肿瘤模型构建

肿瘤模型构建

小鼠模型分三大类

第一类是以S180、EAC、H22等为代表的，他们的宿主小鼠多选用KM，可产生腹水，也可在皮下成瘤。多以腹水传代，实验时抽取腹水，经过一定稀释后皮下接种构建模型，接种后第二天开始给药（这里与指导原则相悖，指导原则要求肿瘤长至100-300立方毫米时才给药），给药7到10天，接种10天后结束试验，剥取肿瘤称瘤重。

1. 构建瘤种

可以用体外细胞株培养后，用PBS悬浮至1~3×106/0.1ml/mouse，i.p接种即可，最好用6号左右的针头，就是常用的2ml一次性注射的针头。细胞悬液接种时要选活力好的细胞，就是对数期。细胞生长至瓶底70~80%满的时候认为是对数生长期。

2. 腹水传代

观察到第一代的种鼠肚子较大后（一般约8~9天左右），可以传代，传代时取1ml注射器，用2ml注射器的针头，种鼠腹部消毒后直接将针头插入抽取腹水即可，注意不要把针头插得很深，尽量浅一点，还可以把老鼠拎起来，利用重力，让腹水集中在某处便于抽取，一般抽个0.5ml就可以了，不用离心，直接用PBS3~6倍稀释后，接种到新的老鼠腹腔，腹水颜色为白色或者略有发黄都是正常的，但是血性腹水说明不好，需要注意调整。

第二代以后，尽量6~7天的时候传代，不要等的时间太久，否则腹水容易血性。三代后可用于试验。腹水瘤接种时，接种量不要太高，1*107/ml，0.2ml即可，多按1：3用生理盐水稀释，否则有可能腹水血性。超过7天的腹水再传代，动物的周龄太大（>6周）,传代次数太多也很容易出现血性腹水。一般小鼠肿瘤模型都控制在30多代以内（也有说50多代的）。出现血性以后可以调整一下：血性腹水可以离心后加0.17N的NH4CL溶液破红细胞，然后精确控制条件（接种量，传代时间，动物周龄等）传几代，很多情况下再传一两代后会有无腹水血性的种鼠出现，然后用这只种鼠的腹水继续传代。

腹水难抽有几种情况，要么接种天数不够，腹水不够多，一般要等动物肚子很大了才去抽。要么就是压力的问题。有的动物腹水很稠。这时可撕开小鼠肚子，拿掉针头，直接抽干净，最多的时候可抽到5ml。

3. 接种

这个时候抽取的腹水需要量比较多，有时需要处死种鼠后，小心地用消毒眼科剪刀镊子剥开腹部皮肤，注意不要弄破肌肉，然后，用镊子（最好是哪种前面有倒勾的镊子，学名好像是唇型镊）拎起腹部的肌肉，用剪刀剪开一个小口，然后用玻璃滴管或者去掉针头的注射器吸取腹水。然后进过一定的稀释后，接种到小鼠的腋下。关于稀释量，各个实验室的情况都不一样，最好摸索一下，开始的时候可以适当的计数，但是要用台盼兰染色后计活细胞数（计数的时候要注意，有一些很细小的细胞是血细胞，不要计数）。如果接种细胞量偏大会造成肿瘤早期就溃烂，所以不要为了追求肿瘤生长速度而一味的提高接种细胞量。接种部位在小鼠腋下，但是不要深入到腋窝里面，会给以后的操作带来

麻烦。可以往尾部或背部靠一些，不要往腹部靠，容易使肿瘤被垫料磨烂。接种部位可以选择腋下或者后肢,有的文章说是背部接种,但是背部血管不发达,营养不够,一般不建议采用.

接种时的进针处离接种处远一点，让针头在皮下多走一段，不容易污染。有的人接种的时候喜欢针头向上用力，紧贴着表皮往里走，然后注射的时候感觉阻力较大，打出来

的皮丘又紧又圆，这样的接种，会使肿瘤与皮肤严重粘连，不利于最后肿瘤的剥取。也不要紧靠肌肉，肿瘤会与肌肉严重粘连。应该在两者之间，接种的时候要精确控制接种在皮下，进针深度1.5cm左右, 针头沿皮肤水平进入,然后挑起表皮,注射。进针的感觉轻松自如，针头很自由，虽然打出来的肿瘤不会很圆很漂亮，但是相对好剥取一些。

防止接种的时候老鼠乱动，正确手法是用拇指和食指捏住老鼠的颈部皮肤，无名指和手掌下部把老鼠的后肢捏住，捏颈部的时候手指尽量多捏一点皮肤，然后右手（你是左手抓动物的话）拉住后肢，尽量往下拉，让老鼠的身体伸展开来，在用无名指固定，中指可以放在老鼠的身体下面，适当的往上顶，使老鼠的腋下一代完全平展，皮肤不用绷得太紧，平展就可以了，另外接种的时候进针点很靠下，针头在皮下走一段再注射，速度不要太快。注射前针头稍微动一动，能动就说明在皮下，否则可能在皮内或者肌肉内。一般

来说都是有鼓包的但是要是你接种位置太深入腋窝，你是看不到鼓包的。主要靠针头稍微动一动来判断。

4. 观测指标

主要是按时称体重，试验结束后剥取肿瘤称瘤重。因为出瘤已经是接种后的第6天左右了，第10天就结束时间，瘤体积的数据意义就不大。小鼠肿瘤很难剥，只能耐心，没有太好的办法，剥多了以后，手上会掌握一些巧力，有一些帮助，但是我们还是很头痛小鼠肿瘤试验结束。肿瘤组织周围经常会有一些血窦的形成，弄破后会有血和黄色的液体流出，正常的，但是剥瘤子的时候不要把它弄破，会严重影响瘤重。按照SFDA的规定，

平均瘤重小于1g，或者单个瘤重小于200mg，认为肿瘤生长不良，试验作废。

第二类是以lewis肺癌、B16为代表的，他们的宿主多为C57。不产生腹水，只能皮下生长。多用插块法或者匀浆法传代和接种。有一种做法也是接种后第二天开始给药，还有一种做法是接种三天后给药，接种后两周结束试验，剥取肿瘤称重。

1. 瘤种构建

体外细胞株，培养后PBS悬浮至1~3×106/0.1ml/site，接种至小鼠腋下，即可。

2. 传代与接种

体内瘤源用于传代接种，有两种手段（均为无菌操作），套管针插块法对瘤组织损伤小，可能100％成瘤。匀浆法对瘤组织损伤大，成瘤可能小于100％。

（1）插块法：种鼠处死后体表消毒，将肿瘤组织剥离下来后，置于在PBS或0.9%无菌

氯化钠注射液中洗涤干净，然后剪开，去处中心颜色变暗坏死部分，以及外表的包膜（如果比较明显的话），选外围发亮部分。清洗干净，然后换到干净的PBS中，用剪刀剪成

1mm直径左右的小块，最后用镊子将小块从针头处塞进18~20号的接种套管针（最好用

的是胸膜活检针20号，但是现在已经买不到了，可以用硬脊膜外穿刺针18号磨平针头后代替），在老鼠的皮肤上剪一小口，接种于动物腋下或者其他部位。塞的组织块的量以接种针头的口径为准，不能太紧也不能太松，以孔径为标尺，尽量保持差不多大小的接种量。如出现出针挂组织的问题，关键在于针头的磨制，在针后部的小突起于小缺口吻合后，实体针弯曲方向应该与套管针磨制的斜面一致，接种时，实体针要推到底，也就是后面的小突起与小缺口契合，然后针头“舔住”肌肉层转一圈再退针，还有就是瘤块一定要完全塞入针头内，外面不能有漏出来的。

（2）匀浆法：种鼠处死后体表消毒，将肿瘤组织剥离下来后，置于PBS等体系中（以下均以PBS为例），用剪刀剪开，剔出中心的坏死部分，以及外表的包膜（如果比较明显的话），清洗干净，然后换到干净的PBS中，用剪刀剪成1mm直径左右的小块，然后用玻璃匀浆器匀浆，注意上下次数不可超过5次，匀浆时可以适当的旋转，200目筛网过滤，然后取滤液用台盼兰活细胞计数，根据计数结果进行稀释，最后将组织悬液用注射器接种。最终的稀释量，需要根据你瘤株情况确定的接种量而定，这个接种量经过一段时间的稳定后，可以根据经验（匀浆液的浓度、粘度、肿瘤组织大小等情况）直接进行稀释，不需要计数，但是在早期，还是建议进行计数后再稀释。另外各种瘤株的情况不一样，不光是接种量不同，同样大小的瘤源匀浆后的活细胞数也会不同。比如NCI-H460匀浆后的活细胞数就比较多，而A431几乎没有活细胞。另外，如果一个瘤源不够，可以取多个瘤源进行接种，一般来说，插块法，一个瘤源接种30只动物是没有问题的，匀浆法一般2只也可以接种30只了，为保险起见可以多预备一只瘤源。注意考虑可能需要剔出不合格瘤源的情况。

最好不用带血清的培养液代替PBS，因为血清是异种蛋白，虽然裸鼠T细胞缺陷，但是B细胞和NK细胞完整，含血清的物质会引起裸鼠的免疫反应，连带着接种的瘤组织也会被影响，降低成瘤率和生长速度。从成瘤效果来说，无血清培养基>PBS>saline。

肿瘤模型体内传代的标准是，肿瘤体积大于500mm3以上就可以了，最好小于

1000mm3。

接种的动物数应该大于实际试验所需动物数，出瘤后要分组给药的时候淘汰掉未长出的、太大以及太小的肿瘤。然后再根据肿瘤体积随机分组。

3. 关于观测指标

可以在出瘤后测量瘤体积，但是主要还是考察瘤重。

第三类是以P388、L1210为代表的白血病模型。宿主为DBA2，也有人用C57与DBA2的F1代传代，DBA2用于试验，但实际两种宿主传代并没有什么区别。它们能形成腹水，一般不用于皮下接种试验，平时多用腹水传代，实验时多用腹腔接种或尾静脉接种考察生存时间。也是接种后第二天开始给药

腹水都是血性的。另外，腹水量也不多，有的时候可以先注射一到两毫升的PBS 后，再抽取。