微生物实验思考题参考答案及知识要点
二. 细菌的简单染色和革兰氏染色
1. 革兰氏染色中那一步是关键?为什么？你是如何操作的？
革兰氏染色的关键步骤是：乙醇脱色（是脱色时间）。如果脱色过度，革兰氏阳性菌也可被脱色而被误认为是革兰氏阴性菌；如脱色时间过短，革兰氏阴性菌也可被脱色而被误认为是革兰氏阳性菌。脱色时间的长短还受涂片的厚薄，脱色是玻片晃动的快慢及乙醇用量的多少等因素的影响，难以严格规定（脱色是应当控制速度，脱色时间一般为20—30s）。
2. 固定的目的之一是杀死菌体，这与自然死亡的菌体有何不同？
自然死亡的菌体本身已经部分自溶，结构已经改变。固定杀死细菌时细菌结构是保持死亡时的状态的。
3. 不经复染这一步能否区分革兰氏阳性菌和阴性菌？
能。在酒精脱色后，不被酒精脱色而保留紫色者为革兰氏阳性菌（G＋），被酒精脱色为革兰氏阴性菌。最后一步用番红染液复染，是为了让结果更清楚。
4. 涂片为什么要固定，固定适应注意什么问题？
a 杀死细菌并使菌体黏附与玻片上；
b 增加其对染料的亲和力。
固定时应注意：手持玻片，菌膜朝上，在微火过3次（手指触摸玻片反面，不烫手为宜），固定时应尽可能维持细胞原有形态，防止细胞膨胀或收缩。
三. 霉菌、放线菌的形态观察
1. 镜检时，如何区分基内菌丝与气生菌丝？
一般气生菌丝颜色较深，直生或分枝丝状，比基内菌丝粗；而基内菌丝色浅、发亮，可看到横隔膜，继而断裂成球状或杆状小体。
2. 显微镜下细菌放线菌酵母菌和霉菌的主要区别是什么？
放线菌与细菌需要在油镜下才能观察清楚，而霉菌和酵母菌在低倍镜下即可看到。
细菌：为细而短的单细胞微生物（个体微小），主要形态有：球、杆、螺旋状等。（部分杆菌还可形成芽孢）放线菌：存在分枝丝状体和菌丝体，革兰氏阳性菌，有孢子丝和孢子（球形、椭圆形、杆状、柱状）。
酵母菌：单细胞，菌体呈圆球、卵形或椭圆形，少数呈柠檬形、尖形等。菌体比细菌大几倍到几十倍，部分处于出芽繁殖过程中菌体还可观察到芽体，大多数菌体上还有芽痕。
霉菌：菌丝和孢子的宽度通常比细菌和放线菌粗得多，常是细菌菌体宽度的几倍到几十倍，在低倍镜下即可看到，并还可看到孢子囊梗、囊轴、孢子囊、包囊孢子等。
四. 玻璃器皿的洗涤、包扎与灭菌
1. 高压蒸汽灭菌开始时为什么要将锅内排尽？灭菌后为什么要待压力降低到“0”时，才能打开排气阀，开盖取物？
因为空气的膨胀压大于水蒸汽的膨胀压，所以，当水蒸汽中含有空气时，在同一压力下，含空气蒸汽的温度低于饱和蒸汽的温度。如果压力未降到0时，打开排气阀，就会因锅内压力突然下降，使容器内的培养基由于内外压力不平衡（压力突然下降而发生复沸腾）而冲出烧瓶口或试管口，造成培养基等液体沾湿棉塞或溢出等事故。
2. 设计实验方案，比较干热灭菌和湿热灭菌的效果。
以下试验方案有关操作均遵循无菌操作条件和等量原则。
（一）实验材料
试管镊子酒精灯嗜热脂肪芽孢杆菌 ATCC 7053 菌片纸片（与菌片同大小同材料）溴甲酚紫蛋白冻水培养基（已灭菌）等实验材料（材料有余）。
（二）对照组
取9支洁净试管，分为A1 B1 C1 三组（每3支一组），将A1 组中放入菌片，B1 组中放入纸片，C1组中什么也不加；不经灭菌，直接加入溴甲酚紫蛋白冻水培养基（等量）。
（三）恒为培养
将上述所有试管按分组在56℃恒温条件下培养48小时。
3. 为什么干热灭菌比湿热灭菌所需温度高时间长？
在湿热条件下，有水蒸汽的作用：
a高温水蒸汽导热比干空气要快；
b高温水蒸汽冷凝变水时有放热过程；
c高温水蒸汽能穿透细菌的细胞膜，直接进入细胞内破坏细胞；
c高温水蒸汽能水解一部分细胞结构，加速导热。
（湿热中细菌菌体吸收水分，蛋白质较易凝固，因蛋白质含水量增加，所需凝固温度降低；湿热的穿透力比干热大；湿热的蒸汽有潜热存在，每1克水在100℃时，由气态变为液态时可放出2．26kJ（千焦）的热量。这种潜热，能迅速提高被灭菌物体的温度，从而增加灭菌效力。）
五. 培养基的配置
1. 配制牛肉膏蛋白胨培养基，有哪些操作步骤？那几步易出错，如何防止？
称取药品—加热溶化—分装—加棉塞—包扎—灭菌—搁置斜面
易出错的步骤有：
a 称取药品称取时钥匙专用，瓶盖不要错盖，易吸水的药品要快速称取；
b 加热溶化加入药品后要用玻璃棒不停搅拌，以免糊底（在琼脂熔化过程中，应控制火力，以免培养基
因沸腾而溢出容器，同时，需不断搅拌，以防琼脂糊底烧焦。）；
c 分装分装时培养基不能粘在三角瓶（或试管）口，以免接种时染菌；
d 搁置斜面斜面长度约试管长度一半为宜。
2. 配制培养基的一般原则是什么？
a 目的明确
b 营养协调
c 理化适宜
d 经济节约
六. 平板菌落计数法
1. 平板菌落计数法的原理是什么? 它适用于那些微生物的计数？
平板菌落计数法是将等测样品经适当稀释后，其中的微生物充分分散为单个细胞，取一定量的稀释液接种到平板上，经过培养，由每个单细胞生长繁殖而形成的肉眼可见的菌落，即一个单菌落应代表原样品中的一个单细胞。统计菌落数，根据其稀释倍数和取样接种量即可换算出样品中的含菌数。（但是，由于待测样品往往不易完全分散成单个细胞，所以，长成的一个单菌落也可能来自样品中的2~3或更多个细胞。因此平板菌落计数的结果往往偏低。现在常使用菌落形成单位）。
平板计数法是根据微生物在固体培养基上所形成的一个菌落是由一个微生物繁殖而形成的现象进行的，也就是一个菌落可代表一种微生物（并不绝对)。通常用来测定样品中所含细菌、孢子、酵母菌等单细胞微生物的数量。
2. 菌落样液移入培养皿后，若不尽快地倒入培养基并充分摇匀，将会出现什么结果？为什么？
出现的结果是：形成菌落过于集中，不能形成均匀分布的单菌落，导致无法计数。
因为：若不立即摇匀，菌体常会吸附在皿底上，不易形成均匀分布的单菌落，从而影响计数的准确性。
3. 要获得本次试验的成功，那几步最为关键？为什么？
a 稀释菌液若在稀释时移液管混用可使稀释梯度不准确，从而导致计数误差（放菌液时吸管尖不要碰到液面，即每一支吸管只能接触一个稀释度的菌悬液，否则稀释不精确，结果误差大。）；
b 稀释倒平板 1 若再加入菌液不立即倒入培养基，可使菌体黏附于皿底；
2 若不注意培养基温度，温度过高会将菌体烧死，温度过低会使培养基一倒入立即凝固，从而菌体不能均匀分布；
3 倒入培养基需立即摇匀，否则菌体常会吸附在皿底上，不易形成均匀分布的单菌落，从而影响计数的准确性；
4 选择倒平板的稀释梯度也是很重要的，一般以三个连续稀释度中的第二个稀释度倒平板后所出现的平均菌落数在50个左右为宜，否则要适当增加（或减少）稀释度加以调整。
4.平板菌落计数法与显微镜直接计数法相比有何优缺点？
微生物显微镜直接计数法随机性大,所以对菌体数量不能做出较为宏观,全面的反应.显微镜直接计数
法一般与血球计数板配套使用.但显微镜直接计数法的优点是快速,观察到马上可以计数，而计的是相应微生物总数。
平板菌落计数法最大的缺点是速度慢,需要平板上长出菌落一段时间后才能计数.但是由于平板菌落计数法通常做梯度稀释,所以计数的线性范围大.由于是菌悬液涂布,所以比较均匀,能较好的反应菌落的疏密程度.重复性,平行性很好,而计的是活菌数。是经典的计数方法.
七. 显微镜直接计数法
1. 为何用血细胞计数板可计得样品总菌值？叙述其适用范围。
a 计数室体积一定；
b 在显微镜下，不经染色不能分辨菌体的死活，使计数所得的数目为一定体积内的总菌数，从而计得样品中总菌值。
适用范围：可单细胞存在的细菌酵母菌或显丝状生长的真菌，放线菌所生的孢子等。
2. 为什么计数室内不能有气泡？试分析产生气泡的可能原因。
a 气泡会占据计数室的空间，导致计数室中的菌体个数计数偏小，最后导致计数结果偏小。
b 计数室内的气泡，可影响菌液的随机分布，使计数产生误差。
产生气泡原因：a 操作不当，先放菌液再盖盖玻片；b 计数室洗涤不干净；c 盖玻片移动，造成空气进入而产生气泡。
3. 试分析影响本实验结果的误差来源及提出改进措施？
1、仪器误差：所用器材均应清洁干净，并且计数板计数区不应该有擦痕。
2、计数室内可能有气泡。因为酵母细胞并没有染色，看起来是透明的，有气泡很容易被计入，使数值偏高；并且，气泡会影响菌悬液的随机分布。改进：若产生气泡，则用吸水纸吸出。
3、菌体在计数板上分布不均，当用选取5格计数时，会造成很大误差。改进：应使菌液自然流入并混匀，进行观察时尽可能多数几个格子。
4、配制稀释液时吸取的浓度过高或过低，导致稀释液浓度和原液不成正确比例，计算时产生误差。应将原液摇晃均匀后取中部的液体进行稀释。
5、由于数菌体数目时视觉疲劳而导致的视觉误差。应多人观察，取记录平均数。
6、计数时可能将格四周的菌都计算在内了，使数值偏高。改进：谨遵一个规则，计上不计下，计左不计右，不可以重复计数。
7、可能出现有出芽的酵母菌，将出芽的酵母菌按两个计数了，使数值偏高。改进：计数时，只有当芽体于母细胞一样大的时候，才能计为两个。
8、微量移液器的最小量程太大，在加样时，容易加多，使盖玻片鼓起，血球计数板所技术的体积变大，最终结果偏大。改进：用量程的小的微量移液器并少加一些。
八. 微生物的纯培养技术
1. 如果一项科学研究内容需从自然界中筛选到能产生高温蛋白酶的菌株，你将如何完成？写出实验方案（产蛋白酶菌株在酪素平板上能形成降解酪素透明圈）。
以下试验方案有关操作均遵循无菌操作条件
一材料准备
1 土壤【有机质（特别是蛋白质）含量丰富的土壤】
2 灭菌生理盐水（0.85%NaCl）
3 灭菌移液管
4 添加酪素的B—4（牛肉膏蛋白胨完全培养基）经灭菌
5 B—4斜面（经灭菌）
6 其他材料：接种环酒精灯等
二操作方法
1在盛有10ml灭菌生理盐水的烧杯中添加1g土壤，配成悬浮液；
2 稍静止后，用灭菌移液管移取部分上清液，将其制成10^4—10^6倍的稀释液；
3 用灭菌移液管吸取各稀释液用稀释倒平板法（或涂布平板法）将其接入添加酪素的B—4平板上；
4 在55—65℃下培养1—2天；
5 挑取形成降解酪素透明圈的菌落（透明圈直径D与菌落直径d之比较大者），转接入B—4斜面上培养；（若无特定菌落形成，则需另取土样从开始重复试验）
6 将B—4斜面上的菌落再用平板纯培养，依次重复2—3次后即可得到纯培养（镜检）；
7 纯培养细菌中蛋白酶的提取及活性鉴定【摇瓶培养（若提取蛋白酶及其活性正常，则纯培养成功，否则，重取土样重复以上实验）】。
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