现代生物技术复习题

杨晓达部分

一绪论、冻干技术和酶法合成

1.什么是生物技术和生物技术药物？

生物技术：（杨版）指利用微生物（如细菌和酵母等）或者生物产物（如酶等），来完成独特的工业和制造业的过程。应用于生产特殊药物、合成激素、或者大量粮食，也包括有机废物的转化等。

（曾版&教材版）生物技术是应用自然科学及工程学原理，依靠微生物、动物、植物体作为反应器，将物料进行加工

以提供产品来为社会服务的技术，他是微生物学、生物化学和化学工程等多学科密切相关的交叉学科生物技术药物：系指应用基因工程、细胞工程、蛋白质工程等生物技术获得微生物、细胞及各种动物和人源的组织和液体等生物材料，制备用于人类疾病的预防、治疗和诊断的药物。

2.生物技术的核心和关键技术是什么？

生物技术的核心是生物转化

关键技术包括生物转化技术、基因工程技术、工业生物反应器技术、冷冻干燥技术等。（杨课件上标key字样的）

3.什么是合成生物学？未来的影响有哪些？

基于系统生物学的遗传工程，从基因片段、人工碱基DNA分子、基因调控网络与信号传导路径到细胞的人工设计与合成，将工程学原理与方法应用于遗传工程与细胞工程等生物技术领域

通过联合不同的成分部分创造新功能、通过工程学提高对于现有生物系统的认识，在未来50年内引发第三次工业革命

4.青蒿素的前体药物的生物制备过程如何？

5.基于细胞的生物制备的基本流程如何？

6.基于生物酶的生物制备的基本流程如何？

7.什么是代谢工程改造？

通过影响酶的活性、运输性质和常规功能干预细胞代谢活动

8.基因工程在生物技术中的作用有哪些？

提高产量和生产率、生产新化合物、扩大酶的底物范围、发展可以替代传统化学方法的新的生物合成途径

改良细胞性能

9.工业生物制备和实验室条件的差别是什么？

实验室：小型反应器，旋转器和摇瓶

工业生物制备：工业生物反应器，大容量，

更高的培养基多相性，更大的湍流强度和局部切变应力

（往届复习资料里说）通过更长的混合时间所引起的培养媒介的多相性，来使微生物和细胞的局部环境变化达

到一个更宽的范围。此外，通过增加反应器的规模，湍流强度和局部切变应力也会被加强。这种局部等级的强

烈变动会引起对微生物和细胞的应激

10.什么是冷冻干燥，其过程是什么？为什么是是生物技术产品制备的基本关键技术？

冷冻干燥技术是把含有大量水分的物料预先进行降温，冻结成固体，在真空条件下，使冰直接升华，以水蒸汽的形式除去，从而得到干燥品德一种技术。可以避免常规干燥过程中热不稳定的生物制品在高温条件下变质。

冻干箱空箱降温-40~-50℃，放入产品预冻。

油泵抽真空。

第一步加热，温度不超过共熔点，使冰大量升华。

第二步加热，以提高干燥程度，一般温度控制在40℃以下

1冷冻至固体2抽真空3升温，大剂量水升华除去4升温，进一步升华，结合水、吸附水除去（可能会画图分析）

11.生物制备对酶特性的要求有哪些？

高效性、专一性、更稳定、耐热，抗抑制、抗蛋白酶水解、抗原性减少或消除。（所谓专一性）有一定的区域和立体选择性，但对底物的要求不要太高，选择性不要太强，能够催化不同的底物。

12.举例说明酶法合成手性氨基酸（举例）？

13.为什么需要酶固定化，有哪些方法？

原因：（往届资料说）提高效率、提高稳定性、易于分离、可重复使用

（貌似是课堂笔记说）酶稳定性差，易变性失活；酶和底物只能反应一次，难于回收利用，成本高且难于连续化生产；反

应液中混入酶蛋白，使产品的分离纯化复杂化

固定方法：（教材版）

载体结合法：a物理吸附法：是以固体表面物理吸附为依据，使酶与水不溶性载体相接触而达到酶吸附的目的

b离子吸附法：通过离子效应，将酶分子固定到含有离子交换基团的固相载体上

c螯合法：利用螯合作用将酶直接螯合到表面含过渡金属化合物的载体上，具有较高的操作稳定性

d共价结合法：通过酶分子上的官能团，与载体表面上的反应基团发生化学反应形成共价键的固定

方法

共价交联法：通过双功能或多功能试剂在酶分子间或酶分子和载体间形成共价键的连接方法

包埋法：将酶包埋在高聚物凝胶网格中或高分子半透膜中的固定方法。前者又称凝胶包埋法，后者则称微囊法

二免疫分析法

14.什么是抗体？其结构特征是什么？怎么由基因编码一个抗体？

抗体：机体在抗原物质刺激下，由B细胞分化成的浆细胞所产生的、可与相应抗原发生特异性结合反应的免疫球蛋白

两条重链两条轻链，两个Fab段一个Fc段，VL、CL，VH、CH段

2个基因决定一个蛋白质

15.什么是抗原决定簇？一个抗原分子是否只有一个抗原决定簇？

决定抗原性的特殊化学基团

一个抗原分子上可能有数个抗原决定簇

每個抗原决定簇至少誘生一种专一性抗体

蛋白质抗原的决定簇含有六个以上氨基酸

16.抗体与抗原结合的特异性如何？为何有如此高的特异性？

与抗原的结合力强，高度专一性

17.抗体有哪些应用？

18.什么是抗体的Fab片段和Fc片段？其结构分别是如何？

19.什么是单抗和多抗？分别是如何制备的？哪一种抗体的特异性高？为什么？

多克隆抗体（polyclonal antibody）指由不同B细胞产生的针对多种抗原决定簇的多种抗体混合物，如免疫血清。

制备：抗原做成乳剂，注入实验动物体内，多次免疫后，得到传统的抗血清

单克隆抗体（monoclonal antibody）指由一种 B 细胞生产，针对某一抗原决定簇的单一抗体。

制备：抗原注入实验动物体内，形成杂交瘤细胞，用ELISA方法分离鉴定合适的杂交瘤细胞，培养该细胞得到抗体

20.什么是抗体库？

抗体库技术是将某种动物的所有抗体可变区基因克隆在质粒或噬菌体中表达，利用不同的抗原筛选出携带特异抗体基因的克隆，从而获得相应的特异性抗体。

21.什么是单链抗体？什么是ScFv？如何制备单链抗体？单链抗体有何应用？

在重链与轻链之间加上一段连接肽，连成一条单链

如果仅是两条链的可变区，称为ScFv

22.什么是二抗？二抗与一抗如何结合的？如何选择使用二抗？

二抗的Fab段VL部位结合于一抗的Fc段

23.什么是Protein A？Protein A结合于抗体的什么部位？

Fc段

24.什么是免疫分析？有哪些特点

免疫分析：利用抗原与抗体之间高特异性反应实现对抗体、抗原或相关物质进行检测的分析方法。

高灵敏，高特异性，高准确性

25.有哪些主要类型的免疫分析？

根据标记物的不同，可分为：放射免疫分析法（RIA）、荧光免疫分析法（FIA）、酶免疫分析法（EIA）、化学发光免疫分析法（CLIA）重要方法：FIA、RIA、酶联免疫吸附试验（ELISA）、免疫染色法、免疫印迹法（Western blot）等

26.免疫分析有几种实验设计方式？

a用标记抗体与待测抗原结合，再加捕获抗体（二抗），检测复合物浓度（ELISA双夹心法）

b用标记抗体与待测抗原结合，再加捕获抗原与剩余抗体结合，检测捕获抗原-标记抗体复合物浓度

c加入抗体与标记抗原，通过标记抗原与待测抗原的竞争结果，推断待测抗原浓度（RIA法）

27.抗体标记有哪些种类和方法？

放射性同位素标记、荧光标记（有机分子荧光标记，绿色荧光蛋白标记，稀土荧光标记）、酶标记、通用标记

28.什么是RIA，其分析方法的原理和要点有哪些？

放射免疫分析是以放射性同位素为示踪物，与免疫反应相结合的一种分析方法。

其基本原理是利用待测抗原和标记抗原同特异性抗体之间存在着竞争性的结合，通过对竟争后剩余标记抗原及标记抗原-抗体复合物的测定推断待测抗原

要点：1制作标准曲线：恒量的Ag*（标记抗原）、Ab加入反应管中，加入待测抗原标准品（已知浓度），37℃或4℃温育，加入分离剂分离结合抗原抗体复合物及游离抗原，测定以总放射性为分母，测定Ag*Ab为分子，计算结合%，以结合率为纵坐标，浓度为横坐标，制作标准曲线 2待测抗原用同上发法测定结合率，带入标准曲线求浓度

29.什么是ELISA？其分析原理和要点是什么？

Enzyme Linked Immunosorbent Assay酶联免疫吸附法

使抗原或抗体结合到某种固相载体表面，并保持其免疫活性。使抗原或抗体与某种酶连接成酶标抗原或抗体，这种酶标抗原或抗体既保留其免疫活性，又保留酶的活性。在测定时，把受检标本（测定其中的抗体或抗原）和酶标抗原或抗体按不同的步骤与固相载体表面的抗原或抗体起反应。用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与其他物质分开，最后结合在固相载体上的酶量与标本中受检物质的量成一定的比例。加入酶反应的底物后，底物被酶催化变为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据颜色反应的深浅刊物定性或定量分析。由于酶的催化频率很高，故可极大地地放大反应效果，从而使测定方法达到很高敏感度。

常见方法用途及主要步骤：

（一）双抗体夹心法

双抗体夹心法是检测抗原最常用的方法，操作步骤如下：

（1）将特异性抗体与固相载体连接，形成固相抗体：洗涤除去未结合的抗体及杂质。

（2）加受检标本：使之与固相抗体接触反应一段时间，让标本中的抗原与固相载体上的抗体结合，形成固相抗原复合物。洗涤除去其他未结合的物质。

（3）加酶标抗体：使固相免疫复合物上的抗原与酶标抗体结合。彻底洗涤未结合的酶标抗体。此时固相载体上带有的酶量与标本中受检物质的量正相关。

（4）加底物：夹心式复合物中的酶催化底物成为有色产物。根据颜色反应的程度进行该抗原的定性或定量。

根据同样原理，将大分子抗原分别制备固相抗原和酶标抗原结合物，即可用双抗原夹心法测定标本中的抗体。

（二）双位点一步法

在双抗体夹心法测定抗原时，如应用针对抗原分子上两个不同抗原决定簇的单克隆抗体分别作为固相抗体和酶标抗体，则在测定时可使标本的加入和酶标抗体的加入两步并作一步（图15-5）。这种双位点一步不但简化了操作，缩短了反应时间，如应用高亲和力的单克隆抗体，测定的敏感性和特异性也显著提高。单克隆抗体的应用使测定抗原的ELISA提高到新水平。

在一步法测定中，应注意钩状效应（hookeffect），类同于沉淀反应中抗原过剩的后带现象。当标本中待测抗原浓度相当高时，过量抗原分别和固相抗体及酶标抗体结合，而不再形成夹心复合物，所得结果将低于实际含量。钩状效应严重时甚至可出现假阴性结果。

30.什么是荧光偏振免疫分析？原理是什么？

荧光偏振免疫分析法(fluorescence polarization immunoassay，FPIA)是一种定量免疫分析技术，其基本原理是荧光物质经单一平面的蓝偏振光(485nm)照射后，吸收光能跃入激发态，随后回复至基态，并发出单一平面的偏振荧光(525nm)。偏振荧光的强弱程度与荧光分子的大小呈正相关，与其受激发时转动的速度呈反相关。FPIA最适宜检测小至中等分子物质，常用于药物、激素的测定。

荧光偏振免疫分析常用于测定半抗原的药物浓度。反应系统内除待测抗原外，同时加入一定量用荧光素标记的小分子抗原，使二者与有限量的特异性大分子抗体竞争结合。当待测抗原浓度高时，经过竞争反应，大部分抗体被其结合，而荧光素标记的抗原多呈游离的小分子状态。由于其分子小，在液相中转动速度较快，测量到的荧光偏振程度也较低。反之，如果待测抗原浓度低时，大部分荧光素标记抗原与抗体结合，形成大分子的抗原抗体复合物，此时检测到的荧光偏振程度也较高。荧光偏振程度与待测抗原浓度呈反比关系。我们测定待测抗原标准品后制标准曲线。通过检测反应系中偏振光的大小，从标准曲线上就可以精确地得知样品中待测抗原的相应含量。

31.什么是时间分辨荧光免疫分析？用什么标记物？

时间分辨荧光免疫分析（Timeresolved Fluoroimmunoassay,TRFIA）是一种非同位素免疫分析技术，它用镧系元素标记抗原或抗体，根据镧系元素螯合物荧光寿命很长的特点，用时间分辨技术测量荧光，同时检测波长和时间两个参数进行信号分辨，可有效地排除非特异荧光的干扰，极大地提高了分析灵敏度。与FPIA相比克服了酶标不稳定，化学发光仅能一次，易受环境干扰的缺点。

解离增强镧系元素荧光免疫分析（DELFIA）是时间分辨荧光免疫分析中的一种。它用具有双功能基团结构的螯合剂，使其一端与铕（Eu）连接，另一端与抗体/抗原分子上的自由氨基连接，形成EU标记的抗体/抗原，经过免疫反应之后生成免疫复合物。

由于这种复合物在水中的荧光强度非常弱，因此加入一种增强剂，使Eu3+从复合物上解离下来，自由Eu3+同增强剂中的另一种螯合剂螯合形成一种胶态分子团，这种分子团在紫外光的激发下能发出很强的荧光，信号增强了百万倍。因为这种分析方法使用了解离增强步骤，因此称为解离增强镧系元素荧光免疫分析。

32.什么是免疫细胞/组织染色？

用标记（一般采用荧光、冷光物质或者酶标记）的抗体对细胞或组织内的相应的抗原进行定性，定位或定量检测。经过组织化学的呈色反应而呈现醒目的阳性色彩，用显微镜，荧光显微镜或电子显微镜观察。凡是能作为抗原、半抗原的物质，如蛋白质，多肽、核酸、酶、激素、磷脂、多糖、受体及病原体等都可用相应的特异性抗体在组织、细胞内应用免疫组织化学方法可准确的定位。

33.Western Blot的原理和要点是什么？

（教材版）免疫印迹法（Western Blot）是将凝胶电泳与固相免疫结合，把用电泳分区的蛋白质转移至固相载体，再用酶免疫、放射免疫或染色等技术测定。该法能分离分子大小不同的蛋白质并确定其分子量，常用于检测多种病毒的抗体或抗原。

免疫印迹法分三个阶段进行.第一阶段为SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE):抗原等蛋白样品经SDS处理后带阴电荷,在聚丙烯酰胺凝胶中从阴极向阳极泳动,分子量越小,泳动速度就越快.此阶段分离效果肉眼不可见(只有在染色后才显出电泳区带).第二阶段为电转移:将在凝胶中已经分离的条带转移至硝酸纤维素膜上,选用低电压(100V)和大电流(1～2A),通电45min转移即可完成.

此阶段分离的蛋白质条带肉眼仍不可见.第三阶段为酶免疫定位:（此处采用酶标显色法）将印有蛋白质条带的硝酸纤维素膜(相当于包被了抗原的固相载体)依次与特异性抗体和酶标第二抗体作用后,加入能形成不溶性显色物的酶反应底物,使区带染色.常用的HRP底物为3,3'-二氨基联苯胺(呈棕色)和4-氯-1-萘酚(呈蓝紫色).阳性反应的条带清晰可辨,并可根据SDS-PAGE时加入的分子量标准,确定各组分的分子量

答题要点:(我总结归纳的)1SDS-PAGE法使蛋白质按分子大小不同分离2用电转移法将已分离的条带转移到硝酸纤维素膜上3加入染色标志抗体、酶标抗体显色或者一抗特异结合，标志二抗显色

三ADMET研究

34.什么是ADMET研究，在药物发现中的作用是什么？有什么特点?

A：Absorption ：药物从作用部位进入体循环的过程

D：Distribution ：药物吸收后通过细胞膜屏障向各组织、器官或者体液进行转运的过程

M：Metabolism（Biotransformation）：药物在体内受酶系统或者肠道菌丛的作用而发生结构转化的过程

E ：Excretion：药物以原型或者代谢产物的形式排出体外的过程

T：Toxcity：药物对机体的毒性

ADMET就是对药物的吸收、分布、代谢、排泄和毒性进行全面的研究。其中ADME是药物代谢动力学（Pharmacokinetics,PK）的研究内容

作用：药物筛选（Drug screening）药物设计（Drug design）药物合成（Drug synthesis）评价制剂（Drug formulation/Biopharmaceutics）中草药研究（TCM herbs research）

特点：1基于细胞或生物大分子的分析方法：小样品、高内涵和高通量分析能力；能够阐明药物性质的分子机理；建立结构-药物性质定量构效关系2人源材料的应用

35.什么是BCS？

BCS（biopharmacertics classification system）即生物药剂学分类系统

FDA制定的BCS评价指南，主要包括下列三个方面：药物的生物渗透能力（permeability）、药物的溶解能力（Solubility）、制剂的快速溶出能力(Immediate Release)。这些性质符合要求的药物/制剂可以在药审时得到生物豁免

36.药物消化道吸收的机制有哪些？

经细胞连接的被动扩散、穿细胞被动扩散、代谢转化、外流、药物转运

分为细胞旁路通道和经细胞转运通道又分为被动扩散、主动转运、促进扩散、膜孔转运、胞饮和吞噬

37.什么是Caco-2模型？如何从Papp判断药物的吸收能力？

Caco-2细胞模型是一种人克隆结肠腺癌细胞，结构和功能类似于分化的小肠上皮细胞，具有微绒毛等结构，并含有与小肠刷状缘上皮相关的酶系。可以用来进行模拟体内肠转运的实验。（答题到此即可，以下为背景知识）在细胞培养条件下，生长在多孔的可渗透聚碳酸酯膜上的细胞可融合并分化为肠上皮细胞，形成连续的单层，这与正常的成熟小肠上皮细胞在体外培育过程中出现反分化的情况不同。细胞亚显微结构研究表明，Caco-2细胞与人小肠上皮细胞在形态学上相似，具有相同的细胞极性和紧密连接。胞饮功能的检测也表明，Caco-2细胞与人小肠上皮细胞类似。由于Caco-2细胞性质类似小肠上皮细胞，因此可以在这段时间进行药物的跨膜转运实验。

作用：1研究药物吸收的潜力2研究药物转运的机制，包括吸收机制和排除机制3研究药物、营养物质、植物性成分的肠道代谢

判断方法：P app（表观渗透系数）

P app>2*10-6属于吸收好的药物

如Testosterone(睾酮):1.0*10-5cm/s Propranolol（普奈洛尔）:2.86*10-5cm/s

P app<10-6属于吸收差的药物

如Mannitol(甘露醇):1.0*10-7 cm/s Atenolol（阿替洛尔）:4.55*10-7 cm/s

38.血脑屏障与消化道屏障有何异同？

同：1消化道屏障和血脑屏障的组成中均有毛细血管及基底膜的结构2屏障中细胞间的紧密连接是屏障的重要内容3转运机制类似，都具有外排4作用屏障的作用均为有选择性的从一侧到另一侧转运相关物质，阻止有害物质进入

39.药物排出有几个途径，决定性因素分别是什么？

主要途径是经肾排出和经胆汁排出，另外还有经泪液、唾液、乳汁和呼吸道排出等

决定性因素：

肾排泄：（杨课件版）PPB和Papp（生物药剂书版）药物脂溶性、PKa、血浆蛋白结合率，尿液PH、尿量等

胆汁排泄：肠肝循环：分子量300以上并有极性基团的药物主要从从肝进入胆汁排泄。胆汁排泄对于因为极性太强而不能在肠内重吸收的有机阴离子和阳离子是重要的消除机制。从胆汁排泄进入小肠的药物中，某些具有脂溶性的药物可被重吸收，

葡糖苷酸结合物则可被肠道微生物的β-葡糖苷酸酶所水解并释放出原形药物，然后被重吸收，这就是肝肠循环。

（生物药剂书版）分子量、极性、取代基以及解离状态和脂溶性，种属差异、代谢状况、蛋白质结合率、疾病和老化等40.有哪些重要的药物运输蛋白？其作用和作用机制分别是什么？

肝脏中：Organic anion transporter：NTCP、OA TPs、OATP2、OA T2

Primary active transporter：MRPs、MDR1、BCRP、BSEP/SPGP等等

41.如何分析药物的肝代谢稳定性？三种肝制品模型各有什么特点？

96-孔板中定量加入待测化合物→加三种肝制品模型之一→培养→分离→LC-MS分析→定量分析原型化合物消除量→计算消失率[原药消失率%=(1-代谢反应物浓度Ct/原始药物浓度Co)*100%]

特点：全肝细胞：包括所有代谢酶和转运蛋白；费用高，不易储存

S9肝匀浆液：包括1、2相代谢酶；分析容易操作、费用低；匀浆液保存不稳定

肝微粒体：仅包括1相代谢酶；分析操作容易、费用低；易于保存

42.如何测定药物的毒性？

基本方式-细胞活力分析：细胞生长；细胞能荷；线粒体活性-MTT分析；细胞氧化还原状态---谷胱甘肽含量分析；细胞特征性功能（蛋白质合成，核酸合成，吞噬、排除外来分子能力等）；细胞膜完整性---胞浆酶活性分析

MTT法原理：线粒体酶将探针分子MTT*还原成为一种蓝色脂溶性染料formazan（吸收波长550nm），线粒体活性越高，转化能力越强实验方法：将MTT加入到细胞培养液中，反应一段时间后，用有机溶剂溶解产生的formazan，然后用酶标仪测定550 nm 吸光度. 特点：方法简单可靠，费用低，高通量

96-孔板中定量加入化学物质→加入肝细胞→37℃温孵→分析细胞活性（用活力分析法之一，常用MTT法）→确定LD50，IC50，EC50

43.有哪些药物-药物相互作用？

药物-药物相互作用：排出抑制型相互作用、代谢抑制型相互作用、代谢诱导型相互作用

44.黄酮的吸收代谢机制是什么？如何提高食物中黄酮的生物利用率？

（图：UGT是UDP-依赖葡糖醛酸基转移酶，SulT是硫酸转移酶）

黄酮的吸收和代谢的速度更多是取决于肠内代谢水平和从细胞中向外转运的速度，而不是被动扩散的速度。故可采用混合黄酮制

剂和/或者苷元羟基甲基化的黄酮制剂可以增加黄酮的生物利用率