层析柱装填及柱效测定及凝胶过滤层析基础知识【参考借鉴】
层析柱装填及柱效测定及凝胶过滤层析基础知识
一、实验目的和内容
目的：1. 掌握凝胶过滤层析的原理，掌握凝胶柱柱效测定方法；
2. 熟悉凝胶层析的一般过程；
3. 了解凝胶介质的选择原则和应用领域。
内容：1. Sephadex G-50凝胶柱的装填；
2. 凝胶柱柱效测定；
3．凝胶再生的方法。
二、实验仪器和试剂
1. 实验仪器
层析柱（1×40 cm），砝码天平，玻璃棒，分部收集器，核酸蛋白质检测仪，记录仪，滴头吸管
2. 实验材料和试剂
Sephadex G-50，0.02mol/L pH8.0的PBS缓冲液，5％丙酮（PBS缓冲液作为溶剂）
三、实验步骤
清洗层析柱
测定层析柱的内径、高度，计算所需凝胶的体积
根据Sephadex G-50的膨胀体积，计算所需干凝胶的质量
称取相应质量的干凝胶，加入其总吸液量10倍的0.02 mol/L PBS
在100℃水浴中加热溶胀1小时以上，溶胀之后将极细的小颗粒倾泻出去
用真空干燥器抽尽凝胶中空气，并将凝胶上面过多的溶液倾出
关闭层析柱出水口，向柱管内加入约1/4柱容积的洗脱液
（重复使用的填料，从此步开始）
边搅拌，边将薄浆状的凝胶液连续倾入柱中，使其自然沉降
等凝胶沉降约2-3cm后，打开柱的出口，调节合适的流速，使凝胶继续沉积
待沉积的胶面上升到离柱的顶端约5cm处时停止装柱，关闭出水口
通过2-3倍柱床体积的洗脱液使柱床稳定(流速0.5～1 mL/min)
始终保护凝胶上端有一段液体
准备好恒流泵、分部收集器、核酸蛋白检测仪及记录仪
打开柱上端的螺丝帽塞子，吸出层析柱中多余液体直至与胶面相切
沿管壁将5%丙酮溶液0.6 mL小心加到凝胶床面上，应避免
将床面凝胶冲起（参考完成时间11：30）
打开下口夹子，使样品溶液流入柱内，同时收集流出液，当样品溶液流至与胶面相切时，夹紧下口夹子
按加样操作，用1 mL洗脱液冲洗管壁2次
加入3－4 mL洗脱液于凝胶上，旋紧上口螺丝帽
将层析柱进水口连通恒流泵，柱出水口与核酸蛋白质检测仪比色池进液口相连，比色池出液口再与自动部分收集器相连，用两根导线将检测仪与记录仪连接起来，设置好基线的位置
洗脱时，打开上、下进出口夹子，用0.02mol/LpH8.0的PBS，以0.5～1 mL/min流速洗脱，记录t r(记录仪纸速设为12cm/h，电压200mv；核酸蛋白监测仪检测波长254nm，灵敏度为
0.1A)，计算单位高度的柱效（参考完成时间16：00）
柱效计算公式：N = 5.54?［θr/( W 1/2)］2
其中，θr为平均洗脱时间，W 1/2为半峰宽。均为无因次特性值，测量时精确到1mm。[Sephadex G-100每米理论塔板数为3000～6000]
四、注意事项
1. 各接头不能漏气，连接用的小乳胶管不要有破损，否则造成漏气、漏液。
2. 装柱要均匀，既不过松，也不过紧，最好在要求的操作压下装柱，流速不宜过快，避免因此压紧凝胶。
3. 始终保持柱内液面高于凝胶表面，否则水分蒸发，凝胶变干。也要防止液体流干，使凝胶混入大量气泡，影响液体在柱内的流动。
4. 所用凝胶比较昂贵，需小心操作，实验后回收，尽量避免浪费和损失。
五、演示
（一）核酸蛋白检测仪及记录仪操作方法
1. 在仪器使用前，首先检查检测器，电源和记录仪三部份电路连接是否正确，插上电源插头。
2. 接通记录仪电源开关，使电源开关拔到“通”指示灯亮。可根据需要调换不同的走纸速度。记录仪量程调在10mV档上。
3. 将检测仪波长旋钮旋到所需波长刻度上，把量程旋钮拔到100％T档。
4. 按下检测仪电源箱面板上的电源开关，此时记录仪指针从零点开始向右移动某一刻度，调节“光量”旋钮使指针停留在记录仪大约中间位置5mV左右数字显示为50左右。仪器开机稳定时间大约在1小时左右，待基线平直后，可加样测试。
5. 把检测器进样口塑料胶管接到部份收集器上，使层析柱中的洗脱液通过。透光率为“0”厂家巳调好，光密度A要调零，量程开关拔到100％T，调节光量旋钮，使记录仪指针在10mV 数字显示为100，即透光率为100%。把量程开关拔到“A”挡，缓慢调节A调零旋钮，使检测仪数字显示为“0” ，同时调节记录仪零位旋纽使记录仪指示在"0"位。
6. 上述5个步骤结束后，就可以在层析柱上加样。当样品经层析柱分离，通过检测后，就能通过记录仪给出所需样品吸收的图谱。
7. 测试完毕，必须切断电源，并用蒸馏水清洗样品池和尼龙管。
记录仪光吸收A读数
当采用l0mV量程记录仪时，记录仪的满量程读数对应于A量程开关所对应的A读数范围。如A量程开关选定在0-0.5A时，则记录仪满量程光吸收A读数为0.5，当记录笔指示在记录纸一半(50%刻度)位置时即为0.25A。
数字显示光吸收A读数(可变量程读数模式)
当A量程开关选定在0-1.0A档时，此时数显板上显示和读数即为光吸收A的实际读数，如显示为080即表示为0.80A。
当A量程开关切换在其它量程位置时，则数显光吸收A读数为:
A量程选定在0-2.0档时，数显读数×2=实际光吸收读数A
A量程选定在0-1.0档肘，数显读数×1=实际光吸收读数A
检测系统的基本特性
第２章 检测系统的基本特性 2.1 检测系统的静态特性及指标 2.1.1检测系统的静态特性 一、静态测量和静态特性 静态测量：测量过程中被测量保持恒定不变（即dx/dt=0系统处于稳定状态）时的测量。 静态特性（标度特性）：在静态测量中，检测系统的输出－输入特性。 n n x a x a x a x a a y +++++= 332210 例如：理想的线性检测系统： x a y 1= 如图2-1-1(a)所示 带有零位值的线性检测系统：x a a y 10+= 如图2-1-1(b)所示 二、静态特性的校准（标定）条件――静态标准条件。 2.1.2检测系统的静态性能指标 一、测量范围和量程 1、 测量范围：（x min ，x max ） x min ――检测系统所能测量到的最小被测输入量（下限） x max ――检测系统所能测量到的最大被测输入量（上限）。 2、量程： min max x x L -= 二、灵敏度S dx dy x y S x =??=→?)( lim 0 串接系统的总灵敏度为各组成环节灵敏度的连乘积 321S S S S = 三、分辨力与分辨率 1、分辨力：能引起输出量发生变化时输入量的最小变化量min x ?。 2、分辨率：全量程中最大的min x ?即min max x ?与满量程L 之比的百分数。 四、精度（见第三章） 五、线性度e L max .. 100%L L F S e y ?=± ? max L ?――检测系统实际测得的输出－输入特性曲线（称为标定曲线）与其拟合直线之
间的最大偏差 ..S F y ――满量程（F.S.）输出 注意：线性度和直线拟合方法有关。 最常用的求解拟合直线的方法：端点法 最小二乘法 图2-1-3线性度 a.端基线性度； b.最小二乘线性度 四、迟滞e H %100. .max ??= S F H y H e 回程误差――检测系统的输入量由小增大（正行程），继而自大减小（反行程）的测试 过程中，对应于同一输入量，输出量的差值。 ΔHmax ――输出值在正反行程的最大差值即回程误差最大值。 迟滞特性 五、稳定性与漂移 稳定性：在一定工作条件下，保持输入信号不变时，输出信号随时间或温度的变化而出 现缓慢变化的程度。 时漂： 在输入信号不变的情况下，检测系统的输出随着时间变化的现象。 温漂： 随着环境温度变化的现象（通常包括零位温漂、灵敏度温漂）。 2.2 检测系统的动态特性及指标 动态测量：测量过程中被测量随时间变化时的测量。 动态特性――检测系统动态测量时的输出－输入特性。 常用实验的方法： 频率响应分析法――以正弦信号作为系统的输入；
凝胶过滤层析的基本操作
凝胶过滤层析的基本操 作 Company Document number：WTUT-WT88Y-W8BBGB-BWYTT-19998
凝胶过滤层析的基本操作 ①凝胶介质的选择 根据待分离蛋白质的分子量选择具有相应分离范围的凝胶。对于未知蛋白，应选用分离范围较宽的凝胶，如用Sephacryl S-300。对于分子量在3~5kDa的蛋白质，脱盐时应选用Sephadex G 50或G 25；而对于小分子量多肽物质（1~5kDa），脱盐则应选用Sephadex G 10或Sephadex G 15。 ②凝胶介质的处理和装柱 商品凝胶一般是干粉，使用前应用水溶胀。一般情况下，1份凝胶加十份水，自然溶胀至少24小时。溶胀后，将上清中细小的凝胶碎块弃除，重新搅拌悬起，待凝胶沉淀后，再次弃去凝胶碎块，重复数次，直到液相澄清为止。为加速溶胀，可将凝胶煮沸一小时，该法同时具有灭菌的作用。 凝胶过滤层析柱的长与直径的比例应为50~100:1。装柱时柱体要垂直，先在柱内加入约 1/3柱床体积的水或缓冲液，然后沿柱一侧将缓冲液中的凝胶（凝胶：缓冲液=3：1）搅拌均匀，缓慢并连续地一次性注入柱内。装柱过程中，要避免柱内缓冲液流干，注意保持柱体凝胶均匀无气泡和裂缝。装完后，可用2 ml蓝色葡聚糖溶液检查柱体的均匀性。如柱体均匀，可见蓝色区带均匀平稳地通过凝胶，不留任何条纹。要保持凝胶和缓冲液温度一致，以减少气泡的产生。 ③上样 凝胶过滤柱层析对于样品的体积有严格的要求。样品体积不应超过柱床体积的1~5 %，如超过5 %，则会导致分离效率降低，低于1 %则分离效率也不会提高，所以蛋白质样品应尽可能浓缩至10~20 mg/ml。样品本身对洗脱液的相对粘度不能超过2，样品粘度过高，会使层析区带不稳定，或流速不规律，区带变宽或扭曲。上样前样品应经μm孔径滤膜过滤或10， 000 g离心5 min，去除残渣，加样时避免破坏柱体表面，保持其表面均匀平整。 ④洗脱 洗脱液应保持一定的离子强度以消除凝胶中含有的游离羧基和硫酸根等与蛋白质的结合作用。Sephadex和Sepharose CL凝胶层析所用的洗脱液的离子强度至少应为 mol/L；Sephacryl凝胶应为 mol/L。有时洗脱溶液的离子强度甚至可达 mol/L，以保证蛋白质不与凝胶介质结合。 在凝胶过滤层析过程中，洗脱速度要恒定。流速不应过高，一般在 1ml/min左右，低流速可提高分辨率。可以用恒流泵控制流速。 ⑤分离蛋白的监测和收集 凝胶过滤层析中，分离蛋白的监测和搜集与离子交换层析相同。
某框架结构柱下条形基础设计
某框架结构柱下条形基础设计
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某框架结构柱下条形基础设计（倒梁法） 一、设计资料 1、某建筑物为7层框架结构，框架为三跨的横向承重框架，每跨跨度为7.2m ；边柱传至基础顶部的荷载标准值和设计值分别为：Ｆk ＝26６5ＫN 、Mk=５72K Ｎ?Ｍ、Vk=146KN ，F=3331KN 、Ｍ=７15ＫN ?Ｍ、V=１82ＫN ；中柱传至基础顶部的荷载标准值和设计值分别为：F ｋ＝42３１KN 、Mk=481K Ｎ?M 、Ｖｋ=165ＫＮ,F=52８9KN 、Ｍ＝601KN ?M 、V=206KN 。 2、根据现场观察描述，原位测试分析及室内试验结果，整个勘察范围内场地地层主要由粘性土、粉土及粉砂组成，根据土的结构及物理力学性质共分为7层，具体层位及工程特性见附表。勘察钻孔完成后统一测量了各钻孔的地下水位,水位埋深平均值为0.9ｍ,本地下水对混凝土无腐蚀性,对钢筋混凝土中的钢筋无腐蚀性。 3、根据地质资料，确定条基埋深d=１.9m; 二、内力计算 1、基础梁高度的确定 取h=1.5m 符合G Ｂ50００７－20０2 8.3.１柱下条形基础梁的高度宜为柱距的 11 ~48 的规定。 2、条基端部外伸长度的确定 据ＧB5０0０7-２０02 8.3.１第2条规定外伸长度宜为第一跨的0.2５倍考虑到柱端存在弯矩及其方向左侧延伸0.250.257.2 1.8l m m =?= 为使荷载形心与基底形心重合,右端延伸长度为ef l ，ef l 计算过程如下： a . 确定荷载合力到E 点的距离o x :
柱下条形基础计算书
1. 工程概况及设计资料 某柱下条形基础，所受外荷载大小及位置如图1.1所示。柱采用C40混凝土，截面尺寸800800mm mm ?。地基为均质粘性土，地基承载力特征值160ak a f KP =，土的重度3 19/KN m γ=。地基基础等级：乙级。地下防水等级：二级。 图1.1 2. 基础宽度计算 基础埋深定为2m 。总竖向荷载值 1000180014004000ki N KN KN KN KN =++=∑ 180********.5 5.334000N KN m KN m e m KN ?+?= = 假设两端向外延伸总长度为3m ，则 4.56313.5L m m m m =++= 地基底面以上土的加权重度3 19/m KN m γ= 查得《地基规范》中对于粘性土： 1.6d η=，0.3b η=
持力层经深度修正后的地基承载力特征值 3(0.5)160 1.619/(20.5)205.6a ak d m a a f f d m KP KN m m m KP ηγ=+-=+??-=()()3 4000 1.789205.620/ 2.013.5ki a G a N KN b m f d l KP KN m m m γ≥ = =--??∑取 2.0b m = 3. 两端外伸长度验算即地基承载力验算 320/ 2.013.5 2.01044k G KN m m m m KN =???= 400010445044ki k N G KN KN KN +=+=∑ 80ki M KN m =?∑ 800.0155244N G KN m e m KN +?= = 113.5 5.445 1.3052l m m ??=-= ??? 213.5 5.055 1.6952l m m ??=-= ??? 5244194.22205.62.013.5ki k k a a a N G KN p KP f KP bl m m +== =<=?∑ ,max ,min 6195.58 1.2246.7524460.015(1)(1)2.013.513.5192.860 ki k k N G a a a k a N G p e KP f KP KN p bl l m m KP ++>=?= ± =±=?>∑
第三章 测试系统的基本特性
第三章 测试系统的基本特性 （一）填空题 1、某一阶系统的频率响应函数为1 21)(+= ωωj j H ，输入信号2 sin )(t t x =，则输出信号)(t y 的频率为= ω，幅值= y ，相位= φ。 2、试求传递函数分别为5.05.35 .1+s 和2 22 4.141n n n s s ωωω++的两个环节串联后组成的系统 的总灵敏度。为了获得测试信号的频谱，常用的信号分析方法有、 和 。 3、当测试系统的输出)(t y 与输入)(t x 之间的关系为)()(00t t x A t y ?=时，该系统能实现 测试。此时，系统的频率特性为=)(ωj H 。4、传感器的灵敏度越高，就意味着传感器所感知的越小。5、一个理想的测试装置，其输入和输出之间应该具有 关系为最佳。 （二）选择题1、 不属于测试系统的静特性。 （1）灵敏度 （2）线性度（3）回程误差（4）阻尼系数 2、从时域上看，系统的输出是输入与该系统 响应的卷积。（1）正弦 （2）阶跃 （3）脉冲 （4）斜坡 3、两环节的相频特性各为)(1ωQ 和)(2ωQ ，则两环节串联组成的测试系统，其相频特性 为 。 （1）)()(21ωωQ Q （2）)()(21ωωQ Q +（3）) ()() ()(2121ωωωωQ Q Q Q +（4）) ()(21ωωQ Q ?4、一阶系统的阶跃响应中，超调量 。 （1）存在，但<5％（2）存在，但<1（3）在时间常数很小时存在 （4）不存在 5、忽略质量的单自由度振动系统是 系统。（1）零阶 （2）一阶 （3）二阶 （4）高阶 6、一阶系统的动态特性参数是 。 （1）固有频率 （2）线性度 (3)时间常数（4）阻尼比 7、用阶跃响应法求一阶装置的动态特性参数，可取输出值达到稳态值 倍所经过的
葡聚糖凝胶层析实验报告
葡聚糖凝胶层析实验报告 一、实验目的 1、学习凝胶(Gel)层析法的基本原理； 2、掌握葡聚糖凝胶（Sephadex）柱层析的操作技术。 二、实验原理 凝胶层析又称排阻层析，凝胶过滤，渗透层析或分子筛层析等。 对于某种型号的凝胶，一些大分子不能进入凝胶颗粒内部而完全被排 阻在外，只能沿着颗粒间的缝隙流出柱外（所用洗脱液的体积为外水 体积）；而一些小分子不被排阻，可自由扩散，渗透进入凝胶内部的 筛孔，尔后又被流出的洗脱液带走（所用洗脱液的体积为内水体积）。 分子越小，进入凝胶内部越深，所走的路程越多，故小分子最后流出 柱外，而大分子先从柱中流出。一些中等大小的分子介于大分子与小 分子之间，只能进入一部分凝胶较大的孔隙，亦即部分排阻，因此这 些分子从柱中流出的顺序也介于大、小分子之间。这样样品经过凝胶 层析后，分子便按照从大到小的顺序依次流出，达到分离的目的。 三、仪器、材料和试剂 1、仪器：内直径为1cm，外直径为1.5cm的层析柱，恒流泵、收集器、酶标仪、试管、烧杯、移液枪。 2、材料与试剂：交联葡聚糖、双蒸水、蛋白溶液样品。 四、实验步骤 1、装柱
将交联葡聚糖溶液用玻璃棒引流导入层析柱中，要注意，不能让柱子中有气泡，可以边装边用玻璃棒搅拌。 2、上样 装好柱后，用移液枪将柱子中上面的水吸出，再用移液枪将1ml 的蛋白溶液加入层析柱中。 3、洗脱和收集 打开恒流泵和收集器装置，待样品刚好渗入到凝胶中时，再向层析柱中加入3-4ml的蒸馏水，此时盖上层析柱的上盖，将上盖的细管插入到盛有双蒸水的烧杯中，调节恒流泵的速度和收集器时间，开始洗脱收集。 4、样品的检测 收集一段时间后，将样品取出，依次编号，依次加入200μl到酶标版上，选用一个孔加入双蒸水作为对照，用酶标仪在280nm下测检测。 五、实验结果及分析 1、实验结果： 2、蛋白质样品洗脱曲线：
柱下条形基础计算方法与步骤
柱下条形基础简化计算及其设计步骤 提要：本文对常用的静力平衡法和倒梁法的近似计算及其各自的适用范围和相互关系作了一些叙述，提出了自己的一些看法和具体步骤，并附有柱下条基构造表，目的是使基础设计工作条理清楚，方法得当，既简化好用，又比较经济合理。 一、适用范围: 柱下条形基础通常在下列情况下采用： 1、多层与高层房屋无地下室或有地下室但无防水要求，当上部结构传下的荷载较大，地基的承载力较低，采用各种形式的单独基础不能满足设计要求时。 2、当采用单独基础所需底面积由于邻近建筑物或构筑物基础的限制而无法扩展时。 3、地基土质变化较大或局部有不均匀的软弱地基，需作地基处理时。 4、各柱荷载差异过大，采用单独基础会引起基础之间较大的相对沉降差异时。 5、需要增加基础的刚度以减少地基变形，防止过大的不均匀沉降量时。 其简化计算有静力平衡法和倒梁法两种，它们是一种不考虑地基与上部结构变形协调条件的实用简化法，也即当柱荷载比较均匀，柱距相差不大，基础与地基相对刚度较 件下梁的计算。 二、计算图式 1、上部结构荷载和基础剖面图 2、静力平衡法计算图式 3. 倒梁法计算图式 三、设计前的准备工作 1. 确定合理的基础长度 为使计算方便，并使各柱下弯矩和跨中弯矩趋于平衡，以利于节约配筋，一般将偏心地基净反力(即梯形分布净反力)化成均布,需要求得一个合理的基础长度.当然也可直接根据梯形分布的净反力和任意定的基础长度计算基础. 基础的纵向地基净反力为： j j i p F bL M bL min max =±∑∑62