 IgY的性质与哺乳动物的IgG相似。正常鸡IgY的分子量约为180KDa，由两条轻链(2L)和两条重链(2H)组成，分子量分别为60-70KDa和22-30KDa。其等电点约为5.2。IgY 与一般哺乳动物IgG相比，IgY具有较强的耐热、耐酸、抗离子强度和一定的抗酶降解能力。在低于75℃条件下，IgY具有良好的热稳定性。IgY制剂在4℃贮存5年或在室温贮存6个月其活性仍无明显变化或下降，65℃时可保持24h以上，70℃时加热90min后其活性才明显下降60℃，30min条件下巴氏消毒不影响IgY；高于80℃，大部分IgY失去活性。IgY 在pH4.0-11.0时比较稳定，pH3.0-3.5时活性迅速下降，pH12时活性亦有所下降。IgY 对胃蛋白酶有较高的抵抗力，但对胰蛋白酶十分敏感。将胃蛋白酶和IgY在pH2.0温育1h 后，几乎所有活性丧失，但在pH4.0时1h后可保持91%的活性，甚至温育10h后仍有63%活性。IgY分别与胰蛋白酶和胰凝乳酶温育8h，活性分别保持39%和41%。 IgY的作用机理 特定病原菌的卵黄抗体能直接黏附于病原菌的细胞壁上，改变病原细胞的完整性，直接抑制病原菌的生长；卵黄抗体可黏附于细菌的菌毛上，使之不能黏附于肠道黏膜上皮细胞；一部分卵黄抗体在肠道消化酶作用下，降解为可结合片段，这些片段含有抗体的可变小肽(Fab)部分，这些小肽很容易被肠道吸收，进入血液后能与特定的病原菌黏附因子结合，使病原菌不能黏附易感细胞而失去致病性，而IgY的稳定区(Fe部分)留在肠内。 IgY在动物疾病防治方面的应用
特异性鸡卵黄抗体喷剂治疗婴幼儿急性假膜型念珠菌性口炎疗效观察
特异性鸡卵黄抗体喷剂治疗婴幼儿急性假膜型念珠菌性口炎疗效观察 发表时间：2019-03-15T15:19:09.273Z 来源：《医师在线》2018年9月18期作者：邵秀敏刘敏曾碧美韩文 [导读] 特异性鸡卵黄抗体IgY治疗婴幼儿鹅口疮是有效、简便而又安全的治疗方法，有较好的临床应用价值。 （东莞市清溪医院儿科；广东 523660） 【摘要】目的探讨使用特异性鸡卵黄抗体喷剂治疗婴幼儿急性假膜型念珠菌性口炎的可行性。方法 126例2岁以下的原发性鹅口疮患儿被随机分为观察组62例，对照组64例。观察组使用特异性鸡卵黄抗体喷剂病灶喷洒治疗，每日2次；对照组先用等渗碳酸氢钠溶液口腔护理，后用制霉菌素片研粉外涂病灶治疗，每日2次。两组疗程均为7天。结果观察组在开始治疗后口腔斑膜消退的时间明显短于对照组（p＜0.001），治疗7天内的治愈率明显优于对照组（p＜0.01），随访3个月的复发率明显低于对照组（p＜0.03），且药物的不良反应观察组也明显低于对照组（p＜0.05）。结论特异性鸡卵黄抗体IgY治疗婴幼儿鹅口疮是有效、简便而又安全的治疗方法，有较好的临床应用价值。 【关键词】念珠菌性口炎，卵黄抗体，制霉菌素，婴幼儿 [ 中图分类号 ]R2 [ 文献标号 ]A [ 文章编号 ]2095-7165（2018）18-0270-02 急性假膜型念珠菌性口炎（鹅口疮）为2岁以下婴幼儿常见的口腔白色念珠菌感染性疾病，目前的常规治疗为使用抗真菌药物如制霉菌素、氟康唑等局部外用或口服治疗[1]，有效率54%～92%，复发率5.3%～26.3%，有一定副作用（如胃肠道反应、皮疹、肝功能损害、头痛、粒细胞及血小板减少及缺乏等），疗效与安全性不尽于人意。且上述药物目前无适于小婴儿使用的制剂，使用不便，依从性差。广东省东莞市清溪医院儿科前瞻性采用含有白色念珠菌特异性鸡卵黄抗体（IgY）喷剂治疗婴幼儿鹅口疮，并与制霉菌素粉外涂进行比较。现报道如下。 1 资料与方法 1.1 病例选择 1.1.1入选标准 2017年1月1日至2018年5月31日期间来我院门诊就诊的，首次发病，年龄0～2岁，病变仅局限于口腔，无其它伴随疾病的原发性鹅口疮患儿，根据门诊号尾数将奇数纳入实验组，偶数纳入对照组。本研究经医院伦理委员会批准，入选者均签署知情同意书。 1.1.2排除标准复发性鹅口疮病例，继发性鹅口疮病例，同时患有其它疾病或念珠菌感染的范围超出了口腔范围的病例，有鸡蛋过敏史及鸡蛋过敏家族史病例。 1.1.3鹅口疮诊断标准①口腔黏膜上出现乳白色稍突起的柔软小斑点，不久即相互融合成白色或蓝白色丝绒状斑膜，不易拭去，稍用力擦去斑膜后，可见下方的红色糜烂面或有少量出血，斑膜面积大小不等，可出现在舌，颊，腭或唇内黏膜上。②在感染轻微时，没有明显痛感，或仅有进食时痛苦表情，严重时宝宝会因疼痛而烦躁不安，胃口不佳，啼哭，哺乳困难，有时伴有轻度发热。③取口腔斑膜送实验室镜检，可见假菌丝或芽孢阳性。 1.2药物选择特异性鸡卵黄抗体（IgY）喷剂由广州汇高生物科技有限公司出品，商品名：都净抗菌护理液，规格：18ml，用于口腔、皮肤、黏膜的抗菌清洁护理。主要有效成分为复合卵黄免疫球蛋白（IgY），效价≥1:128。对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、溶血性链球菌、变形链球菌、白色念珠菌和绿脓杆菌有杀菌作用。鸡蛋过敏者慎用。产品批号：160809。有效期至：20180803。制霉菌素片由山东鲁抗医药股份有限公司出品，批准文号：国药准字H37022917。规格：50万U/片。 1.3治疗方法对照组采用传统的治疗方式，等渗碳酸氢钠溶液口腔护理，再用制霉菌素片研粉口腔病灶外涂，每次5mg/kg，每日两次，疗程7天；实验组直接用含有白色念珠菌特异性鸡卵黄抗体的抗菌护理液喷在病变的口腔黏膜上，每次3～5喷，每日两次，疗程7天。两组患儿家长均接受详细的药物使用培训，并嘱用药后半小时内勿进食及饮水。 1.4治愈标准临床症状消失，口腔附着白色斑片完全消失，病变局部黏膜外观恢复正常，与周边正常黏膜无差异，口腔拭子镜检无假菌丝或芽孢。 1.5观测指标：两组白色膜状物消失的时间、疗程结束时的治愈率和不良反应发生率、追踪3个月内的复发率。 1.6统计学方法采用SPSS20.0软件进行统计分析，计量资料用t检验，计数资料用χ2检验。P＜0.05为差异有统计学意义。 2 结果 两组患儿的年龄、体重、治疗前的病程比较无统计学统计学意义（P＞0.05）。 两组患儿治疗结果比较见表1。 表1 两组患儿治疗结果比较 安全性方面，观察组无一例出现不良反应；对照组有4例出现食欲下降，其中2例伴恶心，1例伴轻微腹泻，均在停药后自行缓解。两组比较，χ2=4.00，p＜0.05。 3 讨论 婴幼儿细胞免疫功能尚未发育成熟，口腔PH较低，利于真菌生长，可通过外源性、内源性致使患儿感染。各种原因如腹泻、营养不良、长期使用抗生素、激素等使婴幼儿抵抗力低下时，可发生内源性感染；外源性感染主要有直接接触产生，例如产妇存在阴道念珠菌病，在分娩过程中经过接触而感染致病，或哺乳时奶头不干净、不正确的口腔擦拭或洗口、吮吸污染的手指或其它物品而致病。一旦发
卵黄抗体制备及应用
抗鸡球虫卵黄抗体制备及初步应用 作者：钱玮霖指导老师：徐前明 （安徽农业大学植保学院合肥 230061） 摘要：本项目旨在研制抗鸡球虫卵黄抗体，为防治鸡球虫病提供一种新的手段。利用对临床所分离的球虫，经超声波裂解制备粗抗原，然后将所得抗原分别于弗氏完全佐剂和不完全佐剂混合，经肌肉注射方式对鸡蛋进行免疫，收集免疫后的卵黄；采用饱和硫酸铵法分离卵黄中的抗体，并用聚乙二醇浓缩获得较高浓度的抗体；采用凝集试验确定其抗体水平，并采用十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）方法进行抗体纯度分析；最后将所分离的抗鸡球虫卵黄抗体用于鸡感染球虫保护试验。结果表明：（1）临床所分离得球虫多为混合感染，达3种以上；（2）蛋鸡经免疫后，经凝集试验可证实其抗体水平可达1:28，SDS-PAGE电泳显示：纯化后抗体大小为67.0kD 和23kD，且纯度较高。基于上述情况，认为本试验制备出抗鸡球虫卵黄抗体方法并初步阐明了其抗鸡球虫的基本功能。 关键词：鸡球虫病；卵黄抗体；保护试验 引言 鸡球虫病广泛存在于养鸡业中，常造成大批死亡，其死亡率可最高达80％，且病愈鸡生长严重受阻，抵抗力降低，易继发其他疾病。每年，全世界因为鸡球虫病造成的损失高达数十亿美元[1]。因此，鸡球虫病是养鸡业中危害最严重的疾病之一。在我国，特别是在南方地区，由于气温高、湿度大，这种环境利于球虫卵囊的孢子发育，本病常常呈暴发性流行，危害更加严重。 然而，目前对鸡球虫病的防治措施绝大部分多依赖于药物的预防和治疗上,即化学合成药物和抗生素两大类，自从1936年首次出现专用抗球虫药以来，已报道的抗球虫药达40余种，但是因为球虫对药物极易产生抗药性，大量使用化学药物势必会造成严重的药物残留问题等，这也是当今养禽业所遇到最棘手的问题之一。上述问题存在，为临床防治鸡球虫病提出紧迫任务。 卵黄抗体在禽胚孵化过程中逐渐进入禽胚血液，为刚出壳雏鸡提供被动免疫保护，在雏鸡疾病预防中具有重要作用。这种策略得到良好的运用，如鸡法氏囊卵黄抗体在一定程度上解决了临床治疗该病难题，为生产作出了一定的贡献。 卵黄中的主要成分是蛋白质和脂肪，其比例为1：2。大部分蛋白质都是脂蛋白，存在于卵黄颗粒中，不溶于水，只有卵黄球蛋白(α、β、γ)是水溶性的，而IgY是γ卵黄球蛋白。因此IgY的分离纯化首先需要有效地去除卵黄中的脂类，从水溶性蛋白中分离 IgY[2]。多年来，已建立了许多较为高效而经济的方法，这些方法大多以PEG、硫酸葡聚糖、天然胶，如藻酸钠、角叉聚糖或乙醇沉淀等方法初步纯化蛋白质。工业上大规模生产IgY的方法有：超临界二氧化碳气体抽提法、卡拉胶法、硫酸铵盐析法[3]。 开展抗球虫卵黄抗体的研究对家禽球虫病的预防及治疗具有重要意义：(1)该方法建立，为临床防治鸡球虫病提供新思路和策略，可在一定程度上减少抗生素的使用和减少化
卵黄抗体口服免疫疗法防治肠道感染
有效率为14%。在另一项临床研究中,469例转移性乳腺癌患者随机分配至细胞抑制剂加或不加trastuzumab组,细胞抑制剂加trastuzum ab组总有效率显著增高。 对mAb与同位素、药物或毒素结合物的研究大多处于早期,现在来确定其疗效为时尚早。mA b的特异性使它能达到手术范围以外的微小肿瘤灶,因而在这方面是理想的制剂。 抗血小板治疗 急性冠状动脉综合征具有内膜破裂和血小板聚集的共同病理生理机理。糖蛋白Ⅱb/Ⅲa受体拮抗剂能阻断血小板激活和聚集的最终共同途径。abcix imab(Reo-Pro)是第一种进行临床评价的拮抗剂。EPIC对照试验研究了abcix imab静脉注射和12小时输注是否能减少施行血管成形术的高危患者的局部缺血并发症。30天时,与安慰剂组相比,治疗组死亡、心肌梗塞和紧急再血管化手术的总发生率减少35%(分别为12.8%和8.3%)。嗣后两项研究亦表明abcix imab高度显著有效。 对6500例用abcix imab治疗的患者的长期随访结果表明,3年中死亡率降低。短期裨益来自致死性心肌梗塞的预防;后期裨益由减少早期心肌损害产生。这些药理学特性对其他致残性血小板病变(诸如卒中、不稳定型心绞痛和急性心肌梗塞)亦有裨益。 mAb治疗感染性疾病 目前仅有人源化抗呼吸道合胞病毒(RSV)mAb palivizumab(Synagis)获准用于治疗罹患支气管肺发育不良的早产儿和婴儿。在体外和接受paliv izum ab15mg/kg的婴儿的气管抽吸液中,RSV增殖受到paliv izum ab抑制。在一项对1502名RSV感染高危婴儿进行的大规模多中心试验中, paliv izum ab15mg/kg静脉注射使RSV感染住院率减少一半以上,降至4.8%,而对照组为10.6%。对照组和palivizumab组的不良反应发生率相仿。 (史久华编译) 参 考 文 献 1 Breedveld https://www.360docs.net/doc/887398757.html,ncet,2000;355(9205):735-740 2 Vallhonrat H et al.Tr ans plantation,1999;67:253-258 3 Dyer M JS.S emin Oncol,1999;26:52-57 4 Hamm C W et al.N Engl J M ed,1999;340:1623-1629 (2000-11-08收稿) 卵黄抗体口服免疫疗法防治肠道感染 摘要 口服特异性抗体是一种受人关注的方法,它能在人体和动物中建立抗胃肠道病原体的保护性免疫。日益增加的耐抗生素细菌数说明需要寻找抗生素替代物。免疫疗法还能用于治疗传统抗生素难以对付的病原体。本文主要介绍用于口服免疫疗法的卵黄抗体的性质及其预防细菌和病毒感染的研究结果。 关键词 抗体 卵黄 肠道感染 免疫疗法 耐抗生素细菌的日益增多使得传统的抗生素几乎无效,因此寻找抗生素替代物是重要的。特异性抗体口服免疫疗法是一种治疗策略,近十年来已对此项策略积极进行了实验室研究和早期临床研究。在这些研究中应用了多种来源的抗体,包括人Ig G、单克隆抗体、牛初乳和鸡卵黄抗体。 鸡卵黄是受人关注的用于口服免疫疗法的特异性抗体的来源。母鸡受微生物免疫后产生特异性抗微生物抗体,这些抗体能从产 — 23 — 2001年 第24卷 第1期
精制与粗制卵黄抗体的优劣势分析
精制与粗制卵黄抗体的优劣势分析随着养殖业的发展，疾病种类越来越多，某些病原体的变异也越来越快，疾病互传的可能性也越来越大，迫切需要有相应的快速有效的对策来控制疾病的发展，降低死亡，减小损失。毋庸置疑，外源性的特异性抗体是治疗某些特定传染病的最直接最快速最有效的方法。卵黄抗体作为一种价廉易得的外源性特异性抗体，其使用效果已经在临床兽医学上得到了验证和认同。但在畜牧生产实践中，越来越多的人却对卵黄抗体的使用效果产生了怀疑，到底出现了什么问题？ 本文试从精制和粗制卵黄抗体的优劣势分析来探讨这一问题的根源。 鸡、鸭、鹅等禽类的蛋在营养成分上大致相同，主要由蛋黄、蛋清（即蛋白）和蛋壳构成。其中蛋黄约占32%，蛋清约占57%，其余11%为蛋壳。其中蛋黄又由如下图所示的成分所构成： 抗体(免疫球蛋白，Ig)是机体受到外来抗原物质刺激后，机体免疫系统细胞产生的可以特异性地识别和结合外来抗原并使之失活的一类球蛋白。家禽经特定抗原免疫后，可产生相应的特异性抗体进入血液循环，当血液流经卵巢时，特异性抗体在卵细胞中逐渐蓄积，并储存于卵黄中，这种抗体称为卵黄抗体(Immunoglobulin of yolk，IgY)，它是卵黄中唯一的免疫球蛋白，具有特异性和针对性，无毒副作用。下图为抗体结构：
从图中可以看出，在治疗疾病使用卵黄抗体时，起到关键作用的是卵黄中的免疫球蛋白（IgY)，IgY的作用非常广泛，其中最主要的作用有以下几种： 特定的卵黄抗体能黏附于特定病毒的衣壳上，直接抑制病毒的生长繁殖（抑制作用）； 黏附于细菌的菌毛上，使之不能黏附于粘膜上皮细胞，失去感染能力（阻滞作用）； 能够促进单核巨噬细胞的吞噬作用（调理作用）； 中和细菌、霉菌等毒素的毒性（中和毒素）； 与病毒抗原结合使病毒失去感染宿主细胞的能力（中和病毒）。 但大量调查发现，目前市面上可见的家禽用粗制卵黄抗体几乎都是地下作坊生产的“三无”产品，生产环境及产品质量令人堪忧。这些粗制抗体不仅抗体效价难以保证，而且通常会污染禽呼肠孤病毒、禽淋巴白血病病毒、网状内皮增生因子、大肠杆菌、沙门氏菌、支原体等外源性致病原。在注射抗体预防或者治疗疾病时，极有可能造成垂直传播病原或其他一些细菌、病毒的扩散甚至疾病的爆发，带来严重的经济损失。 此外，由于粗抗生产者往往试图通过添加大剂量的甲醛，青、链霉素等措施来延长其产品的保质期，增加所谓的使用安全性，但结果往往是造成更大的应激和严重的药物残留。这就是粗制抗体的购买者和使用者对粗制抗体的使用效果产生疑问的重要原因之一。 精制就是将蛋黄中的免疫球蛋白进行分离纯化的过程。已知蛋黄是由水溶相（Water soluble fraction, WSF）和水不溶相（Water insoluble fraction, WIF）构成的乳浊液。WIF主要为脂蛋白构成，而蛋黄抗体存在于蛋黄的WSF中。WSF中的脂蛋白类含量甚微，
蛋黄免疫球蛋白IgY
自古以来，人们一直把鸡蛋看成是滋补身体的营养品，有谁想到鸡蛋还能制成药用于治疗疾病呢! 自从上世纪70年代末期以后，免疫学家就已经开始将一些抗原物质注射到鸡的体内(这就是所谓的免疫)，然后再从免疫母鸡所生的蛋中提取抗体，并用于诊断和治疗疾病的研究，结果出人意料，优点之多超过传统用动物(如马、羊等)血清抗体所制备的诊断和治疗制品。 IgY的诞生 人类生活在自然界中，时时刻刻都受到周围环境中种种病菌的感染和威胁。由于病菌的侵袭，刺激人体产生抗体，这就是人体免疫力的主要部分。人体的免疫抗体共有五种成分，最重要的一种成分称为IgG，它有抵御和杀灭病菌的作用。鸡与人相似，在自然界中受到病菌的侵袭后，同样能产生抗体，但独特的是，在鸡蛋黄中仅有一种抗体成分——IgG。由于鸡蛋黄的英文名称为YOLK，为了与其它动物血液中的IgG相区别，特取第一个字母Y为代表，将鸡蛋黄中的抗体IgG称为IgY。 鸡蛋黄中的IgY是怎样产生的 由上面的介绍可以知道，鸡蛋中的特异性IgY不是天然生成的，而是受到病菌侵袭后产生的。因此，为了大量提取IgY，免疫学家们应用医学免疫学技术，将一些外源物质(抗原)，例如细菌、病毒以及生物的细胞等注射入鸡的体内，鸡的免疫系统中的B淋巴细胞，受到抗原物质的刺激后便转化为浆细胞，再由这些浆细胞产生能与抗原发生特异性结合的抗体。在免疫鸡的血液中有IgM、IgG、IgA等五种成分，但是IgM和IgA等抗体的分子较大，不能渗透过鸡卵黄囊(蛋清和蛋黄之间的一层组织)，当输卵管内卵黄成熟期时，血液中的IgG被选择性地转输至鸡蛋黄中，因此鸡蛋黄中仅有IgY(即血液中的IgG)一种抗体成分，经提取分离便可得到纯正的IgY抗体。 小小的鸡蛋如何能制备成大量的药 也许有人会问，鸡蛋这么小，从中间能提取多少IgY啊，如何投入批量生产呢？ 鸡经过人工免疫后，体内产生的抗体IgY逐渐通过卵黄囊集中到蛋黄中，它的含量大大超过鸡血清中的IgG。研究表明，62个免疫鸡蛋即可提取出130毫克IgY，由于它的效价(一种免疫学计量单位，代表有效物质的浓度)高，可以大量稀释成有效浓度，这样就可以进行大规模的商品化生产了。 IgY有哪些用途 IgY有许多优点，在免疫治疗方面，鸡产生的抗体耐酸，性能稳定，可用于口服预防人类肠道传染病，如轮状病毒性胃肠炎。IgY耐热，像鲜牛奶一样，经巴氏消毒(亦称低温消毒法，即把样品置于62～65摄氏度，持续20～30分钟)后活性依然存在。而且，应用各种病原微生物或其它病原体免疫鸡产生的IgY，对人体是无毒性物质。以上种种，使IgY 经口服途径给药治疗和预防疾病成为可能。最近我国一些药业厂家同国外公司合作，利用这种技术从鸡蛋黄中提取的一种新药，其有效成分就是特异性IgY，这种现代高新技术的产品，对引起急慢性咽喉炎、扁桃体炎的致病菌有特异性杀伤作用。这就是鸡蛋黄IgY实际应用的一个典型例子。相信在不久的将来，它将会为预防和治疗开创一条新途径。
氯仿法、水解法、卡拉胶法提取鸡蛋中卵黄抗体
氯仿法、水解法、卡拉胶法提取鸡蛋中卵黄抗体 【摘要】卵黄抗体（egg-yolk antibody，IgY）具有一些IgG所没有的优良特性，与哺乳动物的IgG相比，IgY 的提取具有方法简单，提取率高且方法多样等优点。本文旨在对当前条件下卵黄抗体的提取方法进行比较。选取水溶法（Water Dilution，WD）、氯仿法（Chloroform，CHL）和卡拉胶法（Carrageenan，CAR）制备IgY，根据电泳结果，比较三种方法得率高低。SDS-PAGE结果表明，氯仿法的得率较其他两种方法高一些。 【关键词】卵黄抗体；提取；电泳 1.1 卵黄抗体的发现和命名 1893年，Klemperer首次报道了鸡蛋中存在抗体，发现蛋黄中抗体以IgG占优势，而IgM和IgA的含量很少，现已证明了免疫鸡的蛋是提供特异性IgG抗体最方便，最廉价的来源[1]。由于鸡蛋黄的英文名称是“Yolk”，故将鸡蛋黄中的免疫球蛋白IgG称为IgY。 1.2 卵黄抗体的一般性质 卵黄抗体相对分子量约为180kDa，有两条轻链和两条重链组成（2H+2L）。其中轻链（L）相对分子量约为22～30kDa，重链（H）相对分子量约为67～70kDa，等电点接近5.2，含氮量为14.8%，IgY的氨基酸组成与鸡血清IgG和牛IgG不同。此外，还具有以下优点： （1）鸡卵黄中IgY纯度高，含量大。 （2）特异性高。 （3）稳定性好。在室温保存半年，其抗体活性不变，在4℃冰箱贮存6-7年，经免疫扩散法测定其活性降低不超过5%[2]。 （4）产量高。 （5）IgY不激活补体。 （6）IgY能耐酸耐热。 （7）安全。服用安全可靠，王泽中等用治疗剂量（80-300mg/kg）的10-40倍进行试验，没有发现毒性反应。 1.3 IgY的分离、提纯方法
鸡传染性法氏囊病卵黄抗体的制备和检验
鸡传染性法氏囊病卵黄抗体的制备和检验 【实训目标】 （1）学习和掌握卵黄抗体的制各方法。。 （2）学习和掌握卵黄抗体的检验方法。 【实训材料】 1、材料 （1）抗原与血清：鸡传染性法氏囊强毒油乳剂灭活苗；传染性法氏囊病毒阴、阳性血清。 （2）动物：4～8周龄SPF鸡或4～8周龄健康鸡、健康产蛋母鸡及其所产蛋；小鼠。 （3）主要器材；超净工作台、恒温箱、高压锅、离心机、微量加样器、平皿、酒精灯、烧杯、吸管、玻棒、三角瓶、纱布、记号笔、碘酒棉、酒精棉、镊子、1～5ml注射器和pH 试纸等。 2、试剂0.2%～0.5%新洁尔灭、5%碘酊、75%酒精、灭菌生理盐水、青霉索、链霉索、氯仿、琼脂糖；鲜血琼脂平板、马丁肉汤和厌氧肉肝培养基等。 【内容与方法】 （一）鸡传染性法氏囊病卵黄抗体的制备 1、高免鸡蛋的准备选择SPF或临诊健康产蛋鸡，每只皮下或肌肉注射鸡传染性法氏囊强毒油乳剂灭活苗1ml，一般免疫2～3次，每次间隔10～14d，待卵黄抗体的琼脂扩散实验（AGP）效价达1：128以上即可收蛋。收集所产蛋，置4℃冰箱保存（不宜超过1周）。 2、卵黄抗体的制备收集一定数量的高免蛋后，用0 2%～0.5%的新洁尔灭或高锰酸钾水溶液洗净蛋壳表面，再用5%碘酊消毒，最后用75%的酒精脱碘两次。在无菌条件下打开蛋壳，分离卵黄，将卵黄移至无菌量杯或有刻度的烧杯中，加入等量灭菌生理盐水混合。 粗制卵黄抗体：将生理盐水与卵黄的等量混合物，加青霉素、链霉索、硫柳汞，使其终浓度分别为1 000IU／ml、100ug／ml和0. 01%.充分搅拌。—20℃储存备用。 （二）卵黄抗体的检验 1、理化性状 粗制卵黄抗体：鲜黄色，冰冻溶解后有少量卵黄沉淀。 2、无菌检验取高免卵黄抗体0.2ml，分别接种于鲜血琼脂平板、马丁肉汤和厌氧肉肝培养基，37℃培养48h，均应无菌生长。 3、安全检驻用体重18-22g小鼠5只，每只皮下注射本品0.5ml；用14日龄SPF雏鸡5只，每只皮下注射本品10ml；观察l0d小鼠和雏鸡均应全部健活。 4、效力检验 AGP抗体效价测定：8%氯化钠溶液中加入1g琼脂粉，加热融化后，浇制凝胶板。中央l孔外围6孔打孔，孔径3mm，间距4mm。将卵黄抗体用生理盐水做倍比稀释，取1:8、1: 16、1: 32和1：64稀释度的卵黄抗体，分别加入周围4个孔；另外2个孔分别加入IBDV阳性和阴性血清作为对照；中间孔加1BDV AGP抗原，l5～20ul／孔。然后置37℃湿盒孵育24h，在室温放置24～48h。 结果判定；与标准抗原形成白色沉淀线的抗体最大稀释度即为卵黄抗体的效价。AGP 抗原效价应>1: 32。 【思考与练习】 1、卵黄抗体的质量受哪些因素的影响？应如何克服？ 2、精制卵黄抗体与粗制卵黄抗体有何不同，制备过程中应注意什么问题？
卵黄抗体的研究进展
文献综述 卵黄抗体的研究进展 郑译 西南大学荣昌校区动物医学系，重庆，荣昌402460 摘要：抗体（免疫球蛋白，Ig）是指机体受到外来抗原物质刺激后，B细胞识别抗原后活化、增殖分化为浆细胞，由浆细胞合成和分泌的能与相应抗原特异性识别和结合的一类球蛋白。 关键词：卵黄抗体；免疫程序；研究进展 卵黄抗体（Immunoglobulin of yolk，IgY）经特定抗原免疫后的母鸡可产生相应的特异性抗体，有研究证实[1]，产蛋鸡的卵黄对抗体有浓集作用，使其不断储存于卵黄中，这种抗体称为卵黄抗体。 1 卵黄抗体的概念 卵黄抗体，英文名（vitelline antibody） 定义：从免疫禽蛋中提取出的针对特定抗原的抗体，是一种具有较强免疫功能的蛋白质，多为IgG。禽类免疫后在其卵黄中产生的大量高纯度IgG，其对某些禽类疫病具有明显治疗和紧急预防作用。 卵黄抗体是用特定抗原多次免疫产蛋母鸡，使机体产生相应的特异性抗体，并转移、贮存在卵黄中，经提取纯化的免疫球蛋白 卵黄抗体（Egg yolk antibodies eyAb），也称卵黄免疫球蛋白(Egg yolkimmunogbhin，IgY)。科学家在鸟类的血液循环壁发现三种免疫球蛋白(IgG、IgA 与IgM)，母鸡在细胞分裂产蛋的过程中，会将其免疫球蛋白转移至鸡蛋，母鸡血浆中之IgA与IgM，会在输卵管中与其他的蛋白质结合而构成鸡蛋蛋白的部分。 IgG：免疫球蛋白G (Immunoglobulin G，IgG)的缩写。IgG是血清主要的抗体成分，约占血清Ig的75%。其中40～50％分布于血清中，其余分布在组织中。 IGA：一种免疫球蛋白。异常情况下，在肾脏受到各种炎症反应刺激等因素下，导致IGA过度沉积在肾脏肾小球系膜区等部位，与抗原一起形成免疫复合物，造成肾脏结构病理损害，引起的一系列临床症状，称为IGA肾病。 IGM：免疫球蛋白M(Immunoglobulin M，IgM)的缩写。根据结构的不同将免疫球蛋白分为五种，IgM是三种免疫球蛋白之一，其他还有lgA、lgG、IgD和lgE.。
鸡卵黄免疫球蛋白IgY酶联免疫分析
鸡卵黄免疫球蛋白（IgY）酶联免疫分析 试剂盒使用说明书 本试剂盒仅供研究使用。 检测范围：96T 30 ng/L - 900ng/L 使用目的： 本试剂盒用于测定鸡血清、血浆及相关液体样本中卵黄免疫球蛋白（IgY）含量。 实验原理 本试剂盒应用双抗体夹心法测定标本中鸡卵黄免疫球蛋白（IgY）水平。用纯化的鸡卵黄免疫球蛋白（IgY）抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入卵黄免疫球蛋白（IgY），再与HRP标记的卵黄免疫球蛋白（IgY）抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物TMB显色。TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的卵黄免疫球蛋白（IgY）呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），通过标准曲线计算样品中鸡卵黄免疫球蛋白（IgY）浓度。 试剂盒组成 标本要求 1．标本采集后尽早进行提取，提取按相关文献进行，提取后应尽快进行实验。若不能马上进行试验，可将标本放于-20℃保存，但应避免反复冻融 2．不能检测含NaN3的样品，因NaN3抑制辣根过氧化物酶的（HRP）活性。 操作步骤 1.标准品的稀释：本试剂盒提供原倍标准品一支，用户可按照下列图表在小试管中进行稀 2.加样：分别设空白孔（空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同）、标准孔、 待测样品孔。在酶标包被板上标准品准确加样50μl，待测样品孔中先加样品稀释液40μl，然后再加待测样品10μl（样品最终稀释度为5倍）。加样将样品加于酶标板孔底部，尽
量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。 3.温育：用封板膜封板后置37℃温育30分钟。 4.配液：将30倍浓缩洗涤液用蒸馏水30倍稀释后备用 5.洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此 重复5次，拍干。 6.加酶：每孔加入酶标试剂50μl，空白孔除外。 7.温育：操作同3。 8.洗涤：操作同5。 9.显色：每孔先加入显色剂A50μl，再加入显色剂B50μl，轻轻震荡混匀，37℃避光显色 15分钟. 10.终止：每孔加终止液50μl，终止反应（此时蓝色立转黄色）。 11.测定：以空白空调零，450nm波长依序测量各孔的吸光度（OD值）。测定应在加终止 液后15分钟以内进行。 操作程序总结： 计算 以标准物的浓度为横坐标，OD值为纵坐标，在坐标纸上绘出标准曲线，根据样品的OD值由标准曲线查出相应的浓度；再乘以稀释倍数；或用标准物的浓度与OD值计算出标准曲线的直线回归方程式，将样品的OD值代入方程式，计算出样品浓度，再乘以稀释倍数，即为样品的实际浓度。
鸡IBD和ND高免蛋卵黄抗体的测定
鸡IBD和ND高免蛋卵黄抗体的测定 田 冰 (郑州牧业工程高等专科学校,郑州450008) 鸡传染性法氏囊病(IBD)和新城疫(ND)是养鸡业两大烈性传染病。特别是IBD,自1989年以来在我国各地呈持续性暴发流行,给养鸡业造成巨大损失,而利用高滴度的卵黄抗体对易感鸡进行被动免疫或对发病鸡进行特异性治疗,是防制本病的重要措施。为提高IBD、ND的母源抗体水平,掌握卵黄抗体消长规律,并为保护雏鸡和制备双价高免卵黄抗体提供数据,进行了此项试验。 1 材料和方法 1.1 实验鸡 成年商品罗斯蛋鸡200只,曾按常规进行MD、ND免疫。ND血凝抑制(HI)抗体滴度为7log2,IBD琼扩抗体阴性。 1.2 疫苗 IBD弱毒疫苗分别为吉林生物制药厂和郑州生物制药厂生产。IBD-ND油乳剂灭活二联疫苗由河南省农科院畜牧兽医研究所提供。 1.3 免疫方法 首次免疫用IBD弱毒疫苗4羽份饮水,同时用IBD-ND灭活二联疫苗皮下注射1ml。首免后1周进行二免,即用IBD弱毒疫苗10羽份饮水,同时用灭活二联疫苗皮下注射1.5ml。 1.4 抗体测定 首次免疫前和免疫后1,2,3,4,5周及2个月、4个月分别收集试验鸡所产的蛋,测定其IBD 和ND卵黄抗体。IBD卵黄抗体的测定用琼扩法,琼脂板采用含有8%氯化钠的磷酸盐缓冲液100ml加入1g优质琼脂粉煮沸溶制而成的,卵黄用生理盐水倍比稀释,操作和判定按常规方法进行。ND卵黄抗体的测定用β-微量血凝抑制(HI)试验。IBD抗原和阳性血清由哈尔滨兽医研究所提供,ND浓缩抗原及阳性血清由河南农业大学传染病组提供。每次试验随机抽取鸡蛋12枚。 2 结果 2.1 IBD抗体测定结果 免疫前所有实验鸡的卵黄IBD琼扩抗体均为阴性。首免后1周个别鸡(2/12)出现低滴度抗体(1∶2)。首免后2周除4只鸡蛋仍无可测性卵黄抗体外,其余8只均已出现卵黄琼扩抗体,且已达1∶128以上。首免后4～5周卵黄抗体达最高峰,半数以上的卵黄抗体滴度在1∶512以上,并维持2个月以上。免疫后4个月仍维持在1∶256～512。 2.2 新城疫HI抗体测定结果 免疫前鸡群的新城疫卵黄HI抗体滴度在7 log2左右。油乳剂灭活二联苗免疫后1周,抗体水平无明显变化,免疫后2周HI抗体明显上升(9 log2),免疫后3周达11log2以上,并维持2个月。免疫后4个月略有下降,但仍维持在10log2左右。 3 小结和讨论 产蛋鸡IBD弱毒疫苗饮水同时用油乳剂灭活苗免疫后1 周,几乎没有可测性IBD卵黄琼扩抗 体出现。再次免疫后(首免后2周)有66.6%的鸡 出现1∶16以下的卵黄琼扩抗体。免疫后3周均 达1∶128以上,免疫后4个月仍维持在1∶256以 上。因此,为了获得高滴度的IBD卵黄抗体应对 产蛋鸡同时用IBD弱毒疫苗和油乳剂灭活疫苗分 别进行两次免疫,间隔1周。同时,根据卵黄抗体 消长规律,最好在免疫后4周,至少也要到免疫后 3周再开始收集鸡蛋,这样才能保证用于孵化或 制备高免卵黄抗体的鸡蛋含有足够高的抗体。 经过新城疫Ⅱ系和Ⅰ系疫苗免疫过的成年产 蛋鸡,再用IBD-ND油乳剂二联苗免疫后,1周 内ND的HI抗体滴度无明显变化;免疫后2周 (二免后1周)则明显上升,由免疫前的7log2上 升至9log2;免疫后3周上升至11log2,并维持2 个月以上;至4个月时仍维持在10log2左右。这 种具有高抗体的种蛋所孵出的雏鸡,其新城疫的 首免时间应适当推迟为宜。 另外,由于条件所限,本项试验未能对高免鸡 所产的蛋进行孵化,进而测定雏鸡的母源抗体消 长规律,还有待进一步研究。 ? 2 3 ? 河南农业科学
鸡卵黄抗体_IgY_的制备工艺研究
工艺技术食品工业鸡卵黄抗体（IgY）的制备工艺研究 任平国，徐启红 漯河职业技术学院 （漯河 462000） 摘 要对鸡卵黄抗体（简称IgY）的制备工艺进行研究。通过低温乙醇沉淀、DEAE葡萄糖凝胶A-50离子交换层析、Tris-HCl缓冲液洗脱及Sephadex G200凝胶过滤等逐步纯化免疫球蛋白。研究卵黄稀释倍数、pH值、乙醇添加量以及盐浓度对纯化效果的影响。分离纯化后所得的提取物经检测IgY纯度可达98%。用大肠杆菌(E.coli)对其活性进行测定，效果良好，此方法能很好保持免疫球蛋白的活性。 关键词 鸡卵黄抗体(IgY)；乙醇沉淀；分离纯化 Analysis on Preparationg Technologies of Immunoglobulin of Egg Yolk (IgY) Ren Ping-guo，Xu Qi-hong Luohe V ocational Technology College (Luohe 462000) Abstract This paper analyzes preparationg technologies of Immunoglobulin of egg yolk (IgY). Immunoglobulin can be purified gradually through the low temperature ethyl alcohol precipitation, Sephadex G-15 chromatography，A-50 ionic exchange chromatographic analysis, Tris-HCl buffer solution elution and Sephadex G200 gelatin filtration and so on. It has studied the influence on puri? cation of the yolk dilution multiple, the pH value, the ethyl alcohol recruitment as well as the salt density. After the separation purification and examination, the IgY purity in the obtained extraction can be reached 98%. Using Escherichia coli (E.coli) determine its activity, it’s good. This method can maintain the good activity of the immunoglobulin. Keywords immunoglobulin of egg yolk (IgY)；ethyl alcohol precipitation；separation and puri? cation 鸡卵黄抗体，即鸡卵黄免疫球蛋白（Immunoglobulin of egg yolk，简称IgY），具有不与人类补体结合[1]以及不与类风湿因子结合[2]等免疫学特性，现在已被广泛应用于免疫学诊断和医药等许多方面。IgY的制备主要包括含有IgY的蛋黄水溶性蛋白组分(WSF)的分离和WSF中IgY的分离。目前，国际上已经开发了多种鸡卵黄抗体分离纯化法，主要包括有机溶剂抽提、盐析与DEAE色谱相结合、疏水色谱及凝胶过滤等。然而，这些方法普遍存在着制备步骤繁多、批量小、安全性不高和回收率低等问题。为此，我们以Horikoshi[3]等人提出的冰乙醇分级离心法为基础，对冰乙醇分级离心法分离纯化IgY进行深入研究。 1 材料与方法 1.1 材料、试剂与仪器 市售新鲜鸡蛋或4℃保鲜鸡蛋若干；95%冰乙醇（-20℃，预冷）；0.028 mol/L的NaCl溶液；Tris-HCl缓冲液；Sephadex G200凝胶；DEAE葡萄糖凝胶A-50；SDS-PAGE成套电泳试剂；考马斯亮蓝R-250；721分光光度计；LG10-2.4A高速离心机；大肠杆菌 (E.coli)；其他试剂均为分析纯。 1.2 试验方法1. 2.1 蛋黄水溶性组分(WSF)的制备 选择市售新鲜鸡蛋或于4℃保鲜的鸡蛋，用卵黄分离器去除蛋白，之后将卵黄于滤纸上滚动，吸干，刺破卵黄膜，收集卵黄。然后按如下流程操作：卵黄→一定倍数（以体积百分比计）水稀释并搅拌10 min →用HCl调pH后在4℃静置2 h去沉淀→在上清液中加入95 %冰乙醇（-20℃）一定浓度（V/V）→4℃搅拌20 min后离心（22 000 r/min，4℃，25 min）→收集沉淀并加入一定浓度NaCl溶液在4℃下过滤除去脂蛋白沉淀，然后收集滤液得到澄清的WSF。 1.2.2 乙醇沉淀纯化IgY 取制备好的WSF，向其加入95%冰乙醇（-20℃）使其终浓度达到30%（V/V），离心（22 000 r/min，4℃，25 min），将沉淀用蒸馏水溶解，并用DEAE葡萄糖凝胶A-50离子交换层析，Tris-HCl缓冲液（含0.15 mol/L NaCl）洗脱。然后用Sephadex G200凝胶过滤。 1.2.3 蛋白质回收率的确定及IgY纯度的测定 蛋白质回收率可采用福林-酚法进行确定[4]。 IgY的纯度则采用十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）法进行[5]。 1.2.4 IgY的活性检测 以大肠杆菌为试验菌株，进行抑菌实验。将试验 71