疟疾诊断方法研究进展

?综述?疟疾诊断方法研究进展

于丹综述,江钢锋审校

中图分类号:R531.3

文献标识码:A

文章编号:1671-5039(2006)06-0022-04

疟疾是一种严重危害人类健康的热带传染病,世界上超过40%的人生活在疟疾疫区,全球每年约有3～5亿人患病,接近3百万人死于疟疾[1]。及时、准确的诊断对有效治疗疟疾及控制其流行具有重要意义。低原虫血症和混合感染使传统的疟疾诊断方法不能适应现代疟疾监控的要求,一些对传统方法的改进及新的诊断技术应运而生。目前,疟疾诊断方法主要分3类:一是以传统的镜检法为基础的病原学诊断,通过增加血样中的原虫数目、改进染色方法或两者结合来提高检测效率,如荧光染色技术等;二是上世纪70年代发展起来的免疫学诊断方法,如间接荧光抗体法、酶联免疫吸附法等,其中免疫层析技术因其快速、简便等特点已成为疟疾诊断的研究热点;三是上世纪80年代兴起的分子生物学诊断方法,通过检测疟原虫种、株特异性的基因片段来确定疟原虫感染,如基因探针和PCR技术等。下面从这三个方面对近年来国内外疟疾诊断方法的研究进展作简要概述。

1　病原学诊断

镜检法理论上可检出4个疟原虫/μL血,有经验的检验员能检出50个原虫/μL血[2]。该法费时、费力,对低原虫血症和混合感染容易漏诊、误诊,但因操作简单、经济实用,仍是基层单位检测疟疾的主要手段。荧光染色技术是由细胞浓集技术和荧光染色法结合发展而成的,如吖啶橙包被的毛细管法(quantitative buffy coat technique,QBC)、苯并硫羧基嘌呤(benz othi ocarboxy purine,BCP)染色法等。QBC 法阳性检出率高,敏感性、特异性分别可达9316%和9814%,但价格昂贵,需要特殊仪器设备,操作繁琐,虫种鉴别及原虫计数困难,不能长期保存。改进滤光系统建立的吖啶橙(acridine orange,AO)染色法可在普通的光学显微镜上使用,敏感性、特异性接近QBC法,但染色无特异性,虫种鉴别困难。BCP 法染色鲜亮,一些常见的干扰物不显荧光,对恶性疟和间日疟病人检测的敏感性分别为9714%和9112%,特异性分别为6617%和50%,但需要特殊光源的显微镜。

病原学检验方法尚没有很大突破,无法满足快速准确诊断的需要,如何提高荧光染色技术在低原虫血症时的敏感性,降低成本是该方法必须解决的问题。

2　免疫学诊断

免疫诊断的靶抗原主要有富组氨酸蛋白22(his2 tidine2rich p r otein22,HRP22)、疟原虫乳酸脱氢酶(p las modium lactate dehydr ogenase,pLDH)、疟原虫谷氨酸脱氢酶(p las modium gluta mate dehydr ogenase, pG DH)等。依照标记和检测系统的不同可分为:间接荧光抗体法(indirect fluorescent antibody test,I F2 AT)、酶联免疫吸附试验(enzy me linked i m munos or2 bent assay,E L I S A)、免疫层析技术等。

2.1　I FAT法

该法在抗原与待测血清结合后加入荧光标记的抗免疫球蛋白抗体进行检测,具有较好的敏感性、特异性和重复性。但有一定主观性,标本无法保存,需荧光显微镜,且只有高滴度I F AT才适用于无症状带虫者的确定和临床诊断[3]。

2.2　EL I SA法

该法以酶标记的抗原或抗体与黏附在载体上相应的抗体或抗原结合,再与酶底物作用,根据底物显色深浅定性、定量检测抗原和抗体。该方法敏感性好、特异性强、稳定性高。由其衍生出的斑点EL I S A (Dot2E L I S A)、生物素2亲和素E L I S A(ABC2E L I S A)、酶联金黄色葡萄球菌A蛋白EL I S A等一系列方法也具有良好的应用前景。通过基因工程技术合成针对不同抗原多个表位的融合抗体应用于E L I S A有望建立高特异性、高敏感性的新一代检测试剂盒。

作者单位:广东药学院寄生虫教研室,广东广州510006

2.3　免疫层析技术

免疫层析技术基于双抗夹心原理,根据待测血样通过检测线时的颜色反应来判断是否有疟原虫感染。该方法无须贵重仪器,操作简便易学,可直接读取结果,使快速诊断成为可能。以下根据不同的待检抗原对该方法作简要介绍。

2.3.1　HRP22抗原检测　ParaSight2F浸条法和快速免疫色谱测试法(i m munochr omat ographic test, I CT)是近年来应用较多的2种检测疟原虫HRP22抗原的方法。ParaSight2F只能检测恶性疟,而I CT 法还可检测间日疟及混合感染。当原虫密度>100个原虫/μL血时ParaSight2F的敏感性和特异性分别为77%～98%和83%～98%[2],低于这个值时容易出现假阴性。对非恶性疟和血中仅含成熟配子体的恶性疟病例容易漏检。病人血中残留的HRP22抗原和类风湿因子(rheu mat oid fact or,RF)容易导致假阳性。I CT法检测恶性疟的敏感性和特异性分别为9515%～100%和8415%～100%。对间日疟的检测水平稍低,敏感性为9014%～9418%,特异性为75%[4]。另外,ME I J I等[5]将I CT方法用于对鼠模的检测表明I CT的敏感性依赖于感染的阶段和感染期的长短,即血液中累积的抗原数量;但另外一些试验表明I CT条带的深浅同原虫密度高低无关[6]。当RF存在时,I CT方法也会出现假阳性,并且假阳性率随着RF滴度的增加而升高[7]。

一些新研制的试剂盒也同样有很好的检测效果:Makr omed浸条法在对恶性疟的检验中以镜检为标准,敏感性、特异性分别为9819%和9215%,以PCR为标准时分别为97%和96%,阳性、阴性预测值为8112%和9215%[8]。MALAR2CHECK T M试纸条的敏感性为9714%,在高滴度RF患者中无假阳性结果[9]。NOW I CT试剂盒以PCR为标准敏感性分别为恶性疟9515%、间日疟8617%、卵形疟和三日疟6115%,特异性为9817%。对恶性疟的阳性、阴性预测率分别为8918%和9717%,当原虫密度低于100个恶性疟/μL血和1000个间日疟/μL 血时敏感性分别下降到75%和55%[10]。我国学者自行研制的ACON Malaria胶体金试剂盒对恶性疟检测的敏感性、特异性可达到100%,对恶性疟和间日疟混合感染检测的敏感性为95%。虽然同样存在由残留HRP22抗原引起的假阳性率高的问题,但价格上与进口试剂盒相比具有优势[11]。

2.3.2　LDH抗原检测　Op ti M AL法有较好的敏感性(89%～100%)和特异性(67%～100%)[12,13],并对镜检易误诊的巴贝西虫(Babesia s p.)呈阴性反应[14]。当RF存在时Op ti M AL方法的假阳性率低于I CT方法(0103%∶26132%),可能与检测抗原不同有关[7]。此外,Op ti M AL法可反映药物治疗后原虫数量的下降,检测同种和异种疟原虫的重复感染及疟疾的复燃,还可鉴别虫体死活[15],但进口试剂盒价格昂贵。

吴英松等[16]建立的快速免疫胶体金层析法(GI CA)在对恶性疟的检测中以镜检和PCR为标准,敏感性分别为88137%和86167%,特异性分别为95165%和97173%,与镜检法的阳性符合率为91155%。但当虫体密度<50个/μL血时,敏感性降低到60%。刘玉冰等[17]建立的快速电泳法试剂盒和快速薄层色谱法试剂盒可检出至少10～12个虫/μL血和25～35个虫/μL血,阳性检出率恶性疟分别为90100%和80100%,间日疟分别为83133%和76167%。

2.3.3　G DH抗原的检测　G DH以其独特的物理化学性质成为疟疾诊断新的候选分子,我国学者建立的G DH胶体金层析法敏感性、特异性可达86167%和96143%,与镜检的符合率为94171%[18]。

免疫层析技术是一类可以快速、批量检测疟疾的诊断方法;且操作简便,易于判断结果,便于携带、保存、运输,无须贵重仪器设备,适于在偏远地区使用,有望成为自测试纸。如何降低试剂盒的成本,排除残留抗原和RF等对检测结果的影响,提高低原虫血症的检出率成为今后研究的一个重点。

3　分子生物学诊断

分子生物学诊断方法主要分为DNA探针技术和PCR技术两大类,常用的靶基因有环子孢子抗原(CSP)基因、小亚单位核糖体核糖核酸(SS U r RNA)基因等。

3.1　D NA探针技术

该方法主要在探针的来源及标记物的选择上有所不同,敏感性、特异性、镜检的阳性符合率均可达到90%,至少可检出01001%的原虫血症。但因为操作繁复、同位素污染等原因应用较少。张锦海等[19]采用基因芯片技术诊断间日疟、恶性疟及混合感染,特异性强,敏感性高,至少可检出10个间日疟原虫/μL血和5个恶性疟原虫/μL血。

3.2　PCR方法

PCR技术因其高度的敏感性、特异性以及对虫种、虫株的鉴别力逐渐取代镜检法成为疟疾诊断的“金标准”,套式PCR等方法可进一步提高诊断的敏

感性和准确性。但PCR方法仍费力耗时,需要多次试验确定混合感染。如何在一次反应中检测多个虫种、虫株、甚至基因型成为近年来研究的热点。反转录PCR(RT2PCR)、复式PCR、实时PCR(real2ti m e PCR)等方法不同程度上满足了这些需要。

3.2.1　套式PCR　应用内、外2对引物扩增疟原虫基因组DNA,通过扩增片段长短或酶切图谱来判断感染的虫种、虫株。套式PCR对间日疟和恶性疟检测的敏感度分别达到011个虫/μL血和115个虫/μL血,与镜检的阳性符合率为100%[20]。

3.2.2　复式PCR　采用疟原虫种、属特异性引物经一次扩增同时检测2种甚至多种疟原虫及混合感染,敏感度达到1个恶性疟/μL血和10个间日疟/μL血,避免了重复操作,节省成本及时间一半以上[21]。刘佩娜等[22]应用套式2复式PCR扩增SS U r DNA可同时检测4种人疟原虫。黄天谊等[23]将套式2多重PCR、等位特异PCR与标签引物(tag p ri m er)扩增技术相结合,检验恶性疟及间日疟CSP 不同基因型的灵敏度可达1～2个恶性疟原虫/μL 血和5～10个间日疟原虫/μL血,与套式PCR的符合率达到100%,且在低原虫密度和混合感染的情况下敏感性更优。

3.2.3　Real2ti m e PCR　PERAND I N等[24]采用Re2 al2ti m e PCR检测恶性疟、间日疟和卵形疟,以套式PCR为标准,敏感性和特异性均达到100%,同测序结果一致。MANG OLD等[25]用该法检测4种人疟原虫的敏感度可达0101%～0102%,与镜检的阳性符合率为9714%。Real A rtMalaria LC A ssay试剂盒可同时检出4种人疟原虫,敏感性、特异性达到9915%和100%,阳性、阴性预测率为100%和9916%[26]。

3.2.4　其他PCR方法　胡锡敏等[27]采用RT2PCR 技术扩增疟原虫SS U r RNA基因在同一反应体系中同时检测恶性疟和间日疟,敏感度达0134个虫体/μL血,高于PCR方法,与镜检的阳性符合率分别为97196%和93175%,特异性好。江晓玲等[28]采用荧光定量PCR(F Q2PCR)检测恶性疟,原虫率为1×10-5时仍可检出,敏感性、特异性、阳性检出率均超过了镜检和普通PCR,而且定量结果准确、可信,重复性高。URDANET A等[29]扩增恶性疟原虫高度重复亚端粒序列后与非放射性标记的探针杂交,阳性检出率为75%,与镜检法(44%)相比r值为117∶1,在混合感染中r值可提高到215∶1,明显优于镜检法,适用于恶性疟流行区经常出现低原虫血症和无症状患者的检测。微滴度板杂交实验(m icr otiter p late hybridizati on)应用生物素标记4种人疟原虫共有引物对未知样品进行扩增,再在疟原虫种特异性基因探针包被的酶标板内进行杂交及显色实验,可在诊断同时进行种属鉴定,并可检出混合感染,与镜检的阳性符合率为80%。MCNAMARA等[30]建立的复式PCR2连接酶反应对恶性疟、间日疟和卵形疟的敏感度分别可达到01000002%和0100001%。该方法同聚合酶链式反应-序列特意寡核苷酸探针杂交(PCR2SS OPH)方法的符合率为78131%,敏感性更高。阳性检出率高于镜检,完全符合率为37%,部分符合率为1619%。

4　诊断方法比较

近年发展起来的一些疟疾诊断方法结果不稳定,有些方面不尽人意,是否能替代镜检法成为主要的疟疾诊断方法仍受到怀疑。国内外有许多不同方法检验效果比较的研究:MOCKE NHAUPT等[31]和SI N GER等[32]在比较了镜检、快速诊断法(分别为I CT和makr omed malaria rap id test)、PCR三种方法检测胎盘疟疾患者的优劣后都认为RDT和PCR的检测结果较为接近,敏感性均高于镜检法;SI N GER 等还指出RDT的特异性低于镜检法。在PCR方法和Op ti M AL方法用于对胎盘疟疾患者的检验中显示PCR方法无论在对外周血还是对胎盘的检测中其敏感性(94%和72%)都明显高于Op ti M AL方法(71%和38%),而阳性检出率高于镜检[33]。

综上所述,近年来疟疾诊断方法研究的重点在免疫学和分子生物学方面:PCR技术敏感、特异,优于其他方法,尤其Real2ti m e PCR技术可定量检测疟疾,结果由机器读取减少了主观干扰。PCR方法已逐渐成为疟疾诊断的标准,适于医疗设备条件好、技术人员充足的医院,但世界上疟疾流行区主要集中在亚、非、拉相对落后的国家和地区,我国疟疾多发地区也都集中在西南偏远地区,因此PCR技术在基层单位的推广将面临很大困难。同样,尽管免疫层析技术快速、灵敏、简便,使试验室外的自我测试成为可能,但进口试剂盒的高成本限制了其广泛应用。我国学者自行研制的一些免疫检测试剂盒虽然现阶段看来检测效果不及进口试剂盒,但随着进一步的研究开发将有巨大的发展潜力,且低廉的价格适于我国国情,有很好的应用前景。

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(收稿日期:2006-07-21)

(本文编辑:袁华晖)