关于生物化学常用试剂配制

常规试剂配制和测定方法

一、溶液的配制

1. Mandels营养盐溶液（1000 mL）

名称重量（g）

硫酸铵（(NH4)2SO4）14

磷酸二氢钾（KH2PO4）20

尿素（H2NCONH2） 3

硫酸镁（MgSO4·7H2O） 3

氯化钙（CaCl2·2H2O） 4

注：用煮沸10 min后的蒸馏水配制。

2. Mandels微量元素溶液（1000 mL）

名称重量（g）

氯化钴（CoCl2·6H2O） 3.7

硫酸锌（ZnSO4·7H2O） 1.4

硫酸锰（MnSO4·H2O） 1.6

硫酸亚铁（FeSO4·7H2O） 5.0

注：用煮沸10 min后的蒸馏水配制。

3. DNS试剂的配制（1000 mL）

（1）取：3,5-二硝基水杨酸（C7H4N2O7）7.5 g

氢氧化钠（NaOH ）14.0 g

充分溶解于1000 mL 水中（水预先煮沸10 min）

（2）加入：酒石酸钾钠（C4H4O6KNa·4H2O）216.0 g

苯酚（在50 ℃水浴中融化） 5.5 mL

偏重亚硫酸钠（Na2S2O5） 6.0 g

（3）充分溶解后盛于棕色瓶中，放置5天后便可使用，平时盛一小瓶(250 mL)使用，要放在冰箱中冷藏。此溶液每月配制一次。

注意：倒入瓶中时要尽量装满！！

4. 考马斯亮蓝G-250的配制（1000 mL）

称考马斯亮蓝G-250 100 mg即0.1g溶于50mL 95%乙醇中，加入100 mL 85 %磷酸，用蒸馏水稀释至1000 mL ，滤纸过滤。最终试剂中含0.01 %（w/v）考马斯亮蓝G-250，4.7 %（w/v）乙醇，8.5 %（w/v）磷酸。

5. 1.0 M柠檬酸缓冲溶液的配制（1000 mL）

柠檬酸（C6H8O7·H2O）210 210

NaOH 40 74.5

准确称取柠檬酸210 g，溶于约750 mL煮沸（10 min）蒸馏水中，待柠檬酸充分溶解后加入氢氧化钠74.5 g，完全溶解后将上述溶液转移到1000 mL容量瓶中，冷却后将容量瓶定容到1000 mL（原始pH4.45）。（检验方法：取1.0 M柠檬酸缓冲溶液稀释20倍，测定稀释液的pH值，pH值应为4.8）

6. 标准糖溶液的配制和标准方程的测定

（1）标准糖溶液的配制

准确称取2.000 g葡萄糖/木糖（葡萄糖/木糖需105 ℃烘干3 h），蒸馏水溶解，全部转移至1 L容量瓶内，摇匀，配制成2 g/L葡萄糖/木糖溶液。

取9个100 mL容量瓶、1支20 mL刻度吸管，分别吸取2 g/L葡萄糖/木糖溶液10 mL、20 mL、30 mL、40 mL、50 mL、60 mL、70 mL、80 mL、90 mL依次加入容量瓶，蒸馏水定容，摇匀。即为0.2 g/L、0.4 g/L、0.6 g/L、0.8 g/L、1.0 g/L、1.2 g/L、1.4 g/L、1.6 g/L、1.8 g/L、2.0 g/L葡萄糖/木糖标准溶液。

取6个30 mL容量瓶、1支20 mL刻度吸管，分别吸取2 g/L葡萄糖溶液10 mL、12 mL、14 mL、16 mL、18 mL、20 mL依次加入容量瓶，每瓶再加入1.5 mL柠檬酸缓冲液，蒸馏水定容，摇匀。即为1.0 g、1.2 g、1.4 g、1.6 g、1.8 g、2.0 g酶解葡萄糖。

（2）标准方程的测定：

①葡萄糖/木糖标准方程的测定

取10支25mL刻度管，10支1mL刻度吸管，分别加入0.2 g/L、0.4 g/L、0.6 g/L、0.8 g/L、1.0 g/L、1.2 g/L、1.4 g/L、1.6 g/L、1.8 g/L、2.0 g/L葡萄糖/木糖标准溶液1 mL，DNS溶液3 mL。100 ℃煮沸5 min，水浴冷却后定容至25 mL，摇匀。以蒸馏水作为空白对照，550 nm 测定吸光度A。以A为纵坐标，C为横坐标，制定标准曲线。（7230型分光光度计输出方程为：A = MC + N，723型分光光度计输出方程为：C = KA + B）

②酶解木糖标准方程测定（测定木聚糖酶活力）

取6支25 mL刻度管，6支2 mL刻度吸管，分别加入1.0 g、1.2 g、1.4 g、1.6 g、1.8 g、2.0 g酶解木糖标准溶液1.5 mL，DNS溶液3 mL，100 ℃煮沸5 min，水浴冷却后定容至25 mL，摇匀。以蒸馏水作为空白对照，550 nm测定吸光度A。以A为纵坐标，C为横坐标，制定标准曲线。（7230型分光光度计输出方程为：A = MC + N，723型分光光度计输出方程为：

C = KA + B）

③酶解葡萄糖标准方程测定（测定滤纸酶活力、CMC酶活力）

取6支小试管，6支2 mL刻度吸管，分别加入1.0 g、1.2 g、1.4 g、1.6 g、1.8 g、2.0 g 酶解葡萄糖标准溶液1.5 mL，DNS溶液3 mL，100 ℃煮沸5 min，水浴冷却后，量筒定容至50 mL（定容至25 mL，测定CMC酶活力），摇匀。以蒸馏水作为空白对照，550 nm测定吸光度A。以A为纵坐标，C为横坐标，制定标准曲线。（7230型分光光度计输出方程为：

A = MC + N，723型分光光度计输出方程为：C = KA + B）

7. 柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液的配制

注：Na2HPO4，Mr =141.98；0.2 mol/L溶液为28.40 g/L

Na2HPO4·2H2O，Mr =178.05；0.2 mol/L溶液为35.61 g/L

C6H8O7·H2O，Mr =210.14；0.1 mol/L溶液为21.01 g/L

二、酶活力的测定

1. 滤纸酶活力的测定—纤维素酶的总体酶活力

采用国际理论和应用化学协会（IUPAC）推荐的标准方法测定[Ghose,T.K., et al,Pure & Appl.Chem.,1987,59,257-268]，一个滤纸酶活力的国际单位（FPIU）等于在标准反应条件下每分钟生成1 μmol葡萄糖量的酶量。测定方法如下：

取7支试管在其中1#-5#支小试管中加入50 mg卷成筒状的滤纸条（1 ×6cm），适当稀释酶液，取7支试管按下表操作。（5#有底物无酶，6#为有酶无底物空白对照）项目1#2#3#4#5#6#7#

稀释酶液（mL）0.2 0.3 0.4 0.5 0 0.5 酶解葡萄糖

标样1.5mL

0.05 M柠檬酸缓冲液（mL） 1.3 1.2 1.1 1.0 1.5 1

将上述试管盖上塑料布，用橡皮筋扎紧后置于恒温水浴器中，保持在振幅80和温度50 ℃下保温60 min后立即取出加入3 mL DNS试剂，在沸水中反应5 min，冷却后加水至50 mL 并充分摇匀，待滤纸完全沉淀后，取上层清液于550 nm波长下测定吸光度A值。反应生成的葡萄糖的量根据葡萄糖标准曲线求得。

以0.2、0.3、0.4、0.5mL酶量所生成葡萄糖的毫克数为横坐标，酶量的对数为纵坐标作图，从图中找出生成2 mg葡萄糖的酶量，按下式计算样品的滤纸酶活力（FPA）：

2 mg葡萄糖

滤纸酶活力=

60min×0.18(mg/μmol)×生成2mg葡萄糖的酶量（mL）

一个滤纸酶活力单位定义为每分钟生成1μmol葡萄糖所需的酶量，单位：IU/mL。

备注：当加入0.5 mL酶液（指酶液没有被稀释的时候！）仍无法生成2 mg葡萄糖时，按下式计算：

滤纸酶活= 0.185 ×（葡萄糖mg数）

2.β-葡萄糖苷酶活力的测定

方法一：葡萄糖氧化酶测定法

按国际标准方法测定[Ghose,T.K.,etal,Pure & Appl.Chem.,1987,59,257-268]。一个β-葡萄糖苷酶活力国际单位(IU/mL)等于标准条件下每分钟转化1 μmol底物即生成2 μmol葡萄糖的

酶量来表示。

预先用0.05 M的柠檬酸缓冲液配制15 mmol/L的纤维二糖溶液（0.513 g纤维二糖/100 mL0.05 M的柠檬酸缓冲液，现配现用）

（1）每个样品应做三个不同酶量

估计β-葡萄糖苷酶活力

（IU/mL）

< 0.1 0.1 0.2 0.3 取酶液量（mL）0.5/0.8/1.0 0.3/0.5/0.8 0.2/0.3/0.5 0.1/0.2/0.3

（2）加料：试管中加入酶液、缓冲液和纤维二糖溶液如下：

酶液量（mL）0.05 M柠檬酸缓冲液

（mL）

纤维二糖溶液

（mL）

样品适量1－酶液 1

酶液空白 1 1 0

纤维二糖空白0 1 1 每个试管共2mL，用塑料纸包扎好。注意：纤维二糖溶液必须用0.05M柠檬酸配制。（3）酶解反应：试管置于50 ℃水浴中，保温30分钟，取出，沸水中放置5分钟使酶失活，冷却至室温。

（4）加显色剂（葡萄糖氧化酶测定试剂）：取试管中冷却液30 μL，加入显色剂3.0 mL，混匀；同时做一个葡萄糖标样：取1 g/L葡萄糖标样30 μL，加显色剂3.0 mL，混匀；

置于37 ℃水浴中，保温15分钟，取出。

（5）测吸光度：505 nm，用蒸馏水调零，测各试管溶液吸光度A值。1g/L葡萄糖标样的吸光度为0.7左右。

（6）计算产生的葡萄糖mg数：

样品吸光度

测得酶空白所含葡萄糖= 2 ×（mg）纤维二糖空白1g/L葡萄糖标样吸光度

样品实际产生的葡萄糖= [测得葡萄糖mg]－[纤维二糖空白葡萄糖mg]

－[酶空白葡萄糖mg] × [酶液量mL] （mg）

注：纤维二糖空白所产生的响应值，当纤维二糖溶液为新鲜配制时，一般很低。

（7）作图：以log(酶液量mL)为纵坐标，实际产生的葡萄糖mg为横坐标作图，求出生成

1 mg 葡萄糖时对应的酶液量mL 。

（8） 计算β-葡萄糖苷酶活力：

0.0926

β-葡萄糖苷酶活力 = （IU/mL ）

生成1mg 葡萄糖对应的酶液量（mL ）

注：当加入1mL 酶液仍不能生成1mg 葡萄糖时，

β-葡萄糖苷酶活力 = 0.0926×（葡萄糖mg 数）

☆ 补充：葡萄糖含量测定

采用葡萄糖氧化酶-过氧化物酶终点比色法测定。葡萄糖测定试剂盒由上海荣盛生物技术有限公司生产，内含R 1（缓冲液）和R 2（酶试剂），使用时将R 1和R 2等量混合。葡萄糖经葡萄糖氧化酶氧化成葡萄糖酸和过氧化氢，后者在过氧化物酶的作用下，将4-氨基安替比林与苯酚偶联缩合成可被分光光度计测定的醌类化合物。测定该有机化合物的吸光度便能计算出葡萄糖的含量。测定方法如下：

在测定管中加入30 μL 待测试样的稀释液（空白管、标准管分别以蒸馏水及1g/L 的葡萄糖标准溶液代替），每一试管中加入由R 1和R 2等量混合的酶酚混合液3.0mL ，将各试管分别摇匀，置于37℃水浴中保温15min ，冷却至室温后，在7230分光光度计上于505 nm 下测定吸光度A 值，用空白管校正吸光度到零点，葡萄糖含量按下式计算： 葡萄糖含量（g/L ）= × 稀释倍数

方法二： 采用pNPG （对硝基苯酚-β-D-葡萄糖苷）试剂测定

（1） 试剂的配制

① 50 mmol/L , pH 4.8柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液的配制（200 mL ） 方法：0.1 mol/L 柠檬酸 101.4 mL + 0.2 mol/L 磷酸氢二钠 98.6 mL ② 1 mol/L Na 2CO 3溶液（250 mL ）

称取：26.5 g Na 2CO 3溶解后定容至250 mL

③ 5 mmol/L pNPG （分子量：301.25）溶液的配制（100 mL ）

称取0.1506 g pNPG ，用50mmol/L ，pH4.8柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液溶解后定容至100 mL 。

（2） 对硝基苯酚标准方程的测定 ① 对硝基苯酚标准溶液的配制

测定管吸光度 标准管吸光度

准确称取0.0209 g 对硝基苯酚（分子量：139.11），蒸馏水溶解，全部转移至100 mL 容量瓶内，摇匀，配制成1.5 mmol/L对硝基苯酚溶液。

取6个30 mL容量瓶，分别吸取1.5 mmol/L对硝基苯酚溶液1 mL、2 mL、4 mL、6 mL、8 mL、10 mL依次加入容量瓶，蒸馏水定容，摇匀。即为0.05 mmol/L、0.1 mmol/L、0.2 mmol/L、

0.3 mmol/L、0.4 mmol/L、0.5 mmol/L。

②对硝基苯酚标准方程的测定

取6支15 mL刻度管、6支1 mL刻度吸管，分别加入0.05 mmol/L、0.1 mmol/L、0.2 mmol/L、0.3 mmol/L、0.4 mmol/L、0.5 mmol/L对硝基苯酚溶液1.0mL，再加入2.0 mL 1 mol/L 的Na2CO3溶液和10 mL的蒸馏水，室温放置5 min后，摇匀。以蒸馏水作为空白对照，在400 nm下测定吸光度A。以A为纵坐标，C为横坐标，制定标准曲线。

（3）测定方法

游离酶酶活力的测定：0.1 mL适当稀释的酶液与0.9 mL 5 mmol/L pNPG溶液（分别预热5分钟）混合后，于50 ℃下保温10 min。10 min后立即加入2 mL 1 mol/L Na2CO3溶液终止反应后，再加入10 mL的蒸馏水，摇匀。在400 nm下测定吸光度。以0.1 mL蒸馏水代替酶液作空白对照。（要做2～3个平行样，取平均值）

固定化酶酶活力的测定：将游离酶酶活的测定方法中0.1mL适当稀释的酶液用0.1mL 蒸馏水和一定质量的固定化酶来代替，其余步骤相同。

（4）酶活力的计算

一个β-葡萄糖苷酶酶活力单位定义为：每分钟水解生成1 μmol对硝基苯酚所需要的酶量。计算公式如下：

游离酶酶活力的计算：

生成对硝基苯酚的量（μmol）

β-葡萄糖苷酶酶活= （IU/mL）

10 min×0.1 mL

固定化酶活力的计算：

生成对硝基苯酚的量（μmol）

β-葡萄糖苷酶酶活= （IU/g）

10 min ×称取固定化酶的质量（g）

3. 羧甲基纤维素（CMC）—内切葡聚糖酶活力

（1）在25 mL刻度试管中加入0.5 mL适当稀释的酶液和1.0 mL用0.05 mol/L柠檬酸缓

冲液配制的1 %（w/v ）羧甲基纤维素悬浮液。

（2） 盖上塑料布，用橡皮筋扎紧后置于恒温水浴器中，保持在振幅80和温度50 ℃下保温

30 min 后立即取出加入3 mL DNS 试剂，在100 ℃沸水中煮沸5 min ，冷却到室温后，加水定容至25 mL ，充分摇匀后于550 nm 波长下测定吸光度A 值。

（3） 反应生成的葡萄糖的量根据葡萄糖标准曲线求得。按下式计算CMC 酶活力：

CMC 酶活力 =

生成的葡萄糖的量（mg ）

30min×0.18(mg/μmol)×0.5mL

一个CMC 酶活力单位定义为每分钟生成1μmol 葡萄糖所需的酶量，单位：IU/mL 。

4. 木聚糖酶活力的测定

用0.05 mol/L 柠檬酸缓冲液配制的1%（w/v ）桦木木聚糖（Sigma 公司制造）溶液。适当稀释酶液，取7支25 mL 刻度试管按下表操作（5#有底物无酶、6#为有酶无底物空白对照）。

项 目

1# 2# 3# 4# 5# 6# 7#

稀释酶液（mL ）

0.2

0.3 0.4 0.5 0 0.5 酶解木糖标样

1.5mL 0.05M 柠檬酸缓冲液（mL ） 0.3 0.2 0.1 0 0.5 1 1%桦木木聚糖（mL ）

1

1

1

1

1

将上述试管盖上塑料布，用橡皮筋扎紧后置于恒温水浴器中，保持在振幅80和温度50 ℃下保温30 min 后立即取出加入3 mL DNS 试剂，在沸水中反应5 min ，冷却到室温后，加水到25 mL ，充分摇匀后于550 nm 波长下测定吸光度A 值。根据木糖标准曲线（用木糖的绝对量对吸光度A 值作图），找出反应所产生的木糖量（扣除空白值）。

以0.2、0.3、0.4、0.5 mL 酶量所生成木糖的毫克数为横坐标，酶量的对数为纵坐标作图，从图中找出生成2 mg 木糖的酶量，按下式计算木聚糖酶活力：

木聚糖酶活力 =

2mg 木糖

30 min×0.15(mg/μmol)×生成2mg 木糖的酶量

一个木聚糖酶活力单位定义为每分钟生成1μmol 木糖所需的酶量，单位：IU/mL 。

三、木聚糖的测定方法

1、准确吸取5mL 搅拌均匀的木聚糖溶液于250 mL 三角瓶中，加入5 mL 8 %的硫酸，摇匀后用牛皮纸和橡皮筋将三角瓶的瓶口扎住。

2、将三角瓶置于灭菌锅中于121 ℃条件下保温60 min，冷却后取出。

3、将三角瓶中的水解液倒入200 mL烧杯中，加入100 mL左右的水（注意少量多次洗涤三角瓶），用15 %的NaOH溶液中和至pH值为6.5 ~ 7.0。

4、将中和液定容到200 mL（量筒）。

5、用DNS法测得中和液的还原糖浓度c，则被测样品的木聚糖浓度C为：

C = c×40×0.9

式中：

C —木聚糖浓度，g/L

c —水解液中木糖浓度

0.9 —木聚糖和木糖的转化系数

6、每个样品做2个平行样。

注意：

木聚糖的聚合度是用c×40除以木聚糖不水解直接测糖的还原物浓度。

四、可溶性蛋白质的测定

采用Bradford测定方法。测定试剂采用Bradford试剂（Sigma公司）。

①常量分析法。取5个蛋白质标准样品（分别含牛血清蛋白0.2、0.4、0.6、0.8和1.0 mg/mL），1个空白对照（蒸馏水）和所有待测试样各0.1 mL于10 mL具塞试管中，顺试管壁分别加入3.0 mL Bradford试剂，将试管小心上下翻转几次使液体混合均匀（注意尽量不产生泡沫），在加入染色剂后的5-60 min内，于595 nm波长下测定各样品的吸光度A值。以同样处理的空白作为对照。当蛋白质浓度在0.2-1.0 mg/mL范围内时，吸光度A值与蛋白质浓度之间呈线性关系。作出蛋白质浓度标准曲线后，由待测试样的A值可求得蛋白质的浓度。

②微量分析法。当蛋白质浓度较低时，可采用微量分析法来测定蛋白质浓度。取5个蛋白质标准样品（分别含牛血清蛋白2、4、6、8和10 μg/mL）和待测试样各1.0 mL于10 mL具塞试管中，顺试管壁分别加入1.0 mL Bradford试剂，其余步骤与常量分析方法相同。