生化知识点部分总结

氨基酸和蛋白质

1，简述氨基酸及蛋白质的结构，蛋白质结构与功能的关系氨基酸基本结构：天然的，蛋白质中的氨基酸全是α氨基酸。22个氨基酸的侧链R基团不同，侧链决定他们的特性。

蛋白质结构：蛋白质的一级结构（primary structure）就是蛋白质多肽链中氨基酸残基的排列顺序（sequence），也是蛋白质最基本的结构。它是由基因上遗传密码的排列顺序所决定的。各种氨基酸按遗传密码的顺序，通过肽键连接起来，成为多肽链，故肽键是蛋白质结构中的主键。

二级结构：依靠不同氨基酸之间的C=O和N-H基团间的氢键形成的稳定结构，主要为α螺旋和β折叠，β回折或转角，和无规线团。

超二级结构：这些二级结构或许形成一个或大量的球形单元，这就是蛋白域

蛋白质模式（motifs）：指的是短的氨基酸序列能给蛋白质一个特定的功能。两个或三个具有二级结构的肽链，在空间上相互接近，形成一个特殊的空间构象，称为模体。模体是具有特殊功能的超二级结构。组合形式主要有三种：αα，ββ，βαβ。

三级结构：通过多个二级结构元素在三维空间的排列所形成的一个蛋白质分子的三维结构。主要化学键是疏水键，离子键，氢键和范德华力。

四级结构：不存在于所有蛋白质中，含有两条以上多肽链的蛋白质，用于描述由不同多肽链（亚基）间相互作用形成具有功能的蛋白质复合物分子。主要化学键是氢键和离子键。

蛋白质结构与功能的关系：蛋白质一级结构是高级结构与功能的基础。

蛋白质的功能依赖特定的空间结构。（一）血红蛋白亚基与肌红蛋白亚基结构相似，都含有血红素辅基。（二）血红蛋白亚基构象变化影响亚基与氧结合。协同效应：一个亚基与其配体结合后影响另一个亚基与其配体结合，如果促进为正协同，抑制为反协同。变构效应：空间结构改变，功能改变。（三）蛋白质构象改变可引起疾病。镰刀型细胞贫血症血红蛋白由谷氨酸变为缬氨酸，点突变引起结构改变

2，蛋白分离、纯化和鉴定的常用方法及其原理（包括各类电泳、层析、测序）。

盐析：高浓度的中性盐使蛋白质从溶液中沉淀出来，盐分子水化，夺走了蛋白质表面的水化层，蛋白质聚集沉淀。一般用硫酸铵分级盐析。

PI沉淀：正负电荷相平衡时的pH值，改变pH，重金属盐沉淀：pH>pI,促进酸性基团解离，带负电，因为此时蛋白质分子有较多的负离子易与重金属离子结合成盐。生物碱试剂与某些酸沉淀：促进碱性基团解离，带正电。

透析：利用透析袋将大分子蛋白质与小分子化合物分离开。

层析：待分离蛋白质溶液（流动相）经过一个固态物质（固定相）时，根据溶液中待分离的蛋白质颗粒大小、电荷多少及亲和力等，使待分离的蛋白质组分在两相中反复分配，并以不同的速度流经固定相而达到分离蛋白质的目的。

离子交换层析：利用各蛋白质的电荷量及性质不同进行分离。低盐结合，高盐洗涤。离子交换剂有阳离子交换剂(如：羧甲基纤维素;CM-纤维素)和阴离子交换剂(二乙氨基乙基纤维素;DEAE?FONT FACE="宋体" LANG="ZH-CN">纤维素)，当被分离的蛋白质溶液流经离子交换层析柱时，带有与离子交换剂相反电荷的蛋白质被吸附在离子交换剂上，随后用改变pH或离子强度办法将吸附的蛋白质洗脱下来。

凝胶过滤层析：又称分子筛层析，利用各蛋白质分子大小不同分离。洗脱时，大分子先出来，小分子后出来。柱中最常用的填充材料是葡萄糖凝胶(Sephadex gel)和琼脂糖凝胶(agarose gel)。

亲和层析：亲和层析是一种吸附层析，抗原（或抗体）和相应的抗体（或抗原）发生特异性结合，而这种结合在一定的条件下又是可逆的。所以将抗原（或抗体）固相化后，就可以使存在液相中的相应抗体（或抗原）选择性地结合在固相载体上，借以与液相中的其他蛋白质分开，达到分离提纯的目的。降低pH，结合的出来。

疏水相互作用层析：溶液中高离子强度可以增强蛋白质和多肽等生物大分子与疏水性层析介质之间的疏水作用。利用这个性质，在高离子强度下将待分离的样品吸附在疏水性层析介质上，然后线性或阶段降低离子强度选择性的将样品解吸。疏水性弱的物质，在较高离子强度的溶液时被洗脱下来，当离子强度降低时，疏水性强的物质才随后被洗脱下来。

电泳：各种蛋白质在同一pH条件下，因分子量和电荷数量不同而在电场中的迁移率不同而得以分开。

等电聚焦电泳，这是利用一种两性电解质作为载体，电泳时两性电解质形成一个由正极到负极逐渐增加的pH梯度，当带一定电荷的蛋白质在其中泳动时，到达各自等电点的pH位置就停止，此法可用于分析和制备各种蛋白质。

原态聚丙烯酰胺凝胶电泳，PAGE:具有酶活性，

SDS-PAGE（十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳）简称SDS-PAGE，原理：将蛋白质溶液与SDS（十二烷基硫酸钠）混合，SDS为界面活性剂会破坏蛋白质的二级结构使其变性，并包覆变性蛋白质，使其带有一致的负电荷（大约每两个氨基酸一个SDS）和一致的形状（长条形）仅取决于分子量大小分离。如果没有SDS使其负电荷一致，可能会使有相近分子量的蛋白质，分布于不同的位置，此种电泳法为原态胶体电泳（Native-PAGE）。进行电泳时，分子量较小的较容易落下，相反的分子量较大的则卡在起点附近。虽然较大的电压可以缩短实验的时间，却会得到较模糊的结果，因此实验长达数个小时。

蛋白浓度：双缩脲法，Lowry法,The Bradford Assay,UV吸光度。

分子量：Gel filtration，梯度SDS-PAGE，超高速离心法，由氨基酸序列计算分子量，质谱仪分析

蛋白序列测定：见ppt上。

酶

3.1 简述酶的基本特点，影响酶活性的因素

酶作为生物催化剂，加速达到平衡状态，但不会改变常数。通过减少过渡态的自由能来加速生化反应。酶促反应需要温和的条件，对底物具有高特异性，没活力能被调控，几乎所有的酶都是蛋白质。酶具有活性中心，是与底物结合催化发生的位置。

影响酶活性的因素：底物浓度，酶浓度，温度，pH

3.2如何判断可逆、不可逆抑制剂

加入抑制剂，酶上有巯基，透析，看能否去掉抑制剂，加入带有荧光的碘乙酰胺，如果是不可逆抑制剂，结合带有巯基的酶，巯基就不能与碘乙酰胺结合，跑胶后就不会有什么荧光，碘乙酰胺与巯基结合是不可逆的，如果酶与抑制剂结合是可逆的，则跑胶后可以看到荧光。

3.3酶动力学在研究抑制剂（如药物）作用机制中的应用。

竞争性抑制剂：某些抑制剂的化学结构与底物相似，因而能与底物竞争与酶活性中心结合。底物被排斥在反应中心之外。米氏常数变大，Vmax不变，与底物亲和力减小。可以通过增大底物浓度，来提高底物竞争力来消除。

举例；丙二酸是琥珀酸的结构类似物，可逆抑制琥珀酸脱氢酶活性。

乙醇作为竞争性底物可以抑制乙二醇氧化成乙醛的反应（乙醇可以治疗乙二醇中毒）

反竞争性抑制剂：某些抑制剂不与游离的酶结合，只与复合物结合，米氏常数和最大反应速度都变小。

举例：单底物酶：芳香基硫酸基的肼解，氰化物抑制芳香硫酸酯酶的作用。

多底物：如双底物乒乓机制中，任何一个底物的竞争性抑制剂也是另一底物的反竞争性抑制剂。

非竞争性抑制剂：抑制剂在酶的活性部位以外的部位与酶结合，不对底物与酶的活性产生竞争。结合抑制剂后，构象改变，影响活性中心的结构，使他不能有效的发挥功能。最大反应速度降低，米氏常数不变。抑制剂对底物与酶的结合无影响，所以底物浓度对抑制程度无影响。

蛋白质的合成、转运、修饰及相互作用

4.1 简述蛋白质合成、转运、修饰

从mRNA起始密码子到终止密码子之间的核苷酸序列称为开放阅读框架（ORF）。

遗传学将编码一个多肽的遗传单位称为顺反子，原核细胞中数个结构基因常串联为一个转录单位，转录生成的mRNA可编码几种功能相关的蛋白质，为多顺反子。真核mRNA只编码一种蛋白质，为单顺反子。

遗传密码包含64个密码子，起始密码子：AUG,终止密码子：UAA,UAG,UGA.

摆动配对：tRNA上反密码子的第一位碱基与mRNA密码子的第三位碱基配对时，有时并不严格遵循碱基配对规律。

原核生物核糖体：小亚基上mRNA结合部位，大亚基上有A,P,E位。

tRNA：运载氨基酸，一种氨基酸可有几种对应的tRNA,氨基酸结合在tRNA3‘-CCA的位置，结合需要ATP供能。

氨基酰-tRNA合成酶：催化氨基酸的活化，需要能量。转肽酶：催化核蛋白体P位上的肽酰基转移至A位氨基酰-tRNA的氨基上，使酰基与氨基结合形成肽键；并受释放因子的作用后发生变构，表现出酯酶的水解活性，使P位上的肽链与tRNA分离。

转位酶：催化核糖体向mRNA3’端移动一个密码子的距离，使下一个密码子定位于A位。

合成过程：1，生成氨基酰tRNA，消耗一分子的ATP，两分子的高能磷酸键。2，原核生物中有met-tRNA fmet的甲酰化反应，通过转甲酰基酶催化，识别mRNA的起始密码子AUG，翻译起始复合物。3，起始：原核生物mRNA在核糖体小亚基上的准确定位和结合涉及两种机制：在起始密码子上游5‘存在富含嘌呤的碱基，称为SD序列，又称核糖体结合位点（RBS)，小亚基中的16S-rRNA 3’端有富含嘧啶碱基的短序列，通过与SD序列碱基互补而使mRNA 与小亚基结合,mRNA序列上紧接SD序列后的小核苷酸序列，可被核蛋白体小亚基蛋白rpS-1识别并结合。起始氨基酰tRNA结合到小亚基上，核糖体大亚基结合，起始复合物形成。起始因子：IF-1，占据A位防止结合其他tRNA。IF-2，促进起始tRNA 与小亚基结合，会消耗一分子GTP,一个高能磷酸键。IF-3，促进大小亚基分离，提高P位对结合起始tRNA的敏感性。4，延长：进位，氨基酰-tRNA按照mRNA模板的指令进入并结合到核糖体A位的过程。进位需要延长因子EF-Tu与EF-Ts参与，EF-Ts主要是调节EF-Tu的活化。消耗一分子GTP，

成肽，在转肽酶的催化下，核糖体P位上起始氨基酰tRNA携带的起始甲硫氨基酸转移至A 位并与A位上的氨基酸氨基结合形成肽键的过程。转位，在转位酶的催化下，核糖体向mRNA 的3’端移动一个密码子的距离，使下一个密码子进入核蛋白体的A位，而占据A位的肽酰-tRNA移入P位的过程。需要延长因子EF-G参与。EF-G有转位酶活性，可以结合并水解一分子GTP，释放的能量促进核糖体向mRNA的3’端移动，使起始二肽酰-tRNA-mRNA相对位移进入核糖体P位。