现代生物技术进展及产业政策

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课程论文

题目：高活性纤维素分解菌株在不同温度下筛选的研究进展

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高活性纤维素分解菌株在不同温度下筛选的研究进展

摘要: 概述了纤维素酶及其底物，以及它们的相互作用，讲到了纤维素分解菌株的种类和有关特点，总结了一些纤维素分解菌株的筛选方法，在此基础之上分别讲述了在高温、常温、低温条件下筛选菌株的研究进展，最后展望了不同温度条件下筛选菌株，在不同的环境的应用前景及其开发，及其后续研究。

关键字：高活性，不同温度，筛选

引言

纤维素是由葡萄糖以β-1,4-糖苷键连接而成的线状大分子物质, 是植物组织的基本成分,也是绿色植物光合作用的主要产物.它的含量约占植物总量的一半, 是地球上既丰富又能不断再生的有机物质。如此巨大的资源在我们身边却没被好好的利用起来，白白浪费甚是可惜，目前虽然可通过化学或是其他的手段将其利用，但是，从目前的应用效果来看，不是很好，有的浪费了原材料，污染了环境，而且也不经济节约，然而通过生物手段，却可以将纤维素的应用价值最大化。生物手段主要是通过纤维素酶对纤维素的分解从而达到我们的利用目的。然而，纤维素酶的活力却极大的影响着对纤维素的应用，因此对于获取高活性的纤维素酶有了急切的要求，进而寻找到能够产生高活性的纤维素酶的菌株成了研究者们的焦点。然而，为了能够适应不同环境温度条件，应此对于不同温度条件下，筛选出能够产生高活性纤维素酶的菌株是非常有意义。

一、纤维素酶及其底物

纤维素是一种由D-葡萄糖以β-1，4糖苷键组成的大分子多糖，分子量50000～2500000，相当于300～15000个葡萄糖基。常温下它是比较稳定的，为纤维素分子之间通过

氢键连接形成稳定的结构。

纤维素和几丁质分子结构图

纤维素酶根据其催化反应功能的不同可分为内切葡聚糖酶（1,4-β-D-glucan glucanohydrolase或 endo-1,4-β-D-glucanase，EC3.2.1.4），来自真菌的简称EG,来自细菌的简称Cen、外切葡聚糖酶（1,4-β-D-glucan cellobilhydrolase或exo-1,4-β

-D-glucannase，EC.3.2.1.91），来自真菌的简称CBH,来自细菌的简称Cex) 和β-葡聚糖苷酶（β-1,4- glucosidase，EC.3.2.1.21）简称BG。内切葡聚糖酶随机切割纤维素多糖链内部的无定型区,产生不同长度的寡糖和新链的末端。外切葡聚糖酶作用于这些还原性和非还原性的纤维素多糖链的末端,释放葡萄糖或纤维二糖。β-葡萄糖苷酶水解纤维二糖产生两分子的葡萄糖。进一步的研究发现，纤维素酶中纤维素酶的纤维素结合结构域( CBD) 位于氨基端或羧基端, 它借助连接桥( Linker) 与催化结构域( CD) 连接，三者共同起着对纤维素的分解作用。

二、产纤维素酶的菌株

纤维素酶广泛地存在于细菌、真菌、放线菌、昆虫等生物体中，其中细菌和真菌是目前我们研究的最多的生物。

芽孢杆菌：芽孢繁殖快，代谢快、繁殖快，四小时增殖10万倍，标准菌四小时仅可繁殖6倍。无湿状态可耐低温－60℃、耐高温+280℃，耐强酸、耐强碱、抗菌消毒、耐高氧（嗜氧繁殖）、耐低氧（厌氧繁殖）。芽孢杆菌的适应性强,生长pH 值、温度范围广,能分解多种

底物,产酶活性高。孢杆菌中枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌能够产生大量的纤维素酶，并且其产生的酶的活性相对说较高。PH值在8.0，温度为37℃，时间为48h条件下酶活能够达到358.751U/ml酶液[1]

热纤梭菌：热纤梭菌是嗜热产芽孢的严格厌氧菌,革兰氏染色呈阳性,能发酵纤维素和纤维糊精产生乙醇、乙酸、乳酸、氢和二氧化碳,不能发酵戊糖和淀粉。它能够直接在纤维二糖上更好地生存,并且它不是通过纤维二糖酶作用将纤维二糖分解成葡萄糖,而是通过纤维二糖磷酸化酶作用,将纤维二糖转化为葡萄糖-1-磷酸和葡萄糖,因此,生长量是在同等条件下葡萄糖上的2倍，并且产生乙醇等对我们有用的物质。它同时具有较好的热稳定性的优点,它能够存在在70℃条件下而不会有所影响。与真菌相比它产生的酶的活性比较低,但是有研究报道它在晶态纤维素上的生长率大约有关真菌的2倍[2]。

瘤胃细菌:它是存在于牛、羊等食草类反刍动物的瘤胃中的微生物的总称。由于它是存在于动物的瘤胃中，因此对于大多数的具有一层蜡质和角质层的植物颗粒来说，对其的分解具有很大的做用，从而更加充分的利用草类资源，为动物分解产生更加丰富的营养。经过研究表明，瘤胃真菌具有很强的穿透能力和对纤维素的降解能力，它能部分地直接降解纤维素和减弱纤维的抗性组织，从而破坏植物外层的细菌无法分解的较硬的角质层，为细菌的进一步分解提供了可能，更加充分的分解了纤维素。

黑曲霉：它的最适温度是33-37℃，它的菌丝分为营养菌丝和气生菌丝：营养菌丝具有分隔；气生菌丝的一部分形成长而粗糙的分生孢子梗，顶端产生烧瓶形或近球形顶囊，表面产生许多小梗（一般为双层），小梗上着生成串的表面粗糙的球形分生孢子。分生孢子梗、顶囊、小梗和分生孢子合成孢子头，可用于产生淀粉酶、蛋白酶和磷酸二酯酶等，也是酿造工业中的常见菌种。它能够产生量相对较大的纤维素酶、木聚糖酶、果胶酶等能够直接分解但细菌不能分解的纤维素部分，从而通过它与其他的细菌共同作用，更好地分解利用纤维素。

三、菌株的筛选及其应用

菌株的筛选方式大致都是一样的，首先从含有该类菌株的土壤或是腐化物中取样，然后在其适宜的温度条件下，在其能够生长的培养基上进行培养，然后再是取样镜检观察它是否为我们要找的菌株，之后后将其分离出来，再进行扩大培养。但是大致的路线似乎很容易，但是做好做起来却是要根据具体的实际情况进行实验和分析。以下是三类适应不同温度条件

下的菌株的筛选方式及应用。

3.1 嗜热菌株的筛选及其应用:

有关学者在研究的嗜热菌有，赵银瓶等分离的HCp菌株及其筛选见文献[3]，这种菌能够利用滤纸纤维素、纤维素粉、微晶纤维素、脱脂棉和水稻秸秆、明胶等，其次它可以利用葡萄糖、纤维二糖、木糖、木聚糖、果糖、蔗糖、核糖、半乳糖、麦芽糖、山梨糖、海藻糖、蜜二糖、甘露糖等，虽然它的分解和利用的能力有限，但是它具有某些功能，我们可以利用基因工程技术，将其进行定向改造，可以将其相应的功能增强，从而更好地利用资源，但是这种菌的适宜的温度在60℃属于中档的温度。由李相前等研究的海栖热袍菌，菌的培养筛选见文献[4]，通过利用融合构建重组技术，经过诱导表达后，它的酶的最适反应温度达到了100℃，这无疑为我们更好的利用开发好的酶制剂，给出了一个积极的信号。由于嗜热菌株适应了较高的温度环境,它能够在较高的温度环境下正常地生长分裂生殖,从而它能够更好的利用周围的纤维素资源,利用它，首先我们可以从中获取能够在较高温度下分解纤维素的生物蛋白酶,从而我们能够在高温的环境条件下，利用这种特别的酶制剂获得更好的产品。其次我们能够利用这种菌在较高的温度环境下,进行高温发酵,利用纤维素，或者在其他高温条件下开发利用这种菌。

3.2 常温菌株的筛选及其应用:

目前绝大多数的研究的菌种都是属于常温条件下的菌，而且这种菌属于普适类型，应用范围广泛，也因此它的研究种类也是比较多的，且这种菌的筛选温度一般都在30℃左右。目前研究的比较多的是木霉属类的，其中能够产出纤维素酶量大且功能比较强的菌株有里氏木霉。马怀良等从长期堆放稻草的土壤中分离出的NM5菌株经鉴定为木霉菌属，它的筛选见文献[5]，这种菌的最适温度为28℃。由肖舸等从土壤中筛选到的具有较高纤维素酶活性的绿色木霉菌株，它的筛选见文献[6],它的最适温度为28℃~32℃,可以看出我们有些菌株的温度在一定的范围之类，对于不同的菌株其最适温度不同，因此在筛选菌株的时候对于温度的把握也很重要，否则会在一个温度下提取到的是产纤维素酶活性比较低的菌株。

3.3 嗜冷菌株的筛选及其应用:

嗜冷菌株的研究相对来说研究的比较少，它是极端环境下的能源节约型菌。普通纤维

素酶的最适作用温度多为45℃~65℃，而低温纤维素酶的最适作用温度可低至20℃[7]。由于

反应温度较低，不但在低温条件下可以高效反应，而且在生产工艺中可以通过较低温度的热

处理使酶失活，节约能量与费用，因此，逐渐成为人们研究的新方向[8-9]。由黄玉兰等从

高海拔寒冷湿地土壤中分离筛选的缺陷短波单胞菌，其筛选见文献[10],这种菌的最适温度

为20℃，15℃时相对酶活达到80％，并且在5℃，其相对酶活仍保持56％[10]，对于此种菌，

能够在较低温度下，产出具有较高酶活性的酶，可以说它是一种较好的嗜冷菌种。由王玢等

人从黄海深海海底泥中分离筛选的MB1型纤维素分解菌，其筛选见文献[11]，这种菌株能够

产出羧甲基纤维素酶，而且还能降解微晶纤维素，它的最适温度也为20℃，它所产生的酶在

35℃条件下酶活性很高，但是在10℃条件下它仍然具有较高的酶活性。

四、展望

在各种温度条件下都有各种微生物适应那种温度，并能够产出纤维素酶，能够分解各

种环境下的纤维素。微生物是世界上生物种类最多的物种，据目前我们对微生物的了解，我

们还有很多微生物没发现，这也让我们对寻找到各个温度条件下能够产出大量的纤维素酶的

菌种充满了期待和追寻。通过细化温度的范围，一个温度点一个温度点地筛选，寻找到各个

温度条件下对应的产纤维素酶最多的菌株，并把它们收集在一起，建立起它们在各个温度条

件下相应的环境条件的相应的资料库，这无疑为我们今后的利用基因工程技术对它们进行定

向开发提供了重要的资料。从而可以更加明确了，在某个温度条件下有哪些菌能够共同在一

起生存，互利共生，从而达到最大限度的起到分解纤维素，充分利用资源。从而，为新的酶

制剂新能源的开发提供较大的动力作用。

参考文献

[1]祝小，王振华，潘康成，吴敏峰.产纤维素酶芽孢杆菌筛选及发酵条件的初步研究《现代农业科技》，2006，11.

[2]吕福英,闵航,陈美慈.热纤梭菌分解纤维素生产乙醇的研究进展《食品与发酵工业》,1996,No.6.

[3] 赵银瓶,马诗淳,孙颖杰,黄艳,邓宇.嗜热厌氧纤维素分解菌的分离、鉴定及其酶学特性《微生物学报》，2012.

[4] 李相前，邵蔚蓝. 海栖热袍菌内切葡聚糖酶Cell2B与木聚糖酶XynA CBD结构域融合基因的构建、表达及融合酶性质分析《微生物学报》，2006.

[5] 马怀良，郭文学，柴军红. 常温高效纤维素分解菌的筛选《东北农业大学学报》，2010.

[6] 肖舸，雷芳，喻东，唐成康，刘克武，国锦琳，曹威一株产纤维素酶绿色木霉的筛选及发酵条件优化. 2004.4.

[7] Akila handra TS. A novel cold–tolerant Clostridium strain PXYL1 isolated from a psychrophilic cattle manure digester that secretes thermolabile xylanase and cellulose. FEMS Microbiol Lett, 2003(2l9): 63. G, C.

[8] 曾胤新, 俞勇, 陈波, 等. 低温纤维素酶产生菌的筛选、鉴定、生长特性及酶学性质. 高技术通讯, 2005, 15(4): 58?62.

[9] HOU Yun-hua, WANG Tian-hong, LONG Hao, et al. Novel cold-adaptive Penicillium strain FS010 secreting

thermo-labile xylanase isolated from yellow sea. Acta Biochimica et Biophysica Sinica, 2006, 38(2): 142?149.

[10] 黄玉兰，李征，刘晓宁，王培培，张杰. 一株耐低温纤维素酶高产菌株的筛选、鉴定和产酶的初步试验. 《微生物学通报》，2010.5.20.

[11] 王玢，汪天虹，张刚，刘世利. 产低温纤维素酶海洋嗜冷菌的筛选及研究《海洋科学》，2003.出师表

两汉：诸葛亮

先帝创业未半而中道崩殂，今天下三分，益州疲弊，此诚危急存亡之秋也。然侍卫之臣不懈于内，忠志之士忘身于外者，盖追先帝之殊遇，欲报之于陛下也。诚宜开张圣听，以光先帝遗德，恢弘志士之气，不宜妄自菲薄，引喻失义，以塞忠谏之路也。

宫中府中，俱为一体；陟罚臧否，不宜异同。若有作奸犯科及为忠善者，宜付有司论其刑赏，以昭陛下平明之理；不宜偏私，使内外异法也。

侍中、侍郎郭攸之、费祎、董允等，此皆良实，志虑忠纯，是以先帝简拔以遗陛下：愚以为宫中之事，事无大小，悉以咨之，然后施行，必能裨补阙漏，有所广益。

将军向宠，性行淑均，晓畅军事，试用于昔日，先帝称之曰“能”，是以众议举宠为督：愚以为营中之事，悉以咨之，必能使行阵和睦，优劣得所。

亲贤臣，远小人，此先汉所以兴隆也；亲小人，远贤臣，此后汉所以倾颓也。先帝在时，每与臣论此事，未尝不叹息痛恨于桓、灵也。侍中、尚书、长史、参军，此悉贞良死节之臣，愿陛下亲之、信之，则汉室之隆，可计日而待也。

臣本布衣，躬耕于南阳，苟全性命于乱世，不求闻达于诸侯。先帝不以臣卑鄙，猥自枉屈，三顾臣于草庐之中，咨臣以当世之事，由是感激，遂许先帝以驱驰。后值倾覆，受任于败军之际，奉命于危难之间，尔来二十有一年矣。

先帝知臣谨慎，故临崩寄臣以大事也。受命以来，夙夜忧叹，恐托付不效，以伤先帝之明；故五月渡泸，深入不毛。今南方已定，兵甲已足，当奖率三军，北定中原，庶竭驽钝，攘除奸凶，兴复汉室，还于旧都。此臣所以报先帝而忠陛下之职分也。至于斟酌损益，进尽忠言，则攸之、祎、允之任也。

愿陛下托臣以讨贼兴复之效，不效，则治臣之罪，以告先帝之灵。若无兴德之言，则责攸之、祎、允等之慢，以彰其咎；陛下亦宜自谋，以咨诹善道，察纳雅言，深追先帝遗诏。臣不胜受恩感激。

今当远离，临表涕零，不知所言。