植物生理指标测定方法

实验一植物叶绿素含量的测定（分光光度法）

（张宪政，佃92）

一、原理

根据叶绿体色素提取液对可见光谱的吸收，利用分光光度计在某一特定波长测定其吸光 度，即可用公式计算出提取液中各色素的含量。根据朗伯 一比尔定律，某有色溶液的吸光度 A 与其中溶质浓度C 和液层厚度L 成正比，即A = a CL 式中：a 比例常数。当溶液浓度以百 分浓度为单位，液层厚度为1cm 时，a 为该物质的吸光系数。各种有色物质溶液在不同波长 下的吸光系数可通过测定已知浓度的纯物质在不同波长下的吸光度而求得。如果溶液中有数 种吸光物质，则此混合液在某一波长下的总吸光度等于各组分在相应波长下吸光度的总和。 这就是吸光度的加和性。今欲测定叶绿体色素混合提取液中叶绿素 a 、b 和类胡萝卜素的含量， 只需测定该提取液在三个特定波长下的吸光度 A ，并根据叶绿素a 、b 及类胡萝卜素在该波长 下的吸光系数即可求出其浓度。在测定叶绿素 a 、b 时为了排除类胡萝卜素的干扰，所用单色 光的波长选择叶绿素在红光区的最大吸收峰。高等植物中叶绿素有两种：叶绿素 a 和b ，两 者均易溶于乙醇、乙醚、丙酮和氯仿。叶绿素 a 和叶绿素b 的比值反映植物对光能利用效率 的大小，比值高则大，贝U 反之。 、材料、仪器设备及试剂

试剂：1） 95%乙醇（或80%丙酮） 、实验步骤

称取剪碎的新鲜样品0.2?0.3g,加乙醇10ml ，提取直至无绿色为止。把叶绿体色素提取 液倒入光径1cm 的比色杯内，以95%乙醇为空白，在波长 663nm 和645nm 下测定吸光 度。 四、实验结果按计算

丙酮法（Amon 法）【可以用于丙酮乙醇混合法和 80%丙酮提取法的计算】

(mg/g ) = (12.71XOD663 -2.59XOD645) V/1000*W

(mg/ g ) =(22.88OD645 -4.67OD663) V/1000*W =(8.04XOD663

+20.29

(mg/g ) = (12.63^OD663 -2.5^OD645) V/1000*W (mg/ g ) =(20.47OD645 -4.73OD663) V/1000*W

叶绿素 a 、b 的总含量(mg/g ) =(7.90^OD663 + 17.95^OD645) V/1000*W

注：1、叶绿素a 和叶绿素b 的比值反映植物对光能利用率

叶绿素a 的含量 叶绿素b 的含量 叶绿素a 、b 的总含量（mg/g ）

按Inskeep 公式

叶绿素a 的含量

叶绿素b 的含量

【11比如阳生植物叶绿素 a 和叶绿素b 的比值较大 【21阴生植物叶绿素 a 和叶绿素b 的

比值较小

2、丙酮——熔点:-94C ；沸点:56.48C ;是一种无色透明液体，有特殊的辛辣气味 易溶于

水和甲醇、乙醇、乙醚、氯仿、吡啶等有机溶剂 .

下一步实验方法比较

【11 95%乙醇直接提取（V ）

【21 95%乙醇加热提取（冯瑞云，1985） 【31无水酒精和80%丙酮等体积混合提取

实验二、不良环境对植物细胞膜的伤害（

（张宪政，佃92））

一、

原理

植物组织在受到各种不利的环境条件（如干旱、低温、高温、盐渍和大气污染）危害时， 细胞膜的结构和功能首先受到伤害，细胞膜透性增大。若将受伤害的组织浸入无离子水中， 其外渗液中电解质的含量比正常组织外渗液中含量增加，组织受伤害越严重，电解质含量增 加越多。用电导仪测定外渗液电导率的变化，可反映出质膜受伤害的程度。在电解质外渗透 的同时，细胞内可溶性有机物也随之渗出，引起外渗液可溶性糖、氨基酸、核苷酸等含量增 加，氨基酸和核苷酸对紫外光有吸收，对紫外分光光度计测定受伤害组织外渗液消光值，同 样可反映出质膜受伤害的程度。用电导仪法和紫外法测定结果有很好的一致性。 二、 方法步骤

1、 取样及处理

采用电导法（张宪政，1992）:将选取的幼嫩叶片和成熟叶片剪下，包在密封袋内置于冰盒 中带回实验室。将新鲜的叶样先用自来水轻轻冲洗叶片，除去表面沾污物，再用去离子水冲 洗1~2次，用滤纸轻轻吸干叶片表面水分，称 0.2?0.3 g 并剪成切段，放入50 mL 带塞试管 中，加入20 mL 去离子H 20,浸没样品 进行，用DDs-11型电导仪测其电导率， 值。以相对电导率表示细胞质膜透性大小。

2、 计算：

植物组织浸泡的电导率，特称外渗电导率，

（1） 外渗电导率

K （uS cm*g ） =SQ=测定电导率/称取质量

K （uS cm*g*ml ） =SQ=测定电导率/称取质量*量取体积

（2） 相对电解质渗出率.

电解质渗出率（%） = L1 （浸泡液电导率）/ L2 （煮沸后电导率）X 100

电解质渗出率（％）= L1（浸泡液电导率）-本底电导率/[ L2 （煮沸后电导率）-本底电导率]X 100

式中：L1 :组织杀死前外渗液的电导值；L2组织杀死后外渗液的电导值。

注：1、事先测定水的电导率

2、用吸水纸吸干探头的水分

4~5 h ,各处理浸泡时间和测定温度一致，在室温下 然后沸水浴15 min ，冷却至室温再测一次总电导率 此测定方法称外渗电导率法。

实验三植物体内游离脯氨酸含量的测定

一、目的

在逆境条件下（旱、热、冷、冻），植物体内脯氨酸的含量显著增加，植物体内脯氨酸含量在一定程度上反映了植物的抗逆性，抗旱性强的品种积累的脯氨酸多。因此测定脯氨酸含量可以作为抗旱育种的生理指标。另外，由于脯氨酸亲水性极强，能稳定原生质胶体及组织内的代谢过程，因而能降低冰点，有防止细胞脱水的作用。在低温条件下，植物组织中脯氨酸增加，可提高植物的抗寒性，因此，亦可作为抗寒育种的生理指标。

二、原理

磺基水杨酸对脯氨酸有特定反应，当用磺基水杨酸提取植物样品时，脯氨酸便游离于磺基水杨酸溶液中。然后用酸性茚三酮加热处理后，茚三酮与脯氨酸反应，生成稳定的红色化合物，再用甲苯处理，则色素全部转移至甲苯中，色素的深浅即表示脯氨酸含量的高低。在520nm波长下测定吸光度，即可从标准曲线上查出脯氨酸的含量。

三、材料、仪器及试剂

1.试剂及配制：

（1） 2.5 %酸性茚三酮溶液配制：将1.25g茚三酮溶于30ml冰醋酸和20ml 6mol - L-1 磷酸中（原液稀释2.3倍），搅拌加热（70C）溶解，贮于4C冰箱中，2-3日有效。

（2） 3 %磺基水杨酸配配制：3.496g磺基水杨酸加蒸馏水溶解后定容至100ml。

（3）10卩g ? ml-1脯氨酸标准母液配制：精确称取20mg脯氨酸，倒入小烧杯内，用少量蒸馏水溶解，再倒入200ml容量瓶中，加蒸馏水定容至刻度（为100卩g ? ml-1脯氨酸母液），再吸取该溶液10ml，加蒸馏水稀释定容至100ml，即为10卩g ? ml-1脯氨酸标准液。

四、实验步骤

1、脯氨酸标准曲线的制作

1.1取6支试管，编号，按下表配制每管含量为0?12卩g的脯氨酸标准液。加入表中试剂后，置于沸水浴中加热30mi n。取出冷却。以去离子水溶液为空白对照，在520mm波长处

测定吸光度（A）值。

1.3标准曲线的绘制

以1?5号管脯氨酸含量为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制标准曲线。

2.样品的测定

2.1脯氨酸的提取

称取0.2?0.3g 叶片于20ml 试管+ 10ml 3 %磺基水杨酸溶液-沸水浴10min （提取过 程中要经

常摇动）-冷却过滤于干净的试管中-脯氨酸提取液。

2.2测定

吸取酶提取液2ml + 2ml H 2O + 2ml 冰醋酸+ 4ml 2.5 %酸性茚三酮-沸水浴30min -溶 液呈红色-冷却-取上层液于比色杯 520mm 处测定吸光度（A ）值。

五、计算结果

从标准曲线上查出样品测定液中脯氨酸的含量，按下公式计算样品中脯氨酸含量：

XX 提取液总量（ml ）

脯氨酸含量（ 卩g - gw ）= --------------------------------------

样品鲜重（g ） X 测定时提取液用量（ml ）

公式中：X —从标准曲线中查得的脯氨酸含量（ ug

实验四 植物体内丙二醛含量的测定

一、原理

丙二醛（MDA 是由于植物官衰老或在逆境条件下受伤害，其组织或器官膜脂质发生过氧 化反应

而产生的。它的含量与植物衰老及逆境伤害有密切关系。测定植物体内丙二醛含量， 通常利用硫代巴比妥酸（TBA ）在酸性条件下加热与组织中的丙二醛产生显色反应， 生成红棕色 的三甲川（3、5、5—三甲基恶唑2、4 —二酮），三甲川最大的吸收波长在 532nrn 但是测定 植物组织中MDA 寸受多种物质的干扰，其中最主要的是可溶性糖，糖与硫代巴比妥酸显色反 应产物的最大吸收波长在 450nm 处，在532nm 处也有吸收。植物遭受干旱、高温、低温等逆 境胁迫时可溶性糖增加，因此测定植物组织中丙二醛与硫代巴比妥酸反应产物含量时一定要 排除可溶性糖的干扰。此外在 532nm 波长处尚有非特异的背景吸收的影响也要加以排除。低 浓度的铁离子能显著增加硫代巴比妥酸与蔗糖或丙二醛显色反应物在 532、450nm 处的吸光度 值，所以在蔗糖、丙二醛与硫代巴比妥酸显色反应中需要有一定的铁离子，通常植物组织中 铁离子的含量为100— 300卩g ? g — 1Dw 根据植物样品量和提取液的体积，加入 Fe3 +的终浓 度为0.5nmol - L — 1。在532nm 600nm 和450nm 波长处测定吸光度值，即可计算出丙二醛 含量。

二、实验步骤

（1）提取

采用硫代巴比妥酸显色法（赵世杰等，2002）。称取0.2?0.3 g 样品，加10汇氯乙酸2 mL 和少量石英砂，研磨至匀浆，再加 8ml 三氯乙酸进一步研磨，匀浆后4000 rpm ，离心10min 。 （2）显色

每管脯氨酸含量（卩g ） 0 2 6 4 8 10

取上清液5 mL,力卩0.6% TBA5 mL ,混合后在100C水浴上煮沸30 min，迅速在冰浴上冷却后再离心一次。分别测定上清液在450nm 532 nm和600 nm处的吸光度值，

MDA 质量摩尔浓度(nmol/g)= ( A532-A600) V z XVi /(0.155 VW< V 2)

0.155:为MDA 的消光系数（nmol/l ）

方法二： 方程组：

A450=

(A532 — A600) = (155X 10— 3) ? CMDA+ (7.4X 10— 3) ? C 糖 解得：

A450

C 糖= ------------- =11.71A450 (mmol ? L — 1)

85.4X 10— 3

C MDA = 6.45 （A532 — A600） — 0.56A450 （卩 mol - L — 1）

公式中：A450 —在450nm 波长下测得的吸光度值

A532 —在532nm 波长下测得的吸光度值 A600 —在600nm 波长下测得的吸光度值

* — 1.55X 105为摩尔比吸收系数

C 糖、CMDA 分别是反应混合液中可溶性糖、 MDA 的浓度。

1. 按下式计算提取液中MDA 浓度

反应液体积（ml ）

C MDA V

1000

提取液中MDA 浓度（卩mol -ml - 1）=

测定时提取液用量（ml ）

2.

按下式计算样品中MDA 含量 提取液中MDA 浓度（卩mol ? ml — 1）x 提取液总量（ml ）

MDA 含量(卩 mol ? g — 1 Fw )=

植物组织鲜重（g ）

试剂：

1、 10%三氯乙酸：称取三氯乙酸 55.5556g 加水溶解定容至500ml

方法一: 式中：V z :反应液总量（4 mL ）; V1:提取液体积（10 mL ）;

V 2:测定用用提取液量（2 mL ）；

W:取样叶鲜重（g ）

(85.4X 10- 3) ? C 糖

2、0.6 %硫代巴比妥酸（用10%三氯乙酸配制）：称0.6707g TBA用少量1mol/L氢氧化

钠溶解后加10% TCA溶解定容至100ml （4C贮存）

实验五、SOD活力测定（NBT还原法）

植物叶片在衰老过程中发生一系列生理生化变化，如核酸和蛋白质含量下降、叶绿素降解、光合作用降低及内源激素平衡失调等。这些指标在一定程度上反映衰老过程的变化。近来大量研究表明，植物在逆境胁迫或衰老过程中，细胞内自由基代谢平衡被破坏而有利于自由基的产生。过剩自由基的毒害之一是引发或加剧膜脂过氧化作用，造成细胞膜系统的损伤，

严重时会导致植物细胞死亡。自由基是具有未配对价电子的原子或原子团。生物体内产生的自

至疋

由基主要有超氧自由基（02—）、羟自由基（OH）、过氧自由基（ROD、烷氧自由基（RO 等。植物细胞膜有酶促和非酶促两类过氧化物防御系统，超氧化物歧化酶（SOD、过氧化氢

酶（CAT、过氧化物酶（POD和抗坏血酸过氧化物酶（ASA -POD等是酶促防御系统的重要保护酶。抗坏血酸（VC、VE和还原型谷胱甘肽（GSH等是非酶促防御系统中的重要抗氧化剂。SOD CAT等活性氧清除剂的含量水平和O2—、H2O2 OH.和O2等活性氧的含量水平可作为植物衰老的生理生化指标。

超氧自由基（O2. —、是生物细胞某些生理生化反应常见的中间产物。自由基是本身带有不成对价电子的分子、原子、原子团或离子，化学性质非常活泼，是活性氧的一种。如果细胞中缺乏清除自由基的酶时，机体就会受到各种损伤。超氧化物歧化酶（Sup eroxide Dismutase），简称SOD能通过歧化反应清除生物细胞中的超氧自由基（O2. —）,生成H2O2 和O2 H2O2由过氧化氢酶（CAT催化生成H2O和O2,从而减少自由基对有机体的毒害。

一、原理

超氧物歧化酶（superoxidedismutase ，SOD普遍存在于动、植物体内，是一种清除超氧阴离子自由基的酶。本实验依据超氧物歧化酶抑制氮蓝四唑（NBT在光下的还原作用来确

定酶活性大小。在有氧化物质存在下，核黄素可被光还原，被还原的核黄素在有氧条件下极易再氧化而产生O2-，可将氮蓝四唑还原为蓝色的甲腙，后者在560nm处有最大吸收。而SOD 可清除O2-，从而抑制了甲腙的形成。于是光还原反应后，反应液蓝色愈深，说明酶活性愈低，反之酶活性愈高。据此可以计算出酶活性大小。

二、试剂

（一）试剂

（1）0.2 mol/L pH7.8 磷酸钠（Na2HPO4-NaH2PO4缓冲液：

A 液（0.2 mol/L NaH2PO4 溶液、：准确称取NaH2PO4 2H2O （MW=156.01 15.715g 于50mL小烧杯中，用少量蒸馏水溶解后，移入500mL容量瓶中用蒸馏水定容至刻度，充分

混匀。4C冰箱中保存备用。

B 液（0.2 mol/L Na2HPO4 溶液）：准确称取Na2HPO4 12H2O（ MW=358.14 71.63g 于100mL 小烧杯中，用少量蒸馏水溶解后，移入1000mL容量瓶中用蒸馏水定容至刻度，充分混匀。4 C冰箱中保存备用。

取上述A液34mL与B液366mL充分混匀后即为0.2mol/L pH7.8的磷酸钠缓冲液。4C 冰箱中保存备用。

（2）0.05 mol/L pH7.8 磷酸钠缓冲液

取0.2 mol/L pH7.8 的磷酸钠缓冲液250mL移入1000 mL容量瓶中用蒸馏水定容至刻度，充分混匀。4C冰箱中保存备用。

（3）130mmol/L蛋氨酸（Met）磷酸钠缓冲液

准确称取L-蛋氨酸（C5H11NO2SMW=149.21 0.9699g于小烧杯中，用少量0.05 mol/L pH7.8的磷酸钠缓冲液溶解后，移入50mL容量瓶中并用0.05 mol/L pH7.8 的磷酸钠缓冲液