目的基因的遗传转化

实验十目的基因的遗传转化

一、目的基因的表达载体构建

1. 实验目的

本实验以强化植物基因工程平台技能训练为目的，涵盖PCR分离克隆全长目的基因、Gateway 技术构建目的基因的表达载体、农杆菌介导目的基因的转化、转基因植株的驯化和移栽等系列实验。此外，还就如何利用新型的反向遗传学技术RNAi（RNA interfere，RNA 干涉）进行基因功能研究进行试验指导。为从事相关领域的科学研究奠定基础。

通过本实验，要求学生理解和掌握Gateway 技术构建目的基因的表达载体的基本原理和具体实验步骤。

2. 实验原理

利用高保真聚合酶，采用PCR方法在克隆基因两侧引入attB重组位点，然后将含有attB 位点的PCR产物与含有attp位点和Gateway BP Clonase混合，之后转化E. coli。在两对att 位点之间的位点特异性重组过程中产生一个融合载体，融合载体随即分解成两个分子，重组位点在结构上重新分配，目标基因进入新的载体骨架，通过筛选阳性克隆，获得此重组产物，称为“entry克隆”。在得到的entry克隆中目标基因位于att重组位点之间。将此重组产物与选定的Gateway载体和Gateway LR Clonase酶混合，在entry克隆中的attL位点间的序列取代表达（目标）载体的attR位点之间的序列即目标基因进入表达载体，形成表达（目标）克隆（图）。

Gateway技术构建植物表达载体原理

3. 仪器设备

微量取液器、制冰机、微型离心机、PCR仪、凝胶成像系统、毛细管自动测序仪、电子天平、高速冷冻离心机、振荡器、恒温金属浴、干燥箱、紫外分光光度计、电泳仪、-80 ℃冰箱、-20 ℃冰箱等。

4. 实验试剂

克隆全长基因，pDONR TM221 载体（Invitrogen，12535-019），目标载体（购自Invitrogen，

类型可选）。

（1）核酸和质粒提取试剂，测序试剂，T-vector，DNA片段回收试剂盒，Taq聚合酶，反转录试剂盒，DNA marker，氨苄青霉素，X-gal，IPTG等试剂的配方和购买公司见模块一中相应章节。

（2）BP Clonase TM Enzyme Mix（11789-013）*12、LR Clonase TM Enzyme Mix*13（11791-019）均购自Invirtrogen公司。

5. 实验方法

克隆含有B序列的目标基因：

（1）设计B序列引物，用于扩增带有B序列接头全长基因。

（2）利用上面第一组引物，进行PCR反应。

（3）以在全长基因上加入一半B序列的扩增产物为模板，进行第二次PCR反应，琼脂糖凝胶电泳检测。

（4）纯化含有B序列PCR产物（磁珠回收纯化法）。

（5）克隆产物与Ｔ载体的连接。连接产物的转化。

（6）阳性克隆的筛选及质粒提取。

（7）DNA序列测定。

BP反应：

（1）BP反应的目的在于将含有线性attB表达克隆或attB接头的PCR产物克隆到含有attP 的donor载体上以产生entry克隆。

attB-PCR 产物或线性attB表达克隆0.5 μL

pDONR221 1 μL

5ХBP Clonase TM Reaction Buffer 4 μL

TE Buffer（pH 8.0）10 μL

BP ClonaseTM enzyme mix 4 μL

Total 20 μL

25 ℃温育16 hr，之后向体系中加入2 μL蛋白酶K溶液，37 ℃温育10 min，以终止

BP反应。

（2）BP反应产物的转化。

（3）阳性克隆的鉴定。

LP反应：

（1）LR反应的目的在于将已经重组入entry载体的目标基因再克隆到表达（目标）载体，以产生表达（目标）克隆。

表达（目标）载体

1μL Entry clone （100-300 ng ）

1 μL

5ХLR Clonase TM Reaction Buffer 4 μL TE Buffer （pH 8.0） 10 μL LR Clonase TM enzyme mix 4 μL Total

20 μL

25 ℃温育16 hr ，之后向体系中加入2 μL 蛋白酶K 溶液，37 ℃温育10 min ，以终止LR 反应。

（2）LR 反应产物的转化。

（3）对阳性克隆可采用PCR 和酶切结合进行鉴定。EcoRV 酶切后电泳见左下图。重组质粒

图谱见右下图。

6. 注意事项

attB 上下游PCR 引物的设计在遵循引物设计原则的基础上，还必须满足以下条件： （1）5’末端具有4个G 残基。

（2）4个G 残基与25 bp 的AttB 1位点相连。 （3）至少有18-25 bp 的特异基因序列或模板序列。 （4）attB 上游引物位点末端连有T 残基。

（5）如果需要PCR 产物与N 末端标签框架结合，引物必须包括另外两个碱基，使得在AttB 1

区域保持正确的读码框。这两个碱基不能是GA 、AA 或AG ，以防形成终止密码子。 （6）对于下游引物而言，如果需要PCR 产物与C 末端标签框架结合，引物必须包括另外一个

碱基，使attB2区域保持正确的读码框。同时，任何存在于attB2位点和目的基因之间的 终止密码子必须被去除。如果不需要PCR 产物与C 末端标签框架结合，则克隆基因或引 物必须包含终止密码子。 7. 作业

（1）Gateway 技术原理是什么？

2000bp

1000 bp 750 bp 500 bp 250 bp 100 bp

816bp

M DREB1A

酶切电泳图

pH2GW7-DREB1A 重组质粒图谱

（2）载体上具备ccdB 基因的意义是什么？

二、愈伤组织的遗传转化及转基因植株的检测 1. 实验目的

掌握诱导水稻胚性愈伤组织方法；掌握农杆菌介导的遗传转化及转基因植株检测的原理及实验步骤。 2. 实验原理

农杆菌是普遍存在于土壤中的革兰氏阳性菌，它能在自然条件下感染大多数双子叶植物的受伤部位，并诱导产生冠瘿瘤或发状根。当农杆菌通过植物伤口进入细胞后，可将农杆菌细胞中的一段T-DNA 插入到植物基因组中，是一种天然的植物遗传转化体系。将目的基因插入到经过改造的T-DNA 区，借助农杆菌的感染实现外源基因向植物基因组的转移和整合，然后通过细胞和组织培养技术再生出转基因植株。近年来，农杆菌介导法广泛地应用在一些单子叶植物（尤其是水稻）的遗传转化中。

3. 仪器设备

机械脱壳机，50 mL 无菌试管（若干），灭菌培养皿，灭菌烧杯（若干），灭菌滤纸，灭菌镊子。灭菌滤纸、烧杯、镊子、吸水纸、无菌三角瓶、培养皿。 4. 实验试剂

（1）1.5 % 次氯酸钠消毒液。 （2）70 % 酒精，无菌水，蔗糖。

水稻愈伤组织遗传转化流程图

2-3周

种子(2N6)

农杆菌(AB ) OD 600=0.15-0.2

愈伤组织前培养(2N6)

（3）N6 Basal Salt mixture ：

（4）2,4-D （2,4-dichlorohenoxyacetic acid ），琼脂糖（Agarose type Ⅰ；sigma, A-6013）。 （5）琼脂糖。

（6）潮霉素（Hygromycin ）溶液 （50 mg/mL ）。 （7）乙酰丁香酮（AS ）溶液。 （8）农杆菌培养（AB ）母液。 （9）农杆菌悬浮液（AAI ）母液。 5. 实验方法

（1）诱导愈伤组织。

（2）培养农杆菌。用接菌环从农杆菌（PIG121）原液中蘸取少许菌液，在AB 培养基上划

线。28 ℃黑暗培养2-3 d 。配置AAI 培养基，调pH 至5.2。分装，每管100 mL ，高压灭菌，使用前加入10 μL/100 mL AS （乙酰丁香酮）。在无菌的试管中加入25 mL 含有AS 的AAI 培养基，收集步骤3中的农杆菌（用药匙刮取平板上的农杆菌），混匀，25 ℃黑暗条件下振荡培养2-3 hr 。测OD 600值。用加入AS 的AAI 培养基稀释菌液至OD 600= 0.15-0.2。

（3）侵染和共培养：取500 μL 菌液于1.5 mL 离心管中，4 ℃、4 000 rpm 条件下离心2 min ，

弃上清。用含200 μmol/L AS 的30 mL AAM 侵染液制成悬浮液（菌液OD 600的终浓度为0.01）；挑选一定大小的水稻愈伤组织，放入农杆菌悬浮液中侵染5 min ；取出愈伤组织，置于无菌的滤纸上沥干30-40 min ；将愈伤组织置于共培养培养基（N6-CO ）上，在25 ℃暗培养2.5-3 d 。 （4）选择性培养基的配制：

1000 × N6 维生素 1mL Glycine 2 g Nicotine acid 0.5 g Piridoxine HCl 0.5 g Thiamine HCl 1 g 定溶至

1 L

1000 × N6 维生素 1 mL Cassmino acids 0.3 g Proline 2.8 g 蔗糖 30 g 2,4-D 2 mg 定溶至

1 L

调pH到5.7，加入4.0 g Gelrite，高压灭菌。当培养基的温度下降到60 ℃时，加入Carbenicillin（500 mg/L）和Hygromycin（50 mg/L），混匀，倒平板。

（5）抗性愈伤组织的选择：取出愈伤组织，无菌水清洗5-6次，其间需不停地振荡。再用含500 mg/ L Carbenicillin的无菌水清洗1-2遍。最后置于无菌滤纸上沥干2 hr。凉干的愈伤组织转入选择性培养基上进行第一轮选择，30 ℃，3000 Lx光照条件下，培养

14 d。具有抗性的初始愈伤组织继代到选择性培养基上进行第二轮选择，30 ℃，3 000

Lx光照条件下培养，直到颗粒状抗性愈伤组织生成为止。

（6）配制再分化培养基（MS）：

Kinetin 2.0 mg/L

NAA 0.2 mg/L

Sorbitol 20 g/L

Sucrose 30 g/L

定溶至 1 L

定溶至1 L，调pH至5.7，加入4.0 g Gelrite，高压灭菌，当培养基的温度下降到60 ℃时，加入Carbenicillin（300 mg/L）和Hygromycin（40 mg/L），混匀，倒平板。

（7）配制生根培养基（1/2MS）：

Sucrose 10 g/L

N6 vitamins 5 mL

定溶至 1 L

调pH至5.7，加入4.0 g Gelrite，高压灭菌，当培养基的温度下降到60 ℃时，加入Carbenicillin（300 mg/L）和Hygromycin（50 mg/L），混匀，倒平板。

（8）抗性愈伤组织的诱导分化：挑取颜色鲜黄的抗性愈伤3-4颗，继代到含有分化培养基的培养皿或塑料广口瓶中，用封口膜封好，恒温培养室中分化培养15-30 d。

（9）生根培养：苗长至1 cm左右，转移到生根培养基中壮苗。

（10）转基因苗驯化和移栽：转基因苗从分化到移栽最短时间大约需要两个月左右。挑选分化较完好的试管苗，打开封口膜，加入适量蒸馏水或无菌水，炼苗3~7d，然后洗去琼脂，移栽到温室的土钵中，检测。

（11）转基因植株的筛选鉴定：PCR检测；Southern检测；Northern检测转入目的基因的表达。