植物细胞器的分离3
植物细胞器的分离
一、叶绿体的分离：
1.实验原理：
采用差速离心法，利用不同颗粒的大小形状不同导致沉降速率不同，把叶绿体的颗粒沉降出来。
2.实验材料及试剂：
成熟的猪笼草、山梨醇、Tris、EDTA与β-巯基乙醇均为Amresco产品、细胞器分离缓冲液:300 mmol/L山梨醇, 50mmol/L Tris-HCl(pH为8.0), 5 mmol/L EDTA(pH 8.0), 0.1%β-巯基乙醇(临用前加入)。
3.实验器材：
SG350C多功能食品料理机(上海天航电器有限公司) , GL21M高速冷冻离心机及配套的2号角转头(湘仪集团)
山梨醇：配制体积：100 mL，浓度：3 mol/L；分子量：182.17g/mol
需要称取质量g:=100 mL*3 mol/L*182.17g/mol=0.1L*3
mol/L*182.17g/mol=54.651g
EDTA: 配置体积：100ml , 浓度：0.5mol/lL ,分子量：292.248g/mol
m= 0.5mol/L *100mL *292.248g/mol =14.6124 g
LEDTA : 配置体积:100ml 浓度：25mol/L ,分子量：292.248g/mol
m=2.5mol/L*100mL * 292.248g/mol=73.062g
4.制备方法
4.1叶绿体粗提物的制备
（1）. 取25 g叶片置于100 mL充分预冷的细胞器分离缓冲液中,用食品料理机匀浆2 min(5000r/min),
（2）. 然后将匀浆液用4层纱布过滤于500ml烧杯,
（3）. 滤液于4℃、700g在1000r/min离心10 min,
（4）.弃去细胞核沉淀上清液再于4℃、2 000 g在3000r/min离心10min,所得沉
淀即为叶绿体粗提物,
（5）.将此粗提物悬浮于7.5 mL细胞器分离缓冲液中备用。
4.2密度梯度离心制备完整叶绿体
（1）.用50 mL离心管制备蔗糖梯度,底部为18 mL含52%(质量分数)的蔗糖,50 mmol/L Tris-HCl(pH为8.8),25 mmol/L EDTA(pH为8.8)的混合液,
上面用7 mL含30%蔗糖、50 mmol/L Tris-HCl(pH为8.0)、25 mmol/L EDTA(pH 为8.0)的混合液覆盖。
（2）. 将上述所得叶绿体粗提取物小心覆盖于30%的蔗糖上面,平衡后在4℃、20 kr/min离心30 min。
（3）.处于52%蔗糖与30%蔗糖界面上的绿色条带即为完整叶绿体。
（4）.用加样枪小心吸出绿色的条带。
5.叶绿体的显微鉴别：
叶肉细胞中的叶绿体，散布于细胞质基质中，呈绿色，扁平的椭球形或球形可以在高倍显微镜（400~600）下观察到它的形态和分布。
二、线粒体的分离
1.实验原理：
利用沉降系数不同的颗粒，在一定介质中沉降速度的差异，采取分级差速离心的方法，将线粒体从细胞悬液中逐级分离出来。
2.实验材料及试剂：
实验材料成熟的拟南芥，琼脂糖为杭州微生物试剂厂产品;牛血清蛋白(BSA)为上海试剂厂产品;DNase和RNase为上海生物工程技术服务有限公司产品;
溴化乙锭为SerVa公司产品;其余试剂均为国产分析纯.1×TAE电泳缓冲液(称取242 g Tris溶于适量蒸馏水中,加入57. 1 mL冰乙酸, 100 mL 0.5mol·L1EDTA,pH= 8. 0,用蒸馏水定容至1 L即为50×TAE转换为1 ×TAE稀50倍)缓冲液A:蔗糖0.
5 mol·L-1, Tris-Cl 50mmol·1,EDTA5mmol·L-1,BSA 0. 1%,PVP0. 5%, 0. 1%β-巯基乙醇,pH= 7. 5.缓冲液B:蔗糖0. 5 mol·L-1, Tris-Cl 50mmol·L-1, pH= 7. 5.缓冲液C:蔗糖0.
6 mol·L-1, Tris-Cl 10mmol·L-1,EDTA 20mmol·L-1, pH= 7. 2.缓冲液D: 0. 1 mol·L-1Tri-HCl(pH= 8. 0),0. 05 mol·L-1EDTA (pH= 8. 0), 0. 1mol·L1NaCl,10%SDS, 0. 01mol·L-1β-巯基乙醇.
EDTA：配置体积：100ml , 浓度: 0.5mol/L, 分子量：292.248g/mol
m= 0.5mol/L*100mL /*292.248g/mol =14.6124g.
蔗糖:配置体积：100ml , 浓度：0.5mol/L ,分子量:342.3g/mol
m= 0.5mol/L *100mL*342.3g/mol=17.115g.
LTris-Cl:配置体积:100ml , 浓度：0.5mol/L ,分子量:121.14g/mol
m= 0.5mol/L*100ml*121.14g/mol=6.057g.
蔗糖:配置体积：100ml ,浓度：0.5mol/l , 分子量:342.3g/mol
m=0.5mol/L*100mL*342.3g/mol=17.115g.
蔗糖: 配置体积：100ml , 浓度:0.6mol/L ,分子量:342.3g/mol
m= 0.6mol/L*100mL*342.3g/mol=20.538g.
Tris-Cl:配置体积：100ml, 浓度：0.1mol/L , 分子量:121.14g/mol
m= 0.1mol/L*100mL*121.14g/mol=1.2114g.
EDTA:配置体积:100ml ,浓度:0.2mol/l , 分子量：292.248g/mol
m= 0.2mol/L*100mL*292.248g/mol=5.845g.
NaCl : 配置体积：100ml ,浓度：0.1mol/L , 分子量:58.44g/mol
m= 0.1mol/L*100mL*58.44g/mol=0.5844g.
β-巯基乙醇: 配置体积：100ml ,浓度：0.1mol/L , 分子量：78.13g/mol
m= 0.1mol/L*100ml*78.13g/mol=0.7813g.
3.实验仪器:
超速冷冻离心机、制冰机、研钵(Υ= 15 cm)、无菌纱布、大离心管
(50mL)、水浴锅、微量离心管(1. 5 mL)、微量离心机(1. 5mL管)、-20℃冰箱、自动扩增仪、凝胶成像系统、紫外灯.
4.实验方法:
（1）.采集叶片30 g左右(采集前需暗培养24～28 h,以减少叶片组织所含糖类的污染);
(2).用蒸馏水洗涤2～3次,置研钵中(研钵提前预冷),加适量预冷缓冲液A和少量的石英砂在冰上研磨,直至缓冲液为深绿色;
(3).用6层无菌纱布过滤匀浆组织(并用缓冲液A漂洗纱布),然后将磨碎组织放回研钵中重新研磨并过滤, 2次滤液合并,补加缓冲液A至3～5mL·g-1试材,并将滤液分装于4个50mL无菌离心管中, 1 000 g离心10m in,收集上清液;
(4).将上清液2 000 g离心10m in,再收集上清液于20 000 g离心10m in得到粗线
粒体沉淀,在粗线粒体沉淀中加入每管10mL预冷的缓冲液B用软笔轻轻悬浮沉淀,注意应悬浮均匀后,将粗线粒体悬液1 000 g离心10min;
(5).收集上清液于同一50mL无菌离心管,加入300μL 1mol·L-1的MgCl2至终浓度0. 01mo·L-1,和5mg·mL-1的DNaseⅠ至终浓度20μg·mL-1,冰浴放置1. 5～2 h,在冰浴液中加入1. 5mL 0.5mol·L1的EDTA(pH=8.0)至终浓度20mmol·L-1; (6).将上述溶液小心铺于缓冲液C上(每管25mL C缓冲液), 18 000 g离心20 m in;收集沉淀重新悬浮于装20 mL预冷缓冲液C的离心管中,18 000 g离心10m in,
得到较纯的线粒体沉淀.以上操作均在0～4℃条件下进行.
5.显微鉴别:
线粒体在光学显微镜一般呈短棒状或圆球状，但必须借助健那绿(Janus green B)染液,使得线粒体中细胞色素氧化酶使染料保持氧化状态(即有色状态)呈蓝绿色,而在周围的细胞质中染料被还原,成为无色状态. 因此可以使活细胞中的线粒体呈现蓝绿色,而细胞质接近无色.线粒体能在健那绿染液中维持活性数小时,通过染色,可以在高倍显微镜下观察到生活状态的线粒体的形态和分布.配制质量分数为1%健那绿染液（将0.5g健那绿溶解于50mL生理盐水中,加温到30-40
摄氏度,使其充分溶解）.
三、细胞核的分离:
1.原生质体制备:
（1）.取生长3～4 d的拟南芥悬浮系细胞1 700 rpm离心3min.静置沉淀，（2）.用0.4 mol L甘露醇短暂洗涤后置于20mL酶解缓冲液(5mmol/LMES,6.8 mmol/LCaCl2, 11 mmol/LKH2PO4, 0.3mol/LMannitol, 0.3mol/Lsorbitol, 0.4%PVP-
甘露醇:配制体积：100ml , 浓度：0.4mol/l , 分子量:182.17g/mol
m= 0.4mol/L*100ml*182.17g/mol=7.2868g.
MES :配置体积：100ml , 浓度:0.5mol/L ,分子量:213.25g/mol
m= 0.5mol/L*100ml*213.25g/mol=10.6625g.
CaCl2 :配置体积:100ml ,浓度：0.68mol/L ,分子量：110.98g/mol
m= 0.68mol/L*100mL*110.98g/mol=7.54664g.
KH2PO4 :配置体积：100ml ,浓度：0.11mol/L ,分子量：136.09g/mol
m= 0.11mol/L*100mL*136.09g/mol=1.497g.
Mannitol甘露醇:配置体积：100ml , 浓度：0.3mol/L , 分子量:182.17g/mol
m= 0.3mol/L*100mL*182.17g/mol=5.4651g.
Sorbitol山梨糖醇:配制体积：100ml , 浓度：0.3mol/L ,分子量：182.17g/mol
m= 0.3mol/L*100ml*182.17g/mol=5.4651g.
PVP-K30 : m=(50g*0.4%)/(1-0.4%)=0.2008g.
(3).摇床设定70 rpm,28℃.三层纱布过滤一次,
(4).滤液经1 700 rpm离心3min,去上清，
(5).用洗涤缓冲液(5 mmol/LMES,0.2mol/Lsorbitol,0.2mol/LManmitol(pH5.7))洗涤
MES :配置体积：100ml ,浓度：0.5mol/L，分子量：213.25
m= 0.5mol/L*100mL*213.25g/mol=10.6625g.
sorbitol :配制体积：100ml ,浓度：0.2mol/L , 分子量：182.17g/mol
m= 0.2mol/L*100mL*182.17g/mol=3.6434g.
Manmitol:配置体积：100ml ,浓度：0.2mol/L ,分子量：182.17g/mol
m= 0.2mol/L*100mL*182.17g/mol=3.6434g.
2.细胞核与叶绿体的分离提纯
为保证提纯的细胞器中组分免受破坏,以下步骤均要在0～4℃下进行.
2.1细胞核与叶绿体的粗提
(1). 向原生质体中加入含有0.5%Triton X-100的CSK缓冲液(100 mmol/L KCl,3 mmol/LMgCl2,1mmol/LEGTA(pH8.0),10mmol/LPIPES(pH6.8),300mmol/Lsucrose, 1.2 mmol/L PMSF,20 mmol L DTT),振荡混匀后,静置7 min.溶去原生质体膜但保证细胞核和叶绿体的膜系统不被破坏.
(2).取120g离心10min,弃上清液.
(3).用CSK缓冲液重悬沉淀,
(4). 20μm孔径的滤膜过滤,
(5).取120g离心10 min,得到的沉淀为粗提的细胞核与叶绿体的混合物,
(6).用改良碱性品红苯酚染色,镜检细胞核与叶绿体的初步分离情况.
2.2细胞核与叶绿体的纯化
（1）. 把含有2.3mol L蔗糖的CSK缓冲液(100mmol LKCl, 3 mmol L MgCl2 ,1 mmol L EGTA(pH8.0), 10mmol LPIPES(pH6.8), 2.3 mol L sucrose, 1.2 mmol
KCl :配制体积：100ml ,浓度：0.1mol/L ,分子量：74.6g/mol
m= 0.1mol/L*100mL*74.6g/mol=0.746g.
MgCl2:配置体积：100ml ,浓度:0.3mol/L , 分子量：95.21g/mol
m= 0.3mol/L*100mL*95.21g/mol=2.8563g.
EGTA :配置体积：100ml ,浓度：0.1mol/L , 分子量：380.35g/mol
m= 0.1mol/L*100mL*380.35g/mol=3.8035g
PIPES:配置体积：100ml ,浓度：0.1mol/L ,分子量：302.40g/mol
m= 0.1mol/L*100mL*302.40g/mol=3.024g.
sucrose:配置体积：100ml ,浓度：2.3mol/L ,分子量：342.3g/mol
m= 2.3mol/L*100mL*342.3g/mol=78.729g.
PMSF:配置体积：100ml ,浓度：0.12mol/L , 分子量：174.19g/mol
m= 0.12mol/L*100mL*174.19g/mol=2.0903g.
DTT :配置体积：100ml ,浓度：0.2mol/L ,分子量：154.25g/mol
m= 0.2mol/L*100mL*154.25g/mol=3.085g.
（2）.再把60%percoll CSK缓冲液(60%percoll, 100 mol L KCl, 3mmol L MgCl2, 1 mmol L EGTA(pH8.0), 10 mmol LPIPES(pH6.8), 300mmol Lsucrose, 1.2mmol
KCl:配置体积：10ml , 浓度：100mol/L ,分子量:74.6g/mol
m= 100mol/L*10mL*74.6g/mol=74.6g.
MgCl2:配置体积：100ml ,浓度：0.3mol/L ,分子量：95.21g/mol
m= 0.3mol/L*100mL*95.21g/mol=2.8563g.
EGTA: 配置体积：100ml , 浓度:0.1mol/L ，分子量：380.35g/mol
m=cv/M=0.1mol/L*100mL*380.35g/mol=3.8035g.
PIPES:配置体积：100ml ,浓度：0.1mol/L 分子量：302.40g/mol
m= 0.1mol/L*100mL*302.40g/mol=3.024 g.
Sucrose:配置体积：100ml ,浓度：0.3mol/L ,分子量：342.3g/mol
m= 0.3mol/L*100mL*342.3g/mol=10.269 g.
PMSF：配置体积：100ml ,浓度：0.12mol/L ,分子量：174.19g/mol
m= 0.12mol/L*100mL*174.19g/mol=2.0903g.
DTT:配置体积：100ml,浓度：0.2mol/L 分子量：154.25g/mol
m= 0.2mol/L*100mL*154.25g/mol=3.085g.
(3).用移液枪加时要小心顺着管壁把一溶液平铺于另一溶液之上.这时应该能观察到溶液明显的分层现象,
(4).然后把粗提细胞核与叶绿体的混合物用CSK缓冲液悬起并轻轻的平铺于上述两层的溶液顶部,
(5).最终形成三层溶液各居其层,
(6). 200 g离心32min.溶液梯度层重新分布,
(7).叶绿体沉于离心管底部,
(8).细胞核分布于2.3mol/L蔗糖的CSK缓冲液与60%percoll CSK缓冲液的交界处一薄层中,
(9).用移液枪小心吸出这一薄层,再加入2倍体积的CSK缓冲液,12000g离心
5min,沉淀即为纯化的细胞核,
(10).用改良碱性品红苯酚染色,镜检细胞核的纯化情况.并用1/400 mm2的血细胞计数板对从烟草悬浮细胞中提取的细胞核计数.
四、液泡的分离
1原生质体分离步骤
同细胞核的分离
2.酶液配制
酶的种类及配比根据酶解材料选择.
应用的酶主要有果胶酶Y-23(pectolyase Y-23)、
果胶酶R-10(离析酶macerozyme R-10)、
纤维素酶RS(celllase "ONOZUKA")、
纤维素酶R-10(cellulase "ONOZUKA"R-10)等.
3.取材
制备原生质体时要将冲洗过的组织，表面用70%的乙醇消毒30 s.有的研究者认为,将消毒后的组织剥去表皮并切成0. 5～2mm的小条块;对于难于剥去表皮的叶片,如禾本科的一些植物,可直接切成小条.适当的萎蔫有利于原生质体分离.
4.分离与纯化
1.将处理好的材料放入直径6cm的培养皿中.
2.每2g材料加入酶液10mL,在25～30℃酶解6～12 h.
3.每隔30m in镜检一次,直到有一定数量的原生质体释放出来为止.
4.将酶解好的混合液通过尼龙网或金属网过滤,一般40～100μm.
5.用含渗透剂浓度较高的洗涤液使原生质体漂浮于液体表面,常用的渗透剂有（蔗糖、山梨醇或甘露醇）.
6.将从叶片酶解得来的原生质体混合液在500×g离心5m in,使原生质体与杂质
一起沉淀.
7.去上清液后用25%的蔗糖使之悬浮,在1500×g离心5 m in,弃沉淀,将上清液用
蒸馏水稀释3倍,再在500×g离心5m in;沉淀即为纯化的原生质体.
5液泡分离
5.1渗透裂解法
（1）.酶法制备原生质体,在制备好的120mL原生质体悬浮液中迅速(15s内)加
入等体积的介质溶液.
（2）. 介质溶液成分及浓度为: 3mmol/LMgCl2, 1mmol/L DDT(二硫基苏糖醇),
MgCl2:配置体积：100ml ,浓度：0.3mol/L ,分子量：95.21g/mol
m= 0.3mol/L*100mL*95.21g/mol=2.8563g.
DDT:配置体积：100ml ,浓度：0.1mol/L ,分子量：154.25g/mol
m=cv/M=0.1mol/L*100mL*154.25g/mol=1.5425g.
（3）.缓慢摇动后得到一个均一的悬浮液.用一个多浆叶的搅拌器搅拌2～4 m in,转速为每分钟15转.
（4）.去掉搅拌器将悬浮液通过1mm孔径的塑料板过滤,然后再通过2层玻璃棉. （5）.得到的悬浮液在23×g下离心3m in使一些杂质沉淀,将上部清液转移到另
一个250mL的离心管中,用一木条缓慢搅拌使其成为均一悬浮液;而残余的聚合团和碎片附着在木条上.去掉木条,在100×g下离团和碎片附着在木条上. (6).心悬浮液3m in,去掉上清液得到的沉淀即为含大量色素的液泡;而不含色素的液泡需要在1100×g离心3m in才能获得.
质壁分离实验报告范文
质壁分离实验报告范文 一、实验原理 当外界溶液浓度大于细胞液浓度时，根据扩散作用原理，水分子会由细胞液中渗出到外界溶液中，通过渗透作用失水;由于细胞壁和原生质层的伸缩性不同，细胞壁伸缩性较小，而原生质层伸缩性较大，从而使二者分开;反之，外界溶液浓度小于细胞液浓度，则细胞通过渗透作用吸水，分离后的质和壁又复原。 二、目的要求 1.初步学会观察植物细胞质壁分离和复原的方法; 2.理解植物细胞发生质壁分离和复原的原理。 三、重点难点（实验报告不写这一点，可适当调整添加在“注意”这一部分） 1.初步掌握植物细胞质壁分离和复原的实验方法; 2.临时装片的制作; 3.低倍显微镜的使用。实验器材：紫色洋葱的鳞片叶、刀子、镊子、滴管、载玻片、盖玻片、吸水纸（滤纸代替，滤纸可分为剪开几条）、显微镜;质量浓度为0.3g/mL的蔗糖溶液或质量分数为30%的蔗糖溶液、清水。 四、方法步骤 临时装片制作： 1选材：选用紫色特别深的洋葱外表皮;说明：在实验之前，最好将洋葱放在水中浸泡一下，可以使洋葱吸水多一些，而且代谢也比较旺盛，实验效果明显。
2：将洋葱的外层剥去两层（因为处于最外的可能已经死亡）。取表皮：在洋葱的外表皮上，用刀片划“井”字，用镊子轻轻撕取一小块;（关键：最好撕取单层细胞，如果撕的太厚，则会使细胞重叠，严重影响实验效果;）3制片：在载玻片中央滴上一滴清水，然后将取下的洋葱表皮放在水中，平展开来;加上盖玻片。（注意：1：洋葱表皮不能卷曲起来;2：不能带有气泡;3加盖玻片时，要从一侧大约45°角放下，在载玻片和盖玻片之间充满了清水，以便挤出空气。） 4盖玻片一端滴入糖水，于另一端用吸收纸重复几次吸引（可重复几次滴糖水和吸引的过程）。 质壁分离实验后可接着进行质壁复原 质壁复原实验 处理 取下临时装片，在一侧滴入清水，另一侧再用吸水纸重复几次吸引，以确保洋葱表皮细胞完全浸在几乎是清水中;（注：无吸水纸可先用滤纸代替） 观察 先在低倍镜找到一个质壁分离现象比较明显的细胞，然后观察，可见和刚才相反的现象，中央液泡渐渐变大，颜色变浅，最后原生质层又和细胞壁紧紧地贴在一起;若质壁分离没有复原，则证明外界溶液浓度过高，导致细胞死亡。三总结：细胞液浓度小于外界溶液浓度时，细胞通过渗透作用失水，发生质壁分离现象;细胞液浓度大于外界溶液浓度时，
实验一 植物细胞的质壁分离及死活鉴定
实验一植物细胞的质壁分离及死活鉴定 细胞是植物结构与功能的基本单位,而原生质则是细胞中有生命的部位。死、活细胞原生质的理化性质有显著差别，如果细胞原生质的膜系统有半透性，可与外界溶液构成渗透系统；活细胞可以主动积累某些溶质等等，而死细胞的原生质则丧失了这些特性。在植物生理研究中，经常需要鉴定细胞的死活。本实验练习两种鉴定方法：质壁分离法及活体染色法，同时还可以通过对质壁分离及活体染色结果的观察，了解原生物的某些特性，如黏滞性、荷电性等，以加深对有关理论的理解。 一、植物细胞的活体染色与死活鉴定 ［原理］活体染色是利用某种对植物无害的染料稀溶液对活细胞进行染色技术。中性红是常用的染料之一，它是一种弱碱性pH6.4～8.0之间（由红变黄），在中性或微碱性环境中，植物的活细胞能大量吸收中性红并向液泡中排泌，由于液泡在一般情况下呈酸性反应，因此，进入液泡的中性红便解离出大量阳离子而呈现桃红色。在这种情况下，原生质和细胞壁一般不着色。死细胞由于原生质变性凝固，胞液不能维持在液泡内，因此，用中性红染色后，不产生液泡着色现象，相反，中性红的阳离子却与带有一定负电荷的原生质及细胞核结合，而使原生质与细胞核染色。 ［仪器与用具］显微镜1台；小培养皿一套；载玻片2片；盖玻片2片；单面刀片1片；尖头镊子1把；酒精灯1具；火柴1盒；擦镜纸、吸水纸适量。 ［试剂］ 0.03%中性红溶液；1mol/dm３硝酸钾溶液。 ［方法］ 1.选用洋葱鳞茎（或大葱假茎基部幼嫩部位）及小麦片作实验材料。 2．切下一片较幼嫩的洋葱鳞片，用单面刀片在鳞片内侧纵横割划成0.5cm2的小块，用尖头镊子将内表皮小块轻轻撕下，即可投入中性红溶液染色（注意应将表皮内側向下）。若用小麦片为材料，可将叶片背面朝上平放在载玻片放入盛有少量清水的培养皿内，用左手将叶片按平，右手用刀从一个方向轻轻刮去下表皮和叶肉部分，只留下透明的上表皮细胞。当刮到的只剩下少量叶肉细胞时要小心，用力太重容易损伤表皮细胞，甚至只剩下一层细胞壁，太轻又会留下过多的叶肉细胞，影响观察。除了小麦外，其他禾本科植物均可用此法制备表皮细胞纸片。将刮好的纸片切成约0.5cm2的小块。
植物细胞培养
植物细胞培养 一、定义 ●在离体条件下，将愈伤组织或其他易分散的组织置于液体培养基中进行振 荡培养，得到分散成游离的悬浮细胞，通过继代培养使细胞增殖，从而获得大量细胞群体的一种技术。 ●植物中含有数量极为可观的次生代谢物质，是各种色素、药物、香精、酶等天然 产物的主要来源。 ●植物细胞培养具有以下优点： 1、提高产率 2、缩短周期 3、提高产品质量 4、易于管理，减轻劳动强度 因此主要用于生产色素、药物、食品、酶、精细化工产品等次生代谢物。 二、培养基 常用MS培养基，另外还有B5、N6、NT、AA、KM8p等培养基 三、单细胞培养 1、制备方法 （1）机械法（机械磨碎、切割） （2）酶解法（目前最有效的获得单细胞方法） （3）愈伤组织诱导法（高频振动愈伤组织） 2、培养方法 （1）平板法（似微生物平板培养） （2）看护培养与饲养层培养法 看护培养：将单个细胞接种到滤纸上再置于愈伤组织之上进行培养。 饲养层培养：用处理过（如X射线）的无活性的或分裂很慢、不具分裂能力的细胞来饲养细胞。 （3）液体浅层静置培养法：将一定密度的悬浮细胞在培养皿中形成浅薄层，封口静止培养。
（4）细胞同步化：同一悬浮培养体系的所有细胞都同时通过细胞周期的某一特定时期。植物细胞在悬浮培养中的游离性较差，容易团聚进入不同程度的分化状态，因此要达到完全同步化相当困难。 ①低温法：冷处理可提高培养体系中细胞同步化程度。 ②分选法：通过细胞体积大小分级，直接将处于相同周期的细胞进行分选，然后将同一状态的细胞继代培养于同一培养体系中。 ③饥饿法：在一个培养体系中，如果细胞生长的基本成分丧失，则导致细胞因饥饿而分裂受阻，从而停留在某一分裂时期。 ④抑制剂法：通过一些DNA合成抑制剂处理细胞，如尿苷等，使细胞滞留在DNA 合成前期，当解除抑制后，即可获得处于同一细胞周期—G1期的同步化细胞。 3、保存 （1）继代培养（高等植物、海藻等） （2）低温（ 5℃～10℃） （3）冷冻（ -20℃或液氮） 植物细胞冷冻保存方法： 在冰浴条件下加入预冷的冰冻保护剂，密封，继续冰浴15min，在-40℃停留2h后投入-196℃液氮罐中保存。 植物细胞冷冻保护剂组成： 7.5%二甲基亚砜（DMSO）＋0.5mol／L山梨醇＋5%甘油＋5%蔗糖 四、植物细胞培养的应用 1、生产药用植物代谢产物（紫杉醇、苷类等） 2、生产天然食品、食品添加剂（可可碱等） 3、生产杀虫剂、杀菌剂（鱼藤酮、除虫菊脂） 4、生产饲料、精细化工产品（桑叶、橡胶等） 五、植物细胞的生物反应器大规模培养 1、培养特性 （1）细胞本身特性（生长慢、易结团、易损伤、易污染） （2）培养液流变特性（黏度增高） （3）气体传递与影响（O2与CO2需平衡）
生物实验报告《观察植物细胞的质壁分离与复原》(完整版)
报告编号：YT-FS-8701-57 生物实验报告《观察植物细胞的质壁分离与复原》 (完整版) After Completing The T ask According To The Original Plan, A Report Will Be Formed T o Reflect The Basic Situation Encountered, Reveal The Existing Problems And Put Forward Future Ideas. 互惠互利共同繁荣 Mutual Benefit And Common Prosperity
生物实验报告《观察植物细胞的质壁分离与复原》(完整版) 备注：该报告书文本主要按照原定计划完成任务后形成报告，并反映遇到的基本情况、实际取得的成功和过程中取得的经验教训、揭露存在的问题以及提出今后设想。文档可根据实际情况进行修改和使用。 一、实验目的 1. 初步学会观察植物细胞质壁分离和复原的方法。 2. 理解植物细胞发生渗透作用的原理。 二、实验原理 当细胞液的浓度小于外界溶液的浓度时，细胞液中的水分就透过原生质层进入外界溶液中，使细胞壁和原生质层都出现一定的收缩。由于原生质层比细胞壁的收缩性大，当细胞不断失水时，原生质层就会与细胞壁逐渐分离开，也就是分升了质壁分离当细胞液的浓度大于外界溶液的浓度时，外界溶液中的水分就透过原生质层进入细胞液中，整个原生质层就会慢慢
地恢复成原来的状态，使植物细胞逐渐发生质壁分离复原。 三、材料用具 紫色洋葱鳞片叶、显微镜、载玻片、盖玻片、滴管、镊子、刀片、吸水纸、清水、0.3g/ml蔗糖溶液 四、实验过程（见书Ｐ60） 物理实验报告·化学实验报告·生物实验报告·实验报告格式·实验报告模板 五、讨论 1．如果将洋葱表皮细胞浸润在与细胞液浓度相同的蔗糖溶液中，这些表皮细胞会出现什么现象？ 2．当红细胞细胞膜两侧的溶液具有浓度差时，红细胞会不会发生质壁分离现象？为什么？ 3．画一个细胞在正常状态下到经过0.3g/ml蔗糖溶液处理，再经过清水处理的细胞变化的一系列模式图。 这里填写您企业或者单位的信息 Fill In The Information Of Your Enterprise Or Unit Here
细胞的质壁分离
观察植物细胞的质壁分离 一、实验目的： 1．学会观察植物细胞质壁分离与复原的方法。 2．了解植物细胞发生渗透作用的原理。 二．实验原理： 1．质壁分离的原理：当细胞液的浓度小于外界溶液的浓度时，细胞就会通过渗透作用而失水，细胞液中的水分就透过原生质层进入到溶液中，使细胞壁和原生质层都出现一定程度的收缩。由于原生质层比细胞壁的收缩性大，当细胞不断失水时，原生质层就会与细胞壁分离。 2．质壁分离复原的原理：当细胞液的浓度大于外界溶液的浓度时，细胞就会通过渗透作用而吸水，外界溶液中的水分就通过原生质层进入到细胞液中，整个原生质层就会慢慢地恢复成原来的状态，紧贴细胞壁，使植物细胞逐渐发生质壁分离复原。 三、实验材料： 紫色洋葱鳞片叶的外表皮。（因为液泡呈紫色，易于观察。） 0.3g/ml的蔗糖溶液。（用蔗糖溶液做质壁分离剂对细胞无毒害作用。） 三、实验步骤： 步骤注意问题分析 1．制作洋葱表皮的临时装片。在载玻片上滴一滴水，撕取洋葱鳞片叶外表皮放在水滴中展平（也可挑取几条水绵放入水滴中）。盖上盖玻片。盖盖玻片应让盖玻片的一侧先触及载玻片，然后轻轻放平。防止装片产生气泡。 2. 观察洋葱（或水绵）细胞可看到：液泡大，呈紫色，原生质层紧贴着细胞壁。（或水绵细胞中有带状叶绿体，原生质层呈绿色，紧贴着细胞壁。液泡含花青素，所以液泡呈紫色。先观察正常细胞与后面的“质壁分离”起对照作用。 3. 观察质壁分离现象。从盖玻片的一侧滴入0．3g/ml的蔗糖溶液，在另一侧用吸水纸吸引，重复几次。镜检。 观察到：液泡由大变小，颜色由浅变深，原生质层与细胞壁分离。原生质层与细胞壁之间充满蔗糖溶液。重复几次( 蔗糖溶液浓度大于细胞液浓度，细胞通过渗透作用失水，细胞壁伸缩性小原生质层的伸缩性大，液泡和原生质层不断收缩，所以发生质壁分离。) 为了使细胞完全浸入蔗糖溶液中。糖液浓度不能过高否则，细胞严重失水死亡，看不到质壁分离的复原。 4. 观察细胞质壁分离的复原现象。从盖玻片的一侧滴入清水，在另一侧用吸水纸吸引，重复几次。镜检。 观察到：液泡由小变大，颜色由深变浅，原生质层恢复原状。(细胞液的浓度高于外界溶液，细胞通过渗透作用吸水，所以发生质壁分离复原现象。) 发生质壁分离的装片，不能久置，要马上滴加清水，使其复原。重复几次。( 因为细胞失水过久，也会死亡。为了使细胞完全浸入清水中。) 四、实验讨论答案： 1．如果将上述表皮细胞浸润在与细胞液浓度相同的蔗糖溶液中，这些表皮细胞会出现什么现象？ 答：表皮细胞维持原状，因为细胞液的浓度与外界溶液浓度相等。 2．当红细胞细胞膜两侧的溶液具有浓度差时，红细胞会不会发生质壁分离？为什么？ 答：不会。因为红细胞不具细胞壁。
细胞生物学设计性实验：细胞核的分离鉴定
细胞生物学设计性实验：细胞核的分离鉴定 医学细胞生物学设计型实验设计报告 班级10级k-7班 评分 实验项目： 细胞核的分离与鉴定 实验原理：1、细胞内各种结构的比重和大小不同，在同一离心场内其沉降速度也不同。所以，用差速离心法可将细胞内各种细胞器及组分分级分离出来。差速离心法也是用来研究亚细胞成分的化学组成，理化特性及其功能的主要手段。 2、分离细胞核最常用的方法是将组织制成匀浆，在特定的条下进行离心分离，然后分析鉴定。 3、匀浆是指在低温条下，将组织放入匀浆器，加入等渗匀浆介质进行研磨，破碎细胞，使之成为各种细胞器及其包含物的匀浆液。 实验步骤：1、处死：断头处死小白鼠，手提尾部使其学业尽量流出。 2、取材：迅速开腹取肝，在盛有生理盐水的小烧杯中反复洗涤，称取湿重约为1g的肝组织放在烧杯中。 3、匀浆：加油8ml预冷的0.25mol/L蔗糖0.003mol/L绿化高永夜于烧杯中，尽量剪碎肝组织，将剪碎的刚组织倒入玻璃匀
浆器，是匀浆器下端侵入盛有冰块的器皿（如冰盘）。左手握持匀浆器，右手将匀浆捣杆垂直插入管中匀浆，直至看不到明显的组织块。 4、过滤： 用8层纱布（先用少量生理盐水或蔗糖液润湿纱布）过滤匀浆液于离心管中。 5、离心：在天平上平衡每对离心管，2500r/min离心 15min，取上清液于另一离心管中。 6、涂片：取上清液制一张涂片（涂片1）。将原离心管中剩余上清液吹打成沉淀成悬液，另制一张涂片（涂片2），自然干燥。 7、染色：分别在涂片1和2上低价甲苯胺蓝染液 ，染色5到7分钟（即滴染）。 8、洗涤：冲去染液，晾干。 9、镜检：结合实验结果的描述，镜下观察分析。 注意事项：1.操作规范，防止试剂污染。 2.细胞悬液的涂片制作要轻柔。 3.使用离心机要注意平衡，转速从低到高。 预期结果：低倍镜下找到标本，再换高倍镜，可见肝细胞核已游离出来，被染成蓝紫色，圆形，中央有2到4个甚至更多个深蓝色的核仁。 实验用品：材料：小白鼠肝脏。
观察植物细胞的质壁分离和复原
实验九观察成熟植物细胞的质壁分离和复原 实验原理： 当外界溶液浓度大于细胞液浓度时，根据扩散作用原理，水分会由细胞液中渗出到外界溶液中，通过渗透作用失水； 由于细胞壁和原生质层的伸缩性不同，细胞壁伸缩性较小，而原生质层性较大，从而使二者分开； 反之，外界溶液浓度大于细胞液浓度，则细胞通过渗透作用吸水，分离后的质和壁又复原。 目的要求： 1．初步学会观察植物细胞质壁分离和复原的方法； 2．理解植物细胞发生质壁分离和复原的原理。 重点和难点： 1．初步掌握植物细胞质壁分离和复原的实验方法； 2．临时装片的制作； 3．高倍显微镜的使用。 实验器材： 紫色洋葱的鳞片叶、刀子、镊子、滴管、载玻片、盖玻片、吸水纸、显微镜； 质量浓度为0.3g/mL的蔗糖溶液、清水； 方法步骤： 一．临时装片制作： 1．选材： （1）选用紫色特别深的洋葱外表皮； 说明： A．在实验之前，最好将洋葱放在水中浸泡一下，可以使洋葱吸 水多一些，而且代谢也比较旺盛，实验效果明显。 B．将洋葱的外层剥去两层，因为处于最外的可能已经死亡； （2）取表皮： 在洋葱的外表皮上，用刀片划一些“井”字，用镊子轻轻撕取一小块； 关键： 最好撕取的是一层细胞，如果撕的太厚，则会使细胞重叠，严重影响 实验效果； 2．制片： 在载玻片中央滴上一滴清水，然后将取下的洋葱表皮放在水中，平展开来； 加上盖玻片。 二○○一年十月二十五日星期四第 1 页共4 页
二○○一年十月二十五日星期四 第 2 页 共 4 页 注意： A ． 洋葱表皮不能卷曲起来； B ． 不能带有气泡； C ． 加盖玻片时，要从一侧大约呈45°角放下，在载玻片和盖玻片之间 充满了清水，以便挤出空气。 二．观察： (一) 低倍镜观察： (二) 高倍镜观察： 在高倍镜下主要要注意以下几个结构： （1 ） 紫色的大液泡，几乎充满了整个细胞； （2） 注意观察原生质层和细胞壁紧紧地贴在一起。 （3） 找到细胞核，它是判断液泡膜还是细胞膜的关键。 (三) 质壁分离实验： 1．处理： 从载物台上取下装片，在盖玻片的一侧，滴入0.3g%mL 的蔗糖溶液，另一侧用吸水纸重复吸引几次。 实验成功关键之处： (1) 最好多重复几次，因为在洋葱表皮周围充满的是清水，如 果不多重复几次，洋葱表皮周围的蔗糖溶液浓度太低，质壁分离效果不明显。 (2) 所用的溶液特别要注意以下几点： A ． 不能是对植物细胞有伤害作用的物质，如强酸强 碱，因为它们会使细胞致死，而死亡的细胞内的膜便失去了选择透过性，而成了全透性； B ． 外界溶液中的物质必须是不可以被植物细胞吸收的物
植物细胞悬浮培养技术
植物细胞悬浮培养技术 一、基本原理 利用固体琼脂培养基对植物的离体组织进行培养的方法在某些方面还存在一些缺点，比如在培养过程中，植物的愈伤组织在生长过程中的营养成分、植物组织产生的代谢物质呈现一个梯度分布，而且琼脂本身也有一些不明的物质成分可能对培养物产生影响，从而导致植物组织生长发育过程中代谢的改变而利用液体培养基则可以克服这一缺点，当植物的组织在液体培养基中生长时，我们可以通过薄层震荡培养或向培养基中通气用以改善培养基中氧气的供应。植物细胞的悬浮培养是指将植物细胞或较小的细胞团悬浮在液体培养基中进行培养，在培养过程中能够保持良好的分散状态。这些小的细胞聚合体通常来自植物的愈伤组织。 一般的操作过程是把未分化的愈伤组织转移到液体培养基中进行培养。在培养过程中不断进行旋转震荡，一般可用100～12Or/min 的速度进行。由于液体培养基的旋转和震荡，使得愈伤组织上分裂的细胞不断游离下来。在液体培养基中的培养物是混杂的，既有游离的单个细胞，也有较大的细胞团块，还有接种物的死细胞残渣。 在液体悬浮培养过程中应注意及时进行细胞继代培养，因为当培养物生长到一定时期将进入分裂的静止期。对于多数悬浮培养物来说，细胞在培养到第18～25d 时达到最大的密度，此时应进行第一次继代培养。在继代培养时，应将较大的细胞团块和接种物残渣除去。若从植物器官或组织开始建立细胞悬浮培养体系，就包括愈伤组织的诱导、继代培养、单细胞分离和悬浮培养。目前这项技术已经广泛应用于细胞的形态、生理、遗传、凋亡等研究工作，特别是为基因工程在植物细胞水平上的操作提供了理想的材料和途径。经过转化的植物细胞再经过诱导分化形成植株，即可获得携带有目标基因的个体。 二、器材 超净工作台、高压蒸汽灭菌器、恒温培养箱、磁力搅拌器、恒温空气摇床、镊子、锥形瓶、水稻种子 三、操作步骤 1．配制培养基 按照培养基配方取各种药品，最后用蒸馏水定容到所需体积。所配制的培养基经高压蒸汽灭菌后备用，固体琼脂培养基分装在250mL 的锥形瓶内，每瓶约分装30mL。 2．水稻种子的消毒 （1）将种子置于无菌的培养皿内，以体积分数95％的酒精消毒1～2min。 （2）取出后用无菌水冲洗2～3 遍。 （3）将种子放入25.0g/L 的次氯酸钠溶液中轻轻摇动后，浸泡60min 。 （4）取出后用无菌水冲洗，将次氯酸钠溶液充分洗净。 3. 接种 在超净工作台内，将灭菌后的水稻种子接到诱导愈伤组织的固体培养基上，每个培养瓶接5～10 粒种子。接种完毕后用封口膜将培养瓶封好，放在26℃的恒温培养箱中进行黑暗培养。 4．悬浮培养的开始： 当得到愈伤组织后，将其转人到AA 液体培养基中。注意愈伤组织块应小于3mm . 若组织块较大可用无菌解剖刀将其分割成小块。液体培养基分装在250mL 的锥形瓶内．接种完毕后将瓶口用封口膜封好，把培养瓶放到恒温摇床上进行震荡培养。调整摇床的旋转速度，使之为120r/min。培养温度为26℃，在黑暗中培养。 5．悬浮培养物的保持 进行悬浮培养后要不断进行观察，由于培养物的继代培养与培养瓶内培养物的密度及细胞
植物细胞组织培养技术
植物细胞组织培养技术实验指导书 生物实验教学中心 主编：杨卫民 2009-06-01
目录 实验一、植物组织培养培养基母液的配制 (1) 实验二、植物组织培养的培养基配制 (5) 实验三、康乃馨的离体快繁 (9) 实验四、胡萝卜愈伤组织的建立 (14) 实验五、组织培养物的继代培养 (18)
实验一组织培养基母液的配制 一、仪器及药品 冰箱、天平（0.0001g） 容量瓶:1000ml,500ml、250ml、100ml、25ml 广口储液瓶：500ml、250ml、50ml、25ml 烧杯：1000ml、500ml、250ml、100ml、50ml 数十根玻璃搅棒、大药勺、小药勺或挖耳勺 标签纸、胶水、50%酒精、95%酒精、1mol/L盐酸、1mol/L NaOH 几种常用的培养基所需的大量元素、微量元素、有机物、激素、铁盐等药品 蒸馏水 二、方法和步骤： 按照培养基配方,把大量元素、微量元素、铁盐、有机物、植物激素分类,每一类 中各种药品分别称量,如N6培养基各种母液的配制步骤如下： 大量元素母液：包括用量较大的几种化合物〈见N6培养基配方〉，按表中排列顺序,将每种药品的用量扩大10倍，分别称取，分别溶解，然后按照顺序混合在一起。如钙盐等易发生沉淀的药品不能混合，应单位定容，最后加上蒸馏水，定容至1升或500毫升。在定容时注意用蒸馏水洗净烧杯和玻璃搅棒以减少误差。定容后的溶液为大量元素母液，配制培养基时，每配1L培养基需吸取该母液l00ml或50ml。 微量元素母液：因用量少，为了称量精确和方便,常配成100倍或1000倍的母液，即每种药品扩大l00倍或者l000倍。逐个溶解，混合在一起成为微量元素母液，每配1L N6培养基需吸取该母液10ml或者1ml。 铁盐：在N6培养基中需要单独配制，它是由硫酸亚铁（FeSO4?7H2O）2.78g和乙二氨四乙酸二钠（Na2-EDTA）3.73g，分别溶解，混合后，用酒精灯加热半小时以上，冷却后定容至1L。冰箱过夜贮藏无结晶析出，否则重新配制。每配l升N6培养基需加该铁盐母液5 ml。 有机物质：主要指氨基酸，维生素类物质。它们大都是扩大1000倍，分别称量，分别定容和储存，配制培养基时按需要的量加入。 植物激素：常用的有生长素类如：2,4-D、萘乙酸（NAA）、吲哚乙酸（IAA）、吲
细胞核的分离
实验四细胞核的分离 [实验目的] 1. 为了研究细胞核及其组分。 2. 定量分析细胞核的生化组分及其它一些特殊成分。 [实验原理] 1956年由chauveau等人提出，用高密度介质来分离细胞核。由于细胞核的密度较大，在高密度介质中，在高速离心条件下沉降下来，从而达到与细胞质其它成分分开来的目的。chauveau 的方法是将动物肝脏直接在2.2mol/l蔗糖溶液中匀浆，然后高速离心40 000g 1小时，细胞核沉淀到底部，线粒体和完整细胞，包括红血球漂浮在液面，通过一步操作即可分离得到细胞核。其后又有不少研究者对此方法进行了改进，例如加进氯化钙、氯化镁、氯化钾等改变分离介质的渗透压；选择介质的ph以及不同的高密度蔗糖溶液离心方法等。这样减少了细胞核的脆性，防止聚集，维持恒定的ph，就能保持细胞核的精细结构。虽然这一方法比较简单，能得到较高纯度的细胞核，也已被广泛采用，但实验需要高速离心机，这在一般实验室不能进行，此方法要用高浓度的蔗糖，如果要分离大量的细胞核，也很不经济。 目前在一般实验室中更多的是用柠檬酸分离细胞核，在柠檬酸介质中分离细胞核可以显著地除去附着在细胞核膜上的细胞质成分。由于柠檬酸降低了溶液的ph值，这样可以减少细胞核的破碎率，并能分离得到较高分子质量的核酸，可能是由于核糖核酸（一种酸溶性蛋白）被柠檬酸除去，以及二价阳离子被柠檬酸螯合所致。 柠檬酸的浓度对分离细胞核的质量有较大影响。通常在较低的ph值时，可以得到较高的细胞核。但在过酸条件下，可能引起细胞核成分的改变和酶的失活。为了研究细胞内核酸，一般常在ph值为4，甚至在ph值为2.5时分离细胞核。如为了分离细胞核的酶，则需要较温和的条件，此时可以在ph值为6～6.2的极稀柠檬酸溶液中分离细胞核。
植物细胞质壁分离与复原详细实验步骤
植物细胞质壁分离与复原详细实验步骤 （一）制作临时装片并观察 1、制片 ①、用拇指和食指夹住载玻片，然后取三层纱布沿一个方向擦拭载破片，直到对光看到载玻片光亮无污物为止。 ②、在载玻片上滴一滴水。（注意胶头滴管的正确使用方法：①握持方法是用中指和无名指夹住玻璃管部分以保持稳定，用拇指和食指挤压胶头以控制试剂的吸入或滴加量。 ②不能倒置，也不能平放于桌面上。③胶头滴管加液时，不能伸入容器） ③、 A 、洋葱：选用紫色特别深的洋葱外表皮，用刀片划“井”字，用镊子轻轻撕取中间的小正方形。（注意在洋葱未经过处理时一定要取外表皮）由于每种材料主要只在取材上有区别，其它步骤基本类似。下面老师演示一种洋葱鳞片叶外表皮装片。 ④、将撕取的洋葱鳞片叶外表皮借助解剖针放在水滴中展平，主要是为了细胞尽量无重叠。 ⑤、用镊子夹住盖玻片盖在载玻片上（同学们注意：盖盖玻片应让盖玻片的一侧以大约 45 ?先触及载玻片，然后轻轻放平，防止装片产生气泡）如果四周水过多可以用滤纸吸一下。 2、观察洋葱细胞 显微镜使用顺序：取镜—安放—对光（无载破片）打开光源—低倍镜对准通光孔—聚光器调到最高—调节反光镜—把宏光光圈打开（如果还不够亮可以稍微动一下粗准焦螺旋）—放装片—先用低倍镜调粗准焦螺旋至物像清晰，并调至中央，后扭转物镜转换器用高倍镜观察 可以看到洋葱鳞片叶表皮细胞中紫色的中央液泡，还可以看到原生质层紧贴着细胞壁。 （二）、观察质壁分离及复原 1、观察质壁分离现象 ①取下载玻片（如果不取下，在载物台上滴加蔗糖会一不小心滴漏在显微镜上，会损坏显微镜） ②从显微镜上取下装片，放在实验桌上。从盖玻片的一侧滴入0.3g /mL的蔗糖 溶液，在盖玻片的另一侧用吸水纸吸引，重复几次，为什么要重复呢？让盖玻片下面的洋葱鳞片叶完全侵润在蔗糖溶液中。 ③高倍镜观察表皮细胞发生的变化。中央液泡变小，原生质层脱离细胞壁 2、观察细胞质壁分离的复原现象 ①取下载玻片（如果不取下，在载物台上滴加清水会一不小心滴漏在显微镜上, 会损坏显微镜） ②从显微镜上取下装片，放在实验桌上。从盖玻片的一侧滴入清水，在盖玻片另一侧用吸水纸吸引，这样重复几次。洋葱鳞片叶表皮浸润在清水中。 ③用高倍显微镜观察，可以看到中央液泡逐渐胀大，原生质层又逐渐贴向细胞壁。实验
细胞核的分离与鉴定设计型实验设计报告_(2)
实验项目：细胞核的分离与鉴定 实验原理： 分离细胞核的可用方法有吸出法、原生质体破裂法、差速离心法排和排除法。差速离心法是根据细胞内各种细胞结构的比重和大小不同，因而在同一离心场内的沉降速率不同从而将细胞内的结构分级分离出来。本实验就采用差速离心法。 细胞核的鉴定，因为细胞核中主要含DNA，而DNA是碱性蛋白，可用甲苯胺蓝染液可使细胞核内碱性蛋白呈现出来。 实验器材：显微镜，普通离心机，离心管，滴管，玻璃漏斗，纱布，烧杯，解剖剪，镊子，玻璃匀浆器，载玻片/盖玻片，染色盘架，小白鼠肝脏。 实验试剂：甲苯胺蓝染液，蒸馏水，0.25mol/L蔗糖-0.003mol/L的CaCl2溶液，生理盐水 实验步骤： （1）、用颈椎脱臼法处死小白鼠，迅速解开其腹腔取出肝脏，去出结缔组织，剪成小块，尽快置于盛有0.9%NaCl的烧杯中。反复洗涤尽量除去血污，用滤纸吸去表面的液体。 （2）、将湿重为1g的肝组织放入烧杯中，用量筒取8ml预冷的0.25mol/L 蔗糖-0.003mol/L的CaCl2溶液，先加少量溶液于烧杯中，尽量剪碎肝组织后全部加入。 （3）、将剪碎的肝组织导入匀浆管中，使匀浆器下端侵入盛有冰块的器血
中，左手持，右手将匀浆捣杆垂直插入管中，上下转动研磨3-5次。用3层纱布过滤于匀浆管中，然后制备一张涂片①，自然干燥。 （4）、将装有滤液的离心管配平后，放入普通离心机以2500r/min离心15min,弃去上清液。 （5）、用6mol 0.25mol/L蔗糖-0.003mol/L的CaCl2溶液悬浮沉淀物，以2500r/min离心15min 弃去上清液，将残留液体用气管吹成悬液，滴一滴于干净的载盖玻片上，制成涂片②，自然干燥。 （6）在①·②上滴加甲苯胺蓝染液，染色5-7min，洗涤干燥后镜检。 ⑺记录观察结果 注意事项： （1）尽可能充分剪碎肝组织，缩短匀浆时间，整个分离过程不宜过长，以保持组分生理活性。 （2）将匀浆液置于蔗糖溶液上层时要沿管壁小心加入，同时及时离心，以防止浆液中的颗粒自然下沉过快，影响后面的离心分层效果。 （3）涂片制作过程中把握好涂片的力度，不可太厚。 （4）染色后的洗涤要注意时间，不可过长，避免将染色洗去，观察不到细胞核。 （5）开腹取出肝后，用生理盐水反复冲洗，避免血细胞对食盐的影响。 预期结果： 在低、高倍镜下，可以观察到经.0.1%碱性固绿染色的小白鼠肝细胞的细胞核体被染成绿色。说明这是碱性蛋白，即细胞核已游离出来。 涂片在高倍镜下可见肝细胞核已游离出来，被染成蓝紫色、圆形、中央有
关于植物质壁分离与复原的实验报告单
观察植物细胞的质壁分离和复原 一、实验目的 1．学会观察植物细胞质壁分离与复原的方法； 2．了解植物细胞发生渗透作用的原理。 二．实验原理 成熟的植物细胞在一定浓度的溶液中，构成一个渗透系统。当水分通过原生质层出入细胞后，由于原生质层与细胞壁的伸缩性大小不同，将导致原生质层与细胞壁分离或复原。 三、实验材料、用具 实验材料：（原因？） g/ml的蔗糖溶液（可否适用0.5g/ml的蔗糖溶液？原因？） 显微镜，镊子、载玻片及盖玻片、滴管、水等 四、探究程序 1：制作临时装片与观察 制作临时装片：用刀片在洋葱鳞片叶的外表面划一个小方块，用镊子撕取这一小块洋葱表皮，将它平展地放在载玻片中央的清水滴中，并盖上盖玻片； 观察：先用低倍镜找到洋葱表皮细胞，并移到视野中央，然后移走低倍镜，换上高倍镜。这时可看到洋葱表皮细胞中紫色的大液泡，还可以看到______ __________________________________；2：细胞的质壁分离 滴蔗糖溶液：从载物台上取下装片，从盖玻片的一侧滴入0.3g／mL的蔗糖溶液，在盖玻片的另一侧用吸水纸吸引。这样重复几次，洋葱表皮细胞就浸润在蔗糖溶液中 观察：将装片放在载物台的中央，先用低倍镜观察，再用高倍镜观察。可以看到细胞中的液泡逐渐变小，_________________________________，最后完全分离 3：质壁分离的复原 滴清水：从载物台上取下装片，从盖玻片的一侧滴入清水，在盖玻片的另一侧用吸水纸吸引这样重复几次，洋葱表皮细胞又浸润在清水中 观察：将装片放在载物台的中央，先用低倍镜观察，再用高倍镜观察，可以看到中央液泡逐渐胀大，原生质层又逐渐贴着细胞壁 五、实验结果及结论的分析 1．实验现象： 在细胞液的浓度__________外界溶液的浓度时，洋葱鳞片叶表皮细胞就失水，液泡体积，细胞液浓度，颜色；发生质壁分离； 在细胞液的浓度__________外界溶液的浓度时，细胞就吸水，液泡体积，细胞液浓 度，颜色已出现了质壁分离的细胞，发生质壁分离复原。 2．实验结论 细胞能否从外界吸收水分取决于细胞液的浓度和外界溶液浓度的高低。当细胞液的浓度高于外界溶液的浓度时，细胞就吸水，否则就失水 习题 1．对图示的生物学实验的叙述正确的是（） A．图甲是用低倍显微镜观察某视野中的图像，如要看清洋葱根尖处于分裂期的细胞，应将装片适当向左移动 B．图乙是某同学在2m×2m样方范围内进行的双子叶草本植物苦荬菜种群密度的调查，圆圈表示个体，则这块地苦荬菜的种群密度为3.25株/m2 C．图丙是在高倍显微镜下观察到的黑藻叶细胞的细胞质处于不断流动的状态，实际上图中所标注的叶绿体位于右下角，细胞质按逆时针方向流动 D．图丁表示用高倍显微镜观察正在发生质壁分离的紫色洋葱表皮细胞，可见其液泡的颜色逐渐变浅 2．很多生物学实验都需要制作临时装片，在显微镜下观察，下列实验步骤不正确的是（） A．脂肪的鉴定：切取花生子叶薄片→染色→洗去浮色→制片→观察 B．观察细胞中叶绿体：取黑藻幼嫩小叶→染色→制片→观察 C．察观察细胞有丝分裂：解离洋葱根尖→漂洗→染色→制片→观察 D．观察细胞质壁分离：制作洋葱鳞片叶表皮装片→观察→滴入0．3g/mL蔗糖溶液→观察 3．（多选）用一个紫色洋葱的鳞片叶可做下列哪些实验的材料? （） A．观察植物细胞减数分裂B．观察植物细胞的质壁分离和复原 C．观察细胞中DNA和RNA的分布D．叶绿体中四种色素的提取和分离 ①
观察植物细胞质壁分离与复原
《实验七观察植物细胞质壁分离与复原》 作者：郭文娟 【教材分析】这是人教版生物高中第一册第三章第四节《植物对水分的吸收和利用》中的一节实验课是帮助学生理解细胞吸水原理的有力实例，但是这个实验的操作相对简单，因此在教学目标上， 1. 初步学会观察植物细胞质壁分离和复原的方法 2．理解植物细胞发生渗透作用的原理我在原有的基础上，添加了用课本实验的方法，让学生体验实验设计的几个重要基本原则的目标【教学重难点】 1. 观察植物细胞的质壁分离 2. 理解植物细胞发生质壁分离与复原的原理根据我对高二学生的了解，他们具备了以下四个特征，而且在以往的实验课中经常想尝试做一些自己的实验，也正是由于这点，使我在这节课中作了一个新设计实验的尝试 【教学方法】保证学生能在上完这节课后，要留下对学习过程的记录和今后作为复习的第一手资料，因此我使用了学案教学的方法， 【学案教学法】 学案的使用分为课前预习、课堂导学、课后巩固测试三部分 【教学过程】 一、导课用导学案的预习部分，以回忆知识的方式，讲解实验原理，了解实验用具和材料，同时将方法步骤中的难点和注意事项交代清楚。 用大约5-6 分钟的时间，学生已经对课本实验已经了解透彻，可这个实验操作很简单，那我们能不能完成这个实验的同时再多做一些观察呢？有些学生就想观察一些其他的植物。 导学案上就提出可不可以根据课本实验，用质壁分离的原理比较其他植物细胞与洋葱表皮细胞吸水能力的强弱吗？ 问题提出后教师就利用导学案上的“课堂导学”部分对学生进行引导，学生通过讨论完成导学案上实验设计。这里我在导学案的实验设计中把它分解为以下这三个问题，为什么这样设置呢？ 首先变量是实验的核心；设计实验的核心归根到底就是要确定实验变量的选择；学生只有抓住了这个核心，才能抓住这个实验设计的要诀。 而接着对照实验组的确定无非就是对实验变量的控制，保证实验中对照实验组之间只有一个变量不同，无关变量尽量控制在相同的条件下。 第三观察现象的确定，在这一步里学生必须找到一个能确定实验结果的可观测指标，使这个实验具有可操作性。 这样的设置看似简单，但其中却恰恰包含了新课标对学生思维培养的一种期待，这种期待是什么呢？ 通过这个简单的实验，学生掌握的不仅仅是专业知识，更是在这个过程中潜移默化地培养他们的思维，这种思维不仅仅可以用在今后的生物学习中，更可以用来解决人生道路上的各种问题。 就这个案例来说，从讨论实验设计的方法中，学生可以体会到单一变量原则、对照原则、可行性原则，事实上这些原则提炼出来就是实事求是、严谨全面、正视困难的精神，当学生在今后学习生活当中遇到问题的时候，遵循这样的精神，去寻找解决问题的方法。 当然，这节课中，学生对学案中提出的问题大感兴趣，他们找到了很多植物，除了课本上的洋葱，还有红花羊蹄甲、菠菜、香葱、美人蕉等等植物，确定实验变量为不同植物细胞。 在设计对照实验的过程中，同学们设计了各种各样的对照实验，我选了几个比较有特色的三组同学的
探究植物细胞质壁分离的创新实验说课稿
探究植物细胞质壁分离的创新说课稿 武陟一中梁西周 一、理论背景及实验创新理念 目前高中生物教学中尽管改革不断深化，课堂的人文性有所加强，但生物课堂教学效率低下，低效教学甚至无效教学在传统的教学中仍然大量存在。因此当前亟待解决的问题就是如何实现有效教学，以尽可能少的时间、精力和物力投入，取得尽可能多的教学效果。对实验的创新是必要的，在改进中的和创新中使学生对实验的原理、现象、结论及其运用有更好的理解和掌握，相对传统的实验，创新实验的效果更明显，更易于激发学生的学习和探究热情，培养学生的发散思维和逆向思维，在教学过程中做到有效果、有效率、有效益。 二、教学内容分析 本案例出自必修1《分子与细胞》新课标内容的第四章第一节：物质跨膜运输的实例。本实验是在学习扩散和渗透、被动转运、主动转运知识的基础上，利用植物细胞质壁分离及质壁分离复原实验强化渗透作用原理，同时也是对物质出入细胞方式这块内容的升华。本实验也是在初中《科学》“根对水分的吸收”的基础上进一步学习植物的水分代谢过程。同时也与后面学习的细胞呼吸作用和光合作用存在一定程度的联系，是植物体新陈代谢的基础。 三、学情分析 学生除拥有初中自然科学相关水分吸收内容基础知识外，在学习物质出入细胞的方式内容后，他们对植物细胞在什么情况下吸水和失水等内容已经有所了解，并在日常生活经验中也有类似植物细胞吸水失水的实例，例如萝卜咸菜腌制等。但并没有系统学习植物细胞吸水和失水的基本原理及条件，缺乏感性认识。与平时理论课相比，学生对实验课有更高的积极性，对课本中没有的创新实验有更强的探究欲望。 四、教学目标 高中生物课程标准的基本理念中明确指出倡导探究性学习和注重与现实生活的联系。尝试从不同角度思考、分析和解释观察的现象，树立实事求是的科学态度；解释植物细胞质壁分离及质壁分离复原的现象。 1．知识目标：解释植物细胞渗透吸水的原理和过程；解释质壁分离与复原的实质；说明质壁分离能否自动复原的条件。 2．能力目标：初步学会观察植物细胞质壁分离和复原的方法；尝试对实验结果进行分析和解释并得出相应的结论；运用质壁分离与复原知识解决实际问题；复习并熟练光学显微镜的操作步骤。 3．情感目标：参与小组合作与交流，体验团队协作学习过程；通过实验结果和现象观察，养成实事求是的科学态度；培养不断探求新知的精神和合作精神。 五、教学重点与难点
实验设计-细胞核的提取与鉴定
医学细胞生物学设计型实验设计报告 姓名：李飘班级：K—10班学号：1020151004 评分 【实验项目】：动物细胞细胞核的分离与鉴定 【实验原理】：核体的制备核体是指含有少量细胞质并由质膜包裹的 细胞核。因为在实际中我们不可能100%的得到细胞核，因此,我们只能制备含有少量细胞质的核体，核体的制备方法主要有吸出法和原生质体破裂法等。在本实验中我们采用排除法来制备核体。排除法制备核体是通过细胞松弛素和高速离心的作用使细胞核排出，然后从离心管底部沉淀中收集获得核体。 细胞核的鉴定因为细胞核中主要含DNA，是碱性蛋白。因此将分离出的核体经三氯醋酸处理,抽提掉核酸后，用碱性固绿溶液染色，可以使细胞核内的碱性蛋白显示出来。 【实验步骤】： 1．细胞培养：将欲分离微核体和细胞质的动物接种于脱核塑料圆板上，使适宜的培养基中于37 ℃的条件下培养，使细胞固定在脱核塑料圆板上，脱核塑料圆板的直径应稍小于离心管的直径，使用前先用水洗干净再经过乙醇杀菌处理。 2．秋水仙碱处理：细胞培养一段时间以后，加入0.1ug/ml的秋水仙碱，处理细胞48～60h 滤纸，使细胞形成多个大小不同的核体。 3．细胞松弛素处理：在离心管内加入5ml预热至37 ℃的细胞松弛素B溶液将固定有动物细胞的圆板面朝下放入离心管内，固定圆板位置后，再加入10ml37 ℃的CB溶液。 4．离心：在1000～15000r/min核体从细胞排出。 5．收集核体：由于核体的贴附力弱，可以从离心管底部的沉淀中收集。 6．固定：将收集的核体涂于玻片上制成涂片，滴加15%乙醇于涂片上，固定5min，室温晾干。 7．三氯醋酸处理：将已固定的血涂片浸在90 ℃的三氯醋酸溶液中处理20min，细流水反复冲洗玻片上的三氯醋酸直至冲尽。用滤纸吸于玻片上多余水分晾干。 8．染色：将制作好的涂片放入0.1%碱性固绿染液中染色10～15min，细流水冲去多余染液，晾干，镜检。 【注意事项】： 1．在离心管内加入的5ml细胞核松弛素B溶液要预热到37 ℃，因为只有这样才接近动物的最佳体温37 ℃。 2．涂片在用三氯醋酸处理时，时间不宜过长或过短，过长会使核膜裂解，过短使抽提的核酸不够。 3．在染色时，时间一定要足够，否则染色不完全，得不到理想的实验结果。 4．因去掉胞质的核体贴附能力弱，因注意在固定、三氯醋酸处理、染色时、尽量避免胞核的脱落。 【预期结果】：经碱性固绿染色的核体涂片被染成绿色，说明这是碱性 蛋白，即细胞核。
〖实验6〗观察植物细胞的质壁分离和复原
〖实验6〗观察植物细胞的质壁分离和复原（B1C4P61“探究”） 一、实验目的： 1．学会观察植物细胞质壁分离与复原的方法。2．了解植物细胞发生渗透作用的原理。 二．实验原理： 1．质壁分离的原理：当细胞液的浓度小于外界溶液的浓度时，细胞就会通过渗透作用而失水，细胞液中的水分就透过原生质层进入到溶液中，使细胞壁和原生质层都出现一定程度的收缩。由于原生质层比细胞壁的收缩性大，当细胞不断失水时，原生质层就会与细胞壁分离。 2．质壁分离复原的原理：当细胞液的浓度大于外界溶液的浓度时，细胞就会通过渗透作用而吸水，外界溶液中的水分就通过原生质层进入到细胞液中，整个原生质层就会慢慢地恢复成原来的状态，紧贴细胞壁，使植物细胞逐渐发生质壁分离复原。 六、实验结论：_____________________________________________________________。 实验4key： 三.实验假设：原生质层相当于一层半透膜 四、实验流程：液泡的大小蔗糖原生质层清水 五、注意事项：水平污染载物台太长太高复原 六、实验结论：原生质层相当于一层半透膜 （实验材料：紫色洋葱鳞片叶的外表皮。因为液泡呈紫色，易于观察。也可用水绵代替。0.3g/ml的蔗糖溶液。用蔗糖溶液做质壁分离剂对细胞无毒害作用。）
i 质、壁的概念 1.发生质壁分离复原的植物细胞中，水分经过的结构依次是（） A．细胞膜、液泡膜、细胞质、细胞壁B．细胞壁、细胞膜、细胞质、液泡膜 C．液泡膜、细胞质、细胞膜、细胞壁D．细胞壁、细胞膜、液泡膜、细胞质 2.某学生做“细胞的质壁分离和质壁分离复原”实验，所用材料为紫色洋葱，试剂是30%蔗糖溶 液，请据图回答下列问题： ⑴显微镜下观察到洋葱表皮细胞图B处于 ___________________状态；由A形成B的原因 是___________________________。 ⑵从结构上看，图A中的原生质层是由［］_____ _____、［］__________、［］_____________ 共同构成的，相当于 ⑶“⑦”处溶液是_____________________；“⑧”处溶液是_____________________。 ⑷实验过程中看到的是，当细胞浸泡在30%蔗糖溶液中后，液泡的颜色变_________，说明细胞 通过渗透作用而______________；当已发生质壁分离的细胞置于清水中后，液泡的颜色变_________，说明细胞通过渗透作用而_______________。 ⑸若将B细胞放入清水中它_______（填“会”或“不会”）无限吸水，理由是____ ________。ii 质壁分离、复原的原理：浓度差、半透膜、渗透吸水、活细胞 3.植物细胞发生质壁分离的内因是（） A．外界溶液浓度大，细胞液浓度小B．原生质层伸缩性小，细胞壁伸缩性大 C．外界溶液浓度小，细胞液浓度大D．原生质层伸缩性大，细胞壁伸缩性小 4.下列结构中会影响细胞渗透吸水，但基本不影响细胞渗透失水的是（） A．细胞膜B．液泡膜C．细胞液D．细胞壁 5.（06广东）2．以紫色洋葱鳞茎表皮为材料观察植物细胞质壁分离现象，下列叙述错误的是（） A．在发生质壁分离的细胞中能观察到紫色中央液泡逐渐缩小 B．滴加30％的蔗糖溶液比10％蔗糖溶液引起细胞质壁分离所需时间短 C．发生质壁分离的细胞放入清水中又复原，说明细胞保持活性 D．用高浓度的NaCl溶液代替蔗糖溶液不能引起细胞质壁分离 iii 质壁分离与否的判断 6.置于30%的蔗糖溶液中会发生质壁分离的一组细胞是（） A．用95％乙醇浸泡过的洋葱鳞片叶上表皮细胞（死）B．玉米根分生区细胞和伸长区细胞C．形成层细胞和胚芽细胞D．洋葱表皮细胞和根毛细胞 7.如果把一个膨胀到最大限度的植物细胞放在“它自己的细胞液”溶液（与膨胀前浓度相等的溶 液）中，则细胞（） A．没有变化B．水被释放，最后质壁分离C．细胞胀破D．细胞失水，但不会质壁分离8.具有液泡的成熟植物细胞放入蔗糖溶液中，经一段时间，这个细胞会发生的变化是（） A．液泡变大B．液泡变小C．液泡保持不变D．无法肯定 iv 质壁分离的结果 9.(08广东卷·3)观察在0.3g／mI．蔗糖溶液中的洋葱表皮细胞，发现中央液泡逐渐变小，说明 A．细胞壁相当于一层半透膜B．洋葱表皮细胞是活的 C．此时蔗糖溶液浓度小于细胞液浓度D．细胞壁收缩导致中央液泡失水