冬虫夏草菌丝体发酵液中多糖的分离纯化与含量测定_徐增龙
中
药
研
究
3 讨论
本方法提取测柴胡皂苷a、d简便快捷,分离度较好,方法学研究表明本方法稳定可靠,可以作为柴
胡药材中柴胡皂苷a、d的含量测定方法。
南柴胡和北柴胡药材中柴胡皂苷含量差异悬殊,以北柴胡中含量较高。相同品种柴胡因产地不同皂苷
含量也有较大差异,含量高低相差十几倍至几十倍之
多,以湖南、陕西、甘肃产的北柴胡和四川产的南柴胡
含量较高。为保证药用柴胡的质量,急需在《中国药典》中规范柴胡药材中皂苷类成分的含量。
参考文献:
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(收稿日期 2007203222)
冬虫夏草菌丝体发酵液中多糖的分离纯化与含量测定
徐增龙 张如松
浙江中医药大学药学院 杭州 310053
摘要:[目的]从冬虫夏草菌丝体发酵液中提取,分离虫草多糖,并建立样品中多糖的含量测定方法。[方法]采用D101大孔树脂分离冬虫夏草菌丝体发酵液中的多糖;采用苯酚-硫酸法测定样品中多糖含量。[结果]虫草多糖的得率为1412g/L;样品中虫草多糖的含量为7016%。[结论]方法简便,准确,重现性好,可用于冬虫夏草菌丝体发酵液中虫草多糖的提取纯化和含量测定。关键词:冬虫夏草菌丝体发酵液;多糖;大孔树脂;分离纯化;含量测定
中图分类号:R28515 文献标识码:A文章编号:100525509(2007)0320376202
Separation,Purif ication and Content T est of Polysaccharide in Z ymotic Fluid of Cordycepts Mycelium Xu Zenglong,Zhang Rusong Pharmacological I nstit ute of Zhej iang Chinese Medical Universit y,H angz hou(310053)
Abstract:[Objective]To extract and separate polysaccharide f rom Cordycep s mycelium,and establish content test method of pol2 ysaccharide in sample.[Method]Take foramen magnum resin D101to separate polysaccharide f rom the zymotic fluid of Cordyceps mycelium,the phenol-SO2method to measure polysaccharide in sample.[Result]The receiving rate of polysaccha2 ride was14.2g/L;the content was70.6%from sample.[Conclusion]The said method is simple,convenient,correct,can be used for separation,purification and content measurement of polysaccharide from the zymotic fluid of Cordycep s mycelium.
K ey w ords:zymotic fluid of Cordyceps mycelium;polysaccharide;foramen magnum resin;separation and purification;content measurement
冬虫夏草(Cordycep s)为麦角菌科真菌冬虫夏草菌Cordycep s sinensis(Berk.)Sacc.寄生在蝙蝠蛾科昆虫幼虫上的子座及幼虫尸体的复合体,是高级滋补药品和名贵中药材。随着它的药用价值不断增大和药用范围的不断扩大,对虫草的需求量也在不断的增加。但是,由于天然虫草严格的寄生性及生长环境的特殊,且因人为因素的破坏,导致产量急剧下降,远远不能满足市场的需求。因此,从20世纪70年代起,人类就开始利用现代生物发酵技术培育虫草菌丝体[1]来代替天然虫草,但是,目前对虫草菌丝体发酵液的开发利用,国内外还是鲜有报道。
大孔吸附树脂是20世纪60年代发展起来的新型精制方法[2]。它是一种不含交换基团,具有大孔结构的高分子材料。自从问世以来,已在环保、化工、医药等领域[3]得到广泛利用。本研究采用D101大孔吸附树脂从虫草菌丝体发酵液中分离虫草多糖,且用苯酚-硫酸法测定了样品中多糖的含量,结果表明:本方法操作简单,结果准确,重现性好,为进一步的研究开发提供了依据。
1 仪器、材料、试剂与样品
111 仪器与材料 TD5A2WS台式低速离心机(长沙湘仪离心机仪器有限公司);754型紫外分光光度计(上海精密仪器有限公司);D101大孔吸附树脂(天津制胶厂)。
浙江中医药大学学报2007年5月第31卷第3期
徐增龙,等: 冬虫夏草菌丝体发酵液中多糖的分离纯化与含量测定112 试剂 D 2葡糖糖(中国药品生物制品鉴定所,批号110833-200503),乙醇,氯仿,正丁醇,苯酚,硫酸等(均为分析纯)。113 样品 冬虫夏草菌丝体发酵液由浙江万丰集团制药有限公司提供。2 方法与结果211 虫草粗多糖的提取 取虫草菌丝体发酵液7310mL ,用80%乙醇沉淀3次,室温下放置24h ,离心15min (3000r/min ),弃去上清液,取沉淀物,减压干燥,得粗多糖2119g 。212 虫草粗多糖纯化 取上述粗多糖2119g ,加水66mL 溶解,取水溶液,采用sevag 法[4](1/5体积的氯仿,及1/5体积的正丁醇,剧烈震荡,静置分层后,过滤,取水层)去除蛋白质,操作3次后,将水层减压蒸干,用95%乙醇、丙酮、乙醚依次洗涤粗多糖,减压干燥,得纯化粗多糖1814g 。213 虫草多糖精制21311 树脂预处理[5] 取市售D101大孔吸附树脂,用乙醇加热回流洗涤,至洗脱液蒸干后无残留物,反复洗脱保存备用。21312 装柱 以乙醇湿法装柱,用纯乙醇反复洗脱,至洗脱液与水混合不呈白色混浊为止(取1mL 乙醇液加5mL 水),再以蒸馏水洗脱至洗脱液无醇味,备用。21313 精制 将纯化的粗多糖溶解(上样量∶树脂量=1∶8～10)加到已处理好的D101大孔吸附树脂柱上,先用水洗脱至洗脱液无色,流速约为1mL/min ,再用5倍量柱体积的30%乙醇、5倍量柱体积的50%乙醇洗脱,流速约为1mL/min ,分别收集洗脱液。最后用95%乙醇洗脱至树脂无色,备用。斐林反应[6]表明:多糖主要集中在水洗脱部位,浓缩水洗脱液后得到精制多糖1104g ,得率为1412g/L 。214 样品中虫草多糖的含量测定21411 对照品溶液的制备 取于105℃干燥至恒重的葡糖糖对照品25010mg ,精密称定,置500mL 容量瓶中,加水溶解并稀释至刻度,摇匀,得015mg/mL 的葡萄糖对照品溶液。21412 标准曲线的制备 精密量取对照溶液210ml 、410ml 、610ml 、810ml 、1010ml 于50ml 量瓶中,加水至刻度,摇匀。分别精密吸取以上对照品溶液110ml 于10ml 试管中,加5%苯酚[7]试液110ml ,摇匀,迅速加浓硫酸510ml ,振摇2min ,置沸水浴中加热30min 后,取出冷却至室温。另量取110ml 蒸馏水按上述方法操作,作为空白对照。在490nm 波长处分别测定吸光度,以吸光度值A 为纵坐标,葡糖糖浓度C 为横坐标,进行线性回归,得回归方程为A =010077C -010002,r =019971
21413 样品测定 取虫草多糖样品6410mg ,精密称定,置1000ml 容量瓶中,加水稀释至刻度,摇匀。精密量取样品溶液110ml ,照标准曲线制备项下的方法,制备样品供试液,在490nm 波长处测定样品吸光度(n =3),并计算样品中多糖含量,结果样品中多糖以葡糖糖计含量为7016%。
3 讨论
本研究用的发酵液中含有单糖、二糖等成分,在选用醇沉条件的过程中,我们考察了三种乙醇浓度分别为65%、80%和95%进行沉淀,结果表明:用80%乙醇沉淀3次后,单糖、二糖等干扰成分能够去除最完全,而且对多糖含量不影响。
蛋白质是在多糖沉淀中的主要杂质之一。根据文献报道[9],目前去除方法有盐析法、等电点沉淀法、加热变性法、有机溶剂变性萃取法、膜过滤法。本实验采用sevag 法去除蛋白,和其他几种方法比较,具有操作简单、省时,并得到良好的效果。在考察上样量和树脂比例的过程中,我们结合比上柱量、比吸附量及比洗脱量等评价指标,进行了3个比例的比较,分别为1:5、1:10和1:15。结果表明:在上样量和树脂比例为1:10的时候,多糖的纯化效果最佳,树脂的使用效率最大。苯酚-硫酸比色法测定虫草多糖的原理是多糖在浓硫酸的作用下,先水解为单糖,迅速脱水形成糠醛衍生物,然后与苯酚缩合为有色化合物,在490nm 处有特征吸收。本法简单,显色稳定,灵敏度高,重现性好。
参考文献:
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量测定[J ].时珍国医国药,2005,16(10):962.(收稿日期 2007203217)
浙江中医药大学学报2007年5月第31卷第3期
冬虫夏草菌丝体的深层培养
中图分类号：Q93；文献标识码：A ；文章篇号:1007-2764(2003)04-0012-04 冬虫夏草菌丝体的深层培养 陆幼兰 (广州珠江啤酒股份有限公司 广州 510308) 摘 要:本文研究了冬虫夏草的深层培养的培养基、培养条件、工艺流程及所需的设备，并比较了天然冬虫夏草与此方法培养的菌丝成份。采用深层培养虫草菌丝体能大批量生产虫草菌丝体，其分离出的物质有效成份与天然冬虫夏草的成份相同，二者的药理、药效极其相似，能保证筛选用药的物质来源，缓解虫草资源的紧张状况。 关键词：冬虫夏草；深层培养；提取 我们的祖先很早就掌握了利用真菌进行酿酒的技术，并发现许多真菌不仅可以食用，味道鲜美，而且还可以入药，虫草的发现和利用最具代表性。虫草具有明显的滋补作用，传说中具有“起死回生”的功效。考古学家从殷代末期和秦朝的文物中发现贵族死者的随葬品内有口含的刻有蝉浮雕的青玉平板状饰品，以及一些有僵蚕图案的佩带。根据当时的民间传说和后人详细的考证，认为这些饰品很可能是古人用来祈福余荫的信物，蝉在当时是指一种可药用的真菌蝉草（corclgceps sobolifera）的寄主，僵蚕则是白僵菌（beauveria bassiana)的寄主，可见我国古人对菌与虫的关系已经有了相当深入的认识。 虫草菌绝大多数寄生在昆虫体内。虫草菌生活具有明显的地区性和周期性，多见于春、秋两季，一般分布在高山绝顶和雪线上，或较为寒冷的北方地区，热带地区有时偶有虫草踪迹。虫草生命力强，对环境适应幅度大，可以寄生的昆虫种类较多，其寄生的昆虫大部分以植物的叶、根为食，所以在森林和草甸中虫草发生最多。由于分布广泛，虫草在不同的地区有不同的名称，例如：四川称冬虫夏草为虫草，而云南称虫草，甘肃称冬虫草，西藏称雅杂滚卜，在我国其它地区也有把冬虫夏草叫做春虫夏草，等等。 虫草是一类珍贵药材，我国古代就对它的药用价值有深刻的认识。吴仪洛所著《本草从新》指出，冬虫夏草具有“保肺益肾，止血化淤”的药用功效。由于各类虫草（特别是冬虫夏草）的滋补治疗效果显著，赵学敏的《本草纲目拾遗》便干脆把虫草类的药用归之为“能治百虚百损”一句话。 现代研究表明，虫草具有重要的食用、药用和其它经济价值，虫草中含有丰富的虫草酸、虫草素及各收稿日期：2003-8-16 类氨基酸等营养物质，具有扩张气管、镇静、抗各类细菌、降血压的功效。近年来，美、日本等国相继报道虫草具有提高人体抑止肿瘤能力，能加强人体排异作用。解放后我国也对食用菌和虫草的人工引种、驯化、栽培、遗传、应用等方面进行了很多研究。 目前我国虫草培养大部分是人工栽培培养，由于受地理环境、气侯、水土及虫草品种等各方面的自然条件影响，虫草的质量和产量极不稳定，难于实现规模产业化。采用深层发酵生产虫草菌丝体，一方面很容易从培养液中分离和提取出各种有效成份物质，提取虫草酸、虫草素、虫草多糖等有用物质和具有抗癌作用的冬虫夏草素及多种氨基酸，大批量生产虫草菌丝体；另一方面利用５t~１０t甚至更大容积的发酵罐内培养，能够提高产量，保证筛选用药的物质来源，缓解虫草资源的紧张状况。本文研究了虫草的深层发酵方法，发现此方法培养的虫草成品与虫草菌丝体均含有相同的物质成份，同时二者的药理、药效也极其相似，具有广阔的应用前景。 1 材料 1.1 冬虫夏草[corelyceps sinsensis (bers) sacc]：采自甘肃甘南草原。 虫夏草的组织分离采用组织分离法，即采用直接切取虫草的子座部分或菌核部分的一小块组织，经表面消毒和灭菌水洗后，在无菌操作条件下，由虫草体上转移到培养基上。切取组织１mm左右，组织切取过大会增加染菌的机会，组织切取过小，一方面在表面消毒过程中易将该组织杀死，另一方面也相应地延长了虫草菌种的生长时间。 工序：取春夏之交的新鲜冬虫夏草的子座→0.1％L汞液表面消毒５min→无菌水反复冲洗→无菌条件 12
植物多糖分离纯化
食品分离技术作业 姓名_______________ 院系_______________ 专业班级_______________ 学号_______________ 时间___年___月___日
摘要 本文简要地介绍了植物多糖提取的两种方法：溶液提取法和部分沉淀法，对于影响多糖提取的不同因子选取不同方法；从多个方面介绍了多糖提取后的分离、纯化方法，及其分离纯化原理和主要步骤，并在最后对分离方法的可行性做出评价。 关键词：植物多糖分离纯化溶剂提取法部分沉淀法 植物多糖的分离纯化 一、多糖的物化性质 A.分子结构：多糖在溶液状态下有着高级结构，代表活性状态。不同植物提取的多糖， 一级结构上有很太差异，采用酸解、色谱、质谱、红外光谱、核磁共振等手段，可以确定单糖的组成及取代基团。 B.溶解性：难溶于冷水，在热水或碱液中可溶。不溶于丙酮、乙醇、正丁酵、乙醚、醋 酸乙酯等有机溶剂 C.热稳定性：热不稳定，当温度大于4O℃时，分解加快。 D.酸碱稳定性：pH小于5时开始降解，小于3时有20％降解；大于7时氧化加快。 E.化学性质：与硫酸蒽酮、硫酸苯酚反应阳性，常用于定量分析；可与部分有机、无机 离子络合，如与十六烷基三溴化铵(CTAB)、氢氧化钡等结合沉淀 F. 二、植物多糖的提取 多糖不同的植物中，有着不同的含量和贮存位置，因此针对不同的植物有着不同的分离方法。 图1:不同植物中多糖的提取方法
A.溶剂提取法 a)水提法 水对植物组织的穿透力强，提取效率高，在生产上使用安全、经济。用水作溶剂来提取多糖时，可以用热水浸煮提取，也可以用冷水浸提。一般植物多糖提取采用热水浸提法，该法所得多糖提取液可直接或离心除去小溶物；或者利用多糖不溶于高浓度乙醇的性质，沉淀提纯多糖；但由于不同性质或不同相对分子质量的多糖沉淀所需乙醇浓度不同，它也可以用于样品中不同多糖组分的分级分离；还可按多糖不同性质在粗分阶段利用混合溶剂提取法对植物中不同的多糖进行分离；其中，以乙醇沉淀最为普遍。但以根茎为主的植物体,细胞壁多糖含量高,热水直接提取率不高。此时为破坏细胞壁,增加多糖的溶出，有两种处理方法:一为酶解,二为弱碱溶解。 图2：加水比对多糖提取的影响[1] b)酸碱提法[2] 有些多糖适合用稀酸提取，并且能得到更高的提取率。但酸提法只在一些特定的植物多糖提取中占有优势，目前报道的并不多。而且即使有优势，在操作上还应严格控制酸度，因为酸性条件下可能引起多糖中糖苷键的断裂。 有些多糖在碱液中有更高的提取率，尤其是提取含有糖醛酸的多糖及酸性多糖。采用的稀碱多位为0．1mol／L氢氧化钠、氢氧化钾，为防止多糖降解，常通以氮气或加入硼氢化钠或硼氢化钾。同样，碱提优势也是因多糖类的不同而异。与酸提类似，碱提中碱的浓度也应得到有效控制，因为有些多糖在碱性较强时会水解。另外，稀酸、稀碱提取液应迅速中和或迅速透析，浓缩与醇析而获得多糖沉淀。 图3：热碱提取多糖结果[3] c)生物酶提取法[4] 酶技术是近年来广泛应用到有效成份提取中的一项生物技术，在多糖的提取过程中，使用酶可降低提取条件，在比较温和的条件中分解植物组织，加速多糖的释放或提取。此外，使用酶还可分解提取液中淀粉、果胶、蛋白质等的产物，常用的酶有蛋白酶，纤维素酶，果胶酶等。 B.部分沉淀法 a)金属盐沉淀法
虫草菌丝体发酵的研究进展
虫草菌丝体发酵的研究进展 摘要：虫草具有良好的药用和保健价值，国内外对于虫草的需求与日俱增。但是天然虫草生长环境特殊，产量有限，近年来的过度采挖严重降低了虫草的产量，破坏了产地的生态环境。人们希望通过掌握虫草的人工栽培和液体发酵技术来解决这个问题。本文介绍了近年来有关虫草深层发酵条件、发酵产品活性成分和发酵功能用途的研究。 关键字：虫草发酵条件活性成分 虫草的子实体、菌核及菌丝体中都含有多种活性成分，如虫草多糖、胆甾醇、真菌甾醇、麦角甾醇、腺嘌呤核苷、腺嘌呤、尿嘧啶、蛋白质、多种氨基酸、硬脂酸、软脂酸、D-甘露醇、维生素、有机酸和微量元素。但是野生虫草资源短缺，人工栽培周期长、成本高，而利用虫草深层发酵生产虫草替代品，既可有效保护虫草这一珍贵资源，又不受气候、地理环境和虫草寄生条件严格的限制，适合于工业化大规模生产，生产出的替代品如菌丝体其成分和药效也与天然虫草相似。现在许多科研人员和生产厂家正在从人工培养着手，利用液体深层培养技术进行工业化生产虫草菌丝希望能解决虫草大规模人工栽培的缺点，以求得更好的社会和经济效益。 1虫草菌丝体液体发酵条件的研究： 目前国内外报道的虫草菌有几十种，其中以蛹虫草菌和冬虫夏草菌在生产栽培上最为常用。国内对虫草胞外多糖、虫草素的研究一直十分活跃，因为它们具有十分重要的药用和保健价值。但是针对不同的发酵条件，虫草的多糖含量、虫草素含量和生物量等指标都有较大不同。蛹虫草作为虫生真菌，一般认为动物蛋白对其菌丝体生长发育更为有利，但温鲁等（2008）研究发现植物蛋白豆粕和豆粉也适合蛹虫草的生长发育，现在大多数研究都是以蛋白胨作为氮源。但是，王菊凤等（2009）认为不管是植物蛋白还是动物蛋白，都应该有一定的适宜浓度，她发现1% 低浓度的氮能促进菌丝体的生长，也有利于多糖的合成，随着氮浓度的增高，菌丝体生物量和多糖的含量也随之降低。 王菊凤等（2009）发现在6%的碳源和1%的氮源以及25℃的条件下，能获得蛹虫草的最大生物量以及总多糖和胞外多糖的最大产量；碳源为6%、氮源为1%、温度为22℃时，胞内多糖的产量达到最高。廖春丽等（2009）在优化蛹虫草产胞外多糖发酵培养基时使用蔗糖2.00%，蛋白胨1.50%，KH2PO40.05%，酵母粉0.20%，硫酸镁0.01%，在pH值6.8，温度28℃时蛹虫草胞外多糖得率为19.4 g/L。 对于蛹虫草菌丝体的最佳生长条件，赵雪梅等（2008）通过实验证明泰山蛹虫草菌丝体液体发酵中最佳碳氮比在3.0到4.0之间；最佳培养基配比为玉米粉3.0%、葡萄糖1.5%、黄豆粉1.0%、酵母膏0.8%，菌丝体的最大生长量平均在1.29g/100ml。 针对虫草素最优发酵条件的研究，郑婷婷（2004）发现蛹虫草菌丝体液体发酵的最适条件为：接种量10%(v/v)，发酵初始pH7.0，发酵温度27℃，发酵时间96 h。扩大培养后，测得菌丝体中虫草素的含量为51.785 mg/100g，虫草精多糖含量为1.92 g/100g。 文庭池等（2009）认为腺苷作为虫草菌素的直接前体，腺嘌呤能有效地提高虫草菌素产量，它能迅速有效的被蛹虫草吸收与利用。刘艳芳（2010）的研究也认为腺嘌呤和腺苷均可以明显提高虫草素的产量，两种化合物在虫草素的合成中发挥的作用基本相同，而且细胞吸收利用腺嘌呤的速度比利用腺苷的速度快，在同样的添加浓度下，腺嘌呤比腺苷更有利于虫草素的合成，在培养基中加入0.5g/L的腺嘌呤可使发酵液中虫草素含量提高约30%。 刘小莉等（2008）通过实验发现蛹虫草菌株能适应较宽的pH值范围，在pH值2~11
多糖的分离纯化及生理作用
多糖的分离纯化及生理作用 多糖包括植物多糖、动物多糖和微生物多糖。人们已发现多糖不仅是机体的能量来源和骨架成分，而月还具有多糖具有抗感染、抗放射、抗凝血、降血糖、降血脂、促进核酸与蛋白质的生物合成作用等多种生物活性。 多糖的提取和纯化 1. 多糖的提取 1.1 热水浸提法：其步骤为：原料→粉碎→脱脂→粗提（2－3次）→吸滤或离心→沉淀→洗涤→干燥 首先除去表面脂肪。原料经粉碎后加入甲醇、乙醚、乙醇、丙酮或1：1的乙醇乙醚混合液，水浴加热搅拌或回流1－3小时，脱脂后过滤得到的残渣一般用水作溶剂（也有用氢氧化钾碱性水液、氯化钠水液、1％醋酸和1％苯酚或0.1－1M氢氧化钠作为提取溶剂）提取多糖。温度控制在90－100℃，搅拌4－6小时，反复提取2－3次。得到的多糖提取液大多较粘稠，可进行吸滤。也可用离心法将不溶性杂质除去，将滤液或上清液混合（得到的多糖若为碱性则需要中和）。然后浓缩，再加入2－5倍低级醇（甲醇或乙醇）沉淀多糖；也可加入费林氏溶液或硫酸铵或溴化十六烷基三甲基铵等，与多糖物质结合生成不溶性络合物或盐类沉淀。然后依次用乙醇、丙酮和乙醚洗涤。将洗干后疏松的多糖迅速转入装有五氧化二磷和氢氧化钠的真空干燥器中减压干燥（若沉淀的多糖为胶状或具粘着性时，可直接冷冻干燥）,干燥后可得粉末状的粗多糖。 1.2 微波辅助提取法： 其原理为利用不同极性的介质对微波能的不同吸收程度，使基体物质中的某些区域和萃取体系中的某些组分被选择性加热，从而使萃取物质从基体或体系中分离出来，进入到介电常数小，微波吸收能力较差的萃取剂中。由于微波能极大加速细胞壁的破裂，因而应用于中草药中有效成分的提取能极大加快提取速度，增加提取产率。而且由于其选择性好，提取后基体能保持良好的性状，提取液也较一般的提取方法澄清。聂金源等在柴胡多糖和黄酮化合物的提取[18]中对微波辅助提取法、超声辅助法和索氏提取法进行比较，发现微波辅助提取法所需时间最短（10min），多糖的提取率最高（28.46％）。 1.3 超声辅助法： 其原理是利用超声波的空化作用加速植物有效成分的浸出提取，另外超声波的次级效应，如机械振动、乳化、扩散、击碎、化学效应等也能加速欲提取成分的扩散释放并充分与溶剂混合，利于提取[16]。超声波辅助法与常规提取法相比，具有提取时间短、产率高、无需加热等优点[17]。 1.4 索氏提取法： 将植物粉末置于索氏提取器中，加入石油醚，60℃-90℃条件下提取至无色（一般为6小时）。过滤，滤渣挥发干燥完溶媒后加入80%乙醇，再提取6小时，过滤，滤渣乙醇挥发干燥后加蒸馏水。回流提取2次，趁热过滤，滤液减压浓缩，再除蛋白，醇沉，除色素。60℃干燥，称重。 1.5 醇提法： 先后将90%和50%乙醇加入植物粉末中，振荡充分再抽滤。滤液中加入足量无水乙醇，至于4℃冰箱中过夜。减压抽滤，再除去色素，得多糖粗品，在60℃通风干燥箱中干燥，再置干燥皿中恒重保存。 醇提法方法简单，易于操作，但提取率较低，乙醇使用量大，不宜大规模提取使用。 2.多糖的纯化方法纯化是将多糖混合物分离为单一多糖的过程，纯化的方法主要有以下几种： 2.1 分部沉淀法根据各种多糖在不同浓度的低级醇或丙酮中具有不同溶解度的性质，逐次按比例由小到大加入甲醇或乙醇或丙酮，收集不同浓度下析出的沉淀，经反复溶解与沉淀后，直到测得的物理常数恒定（最常用的是比旋光度测定或电泳检查）。这种方法适合于分离各种溶解度相差较大的多糖。为
多糖的提取分离方法
1.多糖的提取方法 生物活性多糖主要有真菌多糖、植物多糖、动物多糖3 大类。多糖的提取首先要根据多糖的存在形式及提取部位，决定在提取之前是否做预处理。动物多糖和微生物多糖多有脂质包围，一般需要先加入丙酮、乙醚、乙醇或乙醇乙醚的混合液进行回流脱脂，释放多糖。植物多糖提取时需注意一些含脂较高的根、茎、叶、花、果及种子类，在提取前，应先用低极性的有机溶剂对原料进行脱脂预处理，目前多糖的提取方法主要有溶剂提取法、生物提取法、强化提取法等。1．1溶剂法 1．1．1水提醇沉法 水提醇沉法是提取多糖最常用的一种方法。多糖是极性大分子化合物，提取时应选择 水、醇等极性强的溶剂。用水作溶剂来提取多糖时，可以用热水浸煮提取，也可以用冷水浸提渗滤，然后将提取液浓缩后，在浓缩液中加乙醇，使其最终体积分数达到70 %左右，利用多糖不溶于乙醇的性质，使多糖从提取液中沉淀出来，室温静置 5 h，多糖的质量分数和得率均较高。影响多糖提取率的因素有：水的用量、提取温度、浸提固液比、提取时间以及提取次数等。 水提醇沉法提取多糖不需特殊设备，生产工艺成本低，安全，适合工业化大生产，是一种可取的提取方法。但由于水的极性大，容易把蛋白质、苷类等水溶性的成分浸提出来，从而使提取液存放时腐败变质，为后续的分离带来困难，且该法提取比较耗时，提取率也不高。 1．1．2酸提法 为了提高多糖的提取率，在水提醇沉法的基础上发展了酸提取法。如某些含葡萄糖醛酸等酸性基团的多糖在较低pH 值下难以溶解，可用乙酸或盐酸使提取液成酸性，再加乙醇使多糖沉淀析出，也可加入铜盐等生成不溶性络合物或盐类沉淀而析出。 由于H＋的存在抑制了酸性杂质的溶出，稀酸提取法提取得到的多糖产品纯度相对较高，但在酸性条件下可能引起多糖中糖苷键的断裂，且酸会对容器造成腐蚀，除弱酸外，一般不宜采用。因此酸提法也存在一定的不足之处。 1．1．3碱提法 多糖在碱性溶液中稳定，碱有利于酸性多糖的浸出，可提高多糖的收率，缩短提取时间，但提取液中含有其它杂质，使粘度过大，过滤困难，且浸提液有较浓的碱味，溶液颜色呈黄色，这样会影响成品的风味和色泽。 1．1．4超临界流体萃取法 超临界流体萃取技术是近年来发展起来的一种新的提取分离技术。超临界流 体是指物质处于临界温度和临界压力以上时的状态，这种流体兼有液体和气体的特点，密度大，粘稠度小，有极高的溶解，渗透到提取材料的基质中，发挥非常有效的萃取功能。而且这种溶解能力随着压力的升高而增大，提取结束后，再通过减压将其释放出来，具有保持有效成分的活性和无溶剂残留等优点。由于CO2的超临界条件（TC＝304．6 ℃，Tp＝7．38 MPa）容易达到，常用于超临界萃取的溶剂，在压力为8～40 MPa 时的超临界CO2足以溶解任何非极性、中极性化合物，在加入改性剂后则可溶解极性化物。 该法的缺点是设备复杂，运行成本高，提取范围有限。 1．2酶解法 1．2．1单一酶解法 单一酶解法指的是使用一种酶来提取多糖，从而提高提取率的生物技术。其中经常使 用的酶有蛋白酶、纤维素酶等。蛋白酶对植物细胞中游离的蛋白质具有分解作用，使其结构变得松散；蛋白酶还会使糖蛋白和蛋白聚糖中游离的蛋白质水解，降低它们对原料的结合力，有利于多糖的浸出。
多糖分离纯化的基本原则和方法
多糖分离纯化的基本原则和方法 多聚糖(polysaccharide)，简称多糖，常由一百个以上甚至几千个单糖基通过糖苷键连接而成的，其性质已大不同于单糖，如甜味和强的还原性已经消失，广泛存在于动物细胞膜和植物、微生物的细胞壁中，是构成生命的四大基本物质之一，与生命功能的维持密切相关。近年来，大量研究表明多糖除了有增强免疫功能、抗肿瘤作用、抗氧化、抗衰老、消化系统保护作用的生物学效应外，还有抗菌、抗病毒、降血糖、降血脂、抗辐射、抗凝血等作用。 1、基本原则 在不破坏多糖活性的前提下进行多糖的分离纯化。尽量不引入新的杂质，或引入的新杂志易于除去，如小分子盐类可经过透析作用除去，铵根离子可通过加热挥发除去等[1]。 2、分离纯化方法 多糖的生物活性倍受关注，但不少多糖的提取方法和工艺尚未成熟，基于效率、成本多方面的考虑，各种方法的开发、比较、分析是研究工作的焦点之一。目前多糖提取方法主要有溶剂提取法、酸提法、碱提法、酶解法、超滤法、超声法、微波法、超临界流体萃取法。首先要根据多糖的存在形式及提取部位不同，决定在提取之前是否做预处理：提取时需注意对一些含脂较高的根、茎、叶、花、果及种子类，在用水提取前，应先加入甲醇或l：l的乙醇乙醚混合溶液或石油醚进行脱脂，而对含色素较高的根、茎、叶、果实类，需进行脱色处理。 2.1多糖的提取与分离方法 由于各类多糖的性质及来源不同，所以提取方法也各有所异，主要归纳为以下几类： 第一类难溶于水，可溶于稀碱液的主要是胶类，如木聚糖及半乳糖等。原料粉碎后用0.5mol/L NaOH水溶液提取，提取液经中和及浓缩等步骤，最后加入乙醇，即得粗糖沉淀物。 第二类易溶于温水，难溶于冷水的多糖，可用70~80℃热水提取，提取液用氯仿：正丁醇（4:1）混合除去蛋白质，经透析、浓缩后再加入乙醇即得粗多糖产物[2]。 第三类粘多糖的提取。在组织中，粘多糖与蛋白质以共价键结合，故提取
四种人工冬虫夏草制剂说明及比较
附一：至灵胶囊药品说明书（旧版） 批准文号：（93）晋卫药准字12-085 冬虫夏草（Cordyceps）为麦角菌科植物冬虫夏草（Cordycepssisensis (Berk) Sacc）的子座及其寄主蝙蝠蛾昆虫幼虫的复合体，是我国传统名贵野生药材中的一种真菌类生药。历来本草记载，它具有补虚损、益精气、补肺益肾、止咳化痰等功效。古代医家称为治疗“诸虚百损至灵上品”并视为高级平温型滋补药品。由于药效上乘，药源稀少，价格昂贵，所以限制使用。 至灵胶囊是从采自川藏高原4000 米以上灌丛草甸中的新鲜冬虫夏草分离出的一种真菌，经纯化，培养和先进的生物工程技术而制成的菌丝体。内含虫草菌素、虫草多糖、麦角甾醇、甘露醇和十九种氨基酸，以及锌、锰、钙等多种微量元素，与天然冬虫夏草在化学成份、实验药理和临床疗效等方面十分相似，可与天然冬虫夏草相媲美，故取名“至灵胶囊”。 本品能提高肿瘤放、化疗病人的细胞免疫功能，改善机体迟发性变态反应，避免放、化疗对病人免疫抑制，防止肿瘤病人在放、化疗期间的白细胞下降并对白细胞下降者有提升作用。改善病人眠食减少，乏力出汗等虚弱症状。 本品具补虚损、益肾保精的功效，有助于填补脏腑阴常不足，调节失调的阴阳，故对慢性肾功能衰竭、慢性肾炎有明显疗效。对高血压病、动脉粥样硬化（冠状动脉硬化和肾动脉硬化）症，可使肾功能、血脂、尿蛋白得到改善，胆固醇降低。浮肿、心悸气短、腹胀、尿少等症状明显好转。 本品能有效地抑制单胺氧化酶活性。因单胺氧化酶活性随年龄增长而加强，造成机体的生物化学损害，也是造成衰老的原因之一。本品可改善中老年人单胺氧化酶系统，调节机体各种功能，同时丰富的微量元素可改善骨质疏松、智力、记忆力衰退症状，延缓衰老，增加寿命。 本品有显著扩张支气管作用。通过舒张支气管平滑肌和提高免疫机能消除痰咳喘炎，故对劳咳痰血、肺结核及慢性支气管炎有较好疗效。 本品对男女更年期出现的神经及内分泌腺功能紊乱等综合症有良好作用，使疲乏、面部潮红、心悸失眠、头晕头痛、腰肢酸痛、面部和下肢浮肿、性欲消失等症状明显改善。 本品具有雄性激素样作用，能提高性腺功能，对命门火衰、精气虚寒所致的阳萎滑精有明显改善作用，使滑精次数减少、阳萎消除，性欲恢复。对原发性不孕症也有较好效果。本品对于心脑血管疾病、肝炎、肝硬化也有良好的治疗和保健作用。 本品无任何副作用，男女老少均可服用，对中老年人服用尤佳。不仅可作治疗药品，还可作为病愈康复、预防疾病、日常保健的一种免疫滋补保健品。 成份：每粒内含至灵菌丝（冬虫夏草菌丝）250mg。 用法与用量：口服一日3 次，每次2～4 粒或遵医嘱，2～3 个月为一疗程。 附二：百令胶囊使用说明书（旧版）
枸杞多糖分离纯化及性质研究
第25卷 第3期 2008年6月 黑龙江大学自然科学学报JOURNAL OF NAT URAL SC I E NCE OF HE I L ONGJ I A NG UN I V ERSI TY Vol 125No 13 June,2008 枸杞多糖分离纯化及性质研究 张 晶1,2, 韩喜江1, 李艳波2 (1.哈尔滨工业大学化学系,哈尔滨150001;2.哈尔滨学院生化学院,哈尔滨150080) 摘 要:对东北枸杞中提取的多糖,通过DEAE -cellul ose (OH -)色谱柱和Sephadex G -100 凝胶色谱柱进行了分离纯化,通过凝胶色谱和液相色谱对其纯度进行了鉴定,并通过红外光谱初步分析了其基团构成。 关键词:枸杞多糖;分离纯化;纯度鉴定 中图分类号:R28412,TS244文献标志码:A 文章编号:1001-7011(2008)03-0377-04 收稿日期:2008-01-16 作者简介:张 晶(1973-),女,实验师,硕士,主要研究方向:应用化学、食品化学 0 引 言 枸杞是一种食药两用植物,具有多种药理作用和生理功能。枸杞多糖是枸杞中的主要活性成分之一,其中有关枸杞多糖的化学、药理与临床研究十分瞩目,已有不少研究报道枸杞多糖具有增强免疫力、抗癌、防衰 老、抗疲劳、降血压、降血糖、抑制肿瘤生长和细胞突变等作用[1-2]。鉴于枸杞多糖具有多种药理作用和生理 功能,因此,对其提取分离方法及纯化的研究显得尤为重要[3]。本文重点对牡丹江地区枸杞多糖的分离纯 化及组成结构作了初步探讨。 1 实验材料和方法 111 材料与仪器 牡丹江地区枸杞子;其它试剂均为分析纯。自动部分收集器,台式干燥箱,紫外分光光度计,Perkin -El 2mer 红外光谱仪,Aglilent 1100液相色谱仪等。 112 枸杞多糖提取 称取100g 枸杞子60℃烘干,放置干燥器18h 后粉碎,称取10g 干燥的枸杞粉,用氯仿-甲醇(2∶1)300mL,用索氏回流装置于60℃回流脱脂。残渣风干后,加入适量水,在100℃,料水比1∶15条件下水浴提取4h,抽滤,将滤液蒸发浓缩为原体积的1/4后,将浓缩液滴入3倍体积的95%乙醇中,静置,抽滤,固形物 分别用95%乙醇、无水乙醇、丙酮洗涤,水浴加热干燥得枸杞粗多糖[4]。 113 枸杞多糖分离纯化 11311 DEAE -cellul ose (OH -)色谱柱层析 将分离提取的枸杞粗多糖110g 溶于水,上DEAE -cellul ose (OH -)色谱柱,梯度洗脱法洗脱各级分,洗 脱液分别为蒸馏水、011mo1?L -1,0125mol ?L -1和015mol ?L -1NaCl,011mol ?L -1Na OH 各100mL,流 速为30滴每分钟,自动部分收集器收集洗脱液,将收集到的样品溶液分别在280nm 波长下比色,然后用硫 酸一蒽酮法测定总糖含量。以试管数目为横坐标,以吸光度为纵坐标作DE AE -cellul ose (OH -)色谱柱洗脱 曲线图。分别合并各主峰溶液,浓缩,流水透析,冷冻干燥,得LBP -1,LBP -2,LBP -3和LBP -4.11312 Sephadex G -100凝胶色谱柱。 收集多糖含量最多的组分,进行凝胶色谱分离。流速为013mL ?m in -1,每支试管接收3mL 洗脱液,硫 酸一蒽酮法检测多糖洗脱状况。以洗脱管数为横坐标,吸光值为纵坐标作流出曲线,合并主峰溶液,浓缩,流水透析,冷冻干燥。
冬虫夏草
冬虫夏草的化学成分及药理作用 王东 摘要：冬虫夏草是我国传统的名贵中药，药用真菌。目前已弄清的成分有虫草多糖、蛋白质和氨基酸、D-甘露醇、脂肪和脂肪酸、虫草素和生物碱、抗菌活性物质、微量元素、免疫抑制剂等。传统中医认为冬虫夏草有补益功效，具有免疫调节、抗肿瘤、降血糖。抗氧化等多种药理作用。文章就近年来冬虫夏草的研究趋势进行了总结。 关键词：冬虫夏草；化学成分；药理作用 冬虫夏草，又名虫草。全世界目前已有虫草属真菌Cordycept寄生于昆虫和其他生物长出子座的虫草种类达400多种。把凡是由虫草属真菌寄生并能产生子座的菌物结合体统称“冬虫夏草”。平常所说的冬虫夏草，是特指我国青藏高原蝙蝠蛾属、虫草蝙蝠蛾的幼虫被虫草属真菌的子囊孢子感染而形成的虫、菌结合体。 冬虫夏草性温、味甘；入肺、肾经；能补肺益肾、止血化痰，用于久咳虚喘、劳嗽咯血、阳痿遗精、腰膝酸痛。现代科学证实冬虫夏草对人体有抗肿瘤，降血压、调节内分泌、增强免疫力、镇静中枢、抗心肌缺血及调节心率等功能。 1.冬虫夏草的化学成分 冬虫夏草内含碳水化合物28.9%，粗蛋白25.32%，粗纤维18.55%，水分10.84%，脂肪8.4%，灰分4.1%。下面介绍其发挥生理活性或药效的主要成分： 1.1核苷类物质 为冬虫夏草有效成分之一其中包括腺嘌呤、鸟苷、尿苷等【1】。虫草的核苷类物质中，研究最广泛的就是虫草素【2】。1951年，由加拿大学者Cunningham等从虫草的培养物中分离得到冬虫夏草素。刘静明等从我国长春蛹冬虫夏草菌丝中分离得到腺苷、腺嘌呤和冬虫夏草素，其中腺嘌呤和冬虫夏草素首次从菌丝体中分离得到。 1.2多糖类成分 1936年Shear发现了多糖的抗肿瘤活性，多糖是一种广泛存在于动物细胞膜、高等植物及微生物细胞壁中的多聚化合物【2】。俞丽露等证明虫草多糖可增强巨噬能力，姚思宇等证明培育虫草多糖具有降血脂效果。杜梅等证明其还能提高机体免疫功能，增加人体胰岛素的分泌，降低糖尿病人的血糖水平【4】。 1.3甾醇、糖醇类成分 20世纪80年代，我国学者从冬虫夏草中已分离出麦角甾醇。麦角甾醇过氧化物、麦角甾醇-B-D吡喃葡萄糖苷、2,2-二羟基麦角甾醇、β-谷甾醇、D-甘露醇和蕈糖。肖永庆等【5】还从冬虫夏草的乙醚提取物中分离的得到胆甾醇软脂酸脂。 1.4氨基酸成分 冬虫夏草含粗蛋白为25.47%，同时含有天门冬、苏、丝、谷、脯、甘、蛋、异亮、缬、亮、苯丙、酪、赖、组、胱、半胱、精、色等18种氨基酸，其中以谷氨酸、精氨酸、天冬氨酸、亮氨酸含量最高【2】。据报道由于冬虫夏草富含上述氨基酸故有补益。辅助治疗消化系统及神经系统的疾病，抑制病菌及增强免疫功能等作用。 1.5其他成分 上述成分为冬虫夏草的主要有效成分，此外冬虫夏草还含有抗坏血酸、核黄素、硫胺素等维生素,还含有维生素B1，维生素B2，维生素B12，维生素C，烟酸和烟酰胺等。从冬虫夏草张分离鉴定了12个脂肪酸成分，其中4个主要成分为软脂酸、硬脂酸、油酸、亚油酸和一个微量的十七烷酸。对冬虫夏草弱极性部分化学成分进行研究，确定了8种脂肪酸，4种烷烃，一个三烷基取代苯酚，1个烯醇和1个烯醛。含多胺类成分主要有腐胺、精胺、精咪，1，3-二氨基丙烷、尸胺、类精眯等。据报道冬虫夏草种含不少于37种的无机元素、其抗癌作用可能与含P、Co、Fe、Cu有关。冬虫夏草还含有Verticiol、磷脂胆碱及咖啡因等【3】
多糖各种提取方法
一、植物多糖的提取 1 溶剂提取法 1．1 水提法 水对植物组织的穿透力强，提取效率高，在生产上使用安全、经济。用水作溶剂来提取多糖时，可以用热水浸煮提取，也可以用冷水浸提。一般植物多糖提取采用热水浸提法，该法所得多糖提取液可直接或离心除去小溶物；或者利用多糖不溶于高浓度乙醇的性质，沉淀提纯多糖；但由于不同性质或不同相对分子质量的多糖沉淀所需乙醇浓度不同，它也可以用于样品中不同多糖组分的分级分离；还可按多糖不同性质在粗分阶段利用混合溶剂提取法对植物中不同的多糖进行分离；其中，以乙醇沉淀最为普遍。但以根茎为主的植物体,细胞壁多糖含量高,热水直接提取率不高。此时为破坏细胞壁,增加多糖的溶出，有两种处理方法:一为酶解,二为弱碱溶解。 1．2酸碱提法 有些多糖适合用稀酸提取，并且能得到更高的提取率。但酸提法只在一些特定的植物多糖提取中占有优势，目前报道的并不多。而且即使有优势，在操作上还应严格控制酸度，因为酸性条件下可能引起多糖中糖苷键的断裂。 有些多糖在碱液中有更高的提取率，尤其是提取含有糖醛酸的多糖及酸性多糖。采用的稀碱多位为0．1mol／L氢氧化钠、氢氧化钾，为防止多糖降解，常通以氮气或加入硼氢化钠或硼氢化钾。同样，碱提优势也是因多糖类的不同而异。与
酸提类似，碱提中碱的浓度也应得到有效控制，因为有些多糖在碱性较强时会水解。另外，稀酸、稀碱提取液应迅速中和或迅速透析，浓缩与醇析而获得多糖沉淀。
1．4 生物酶提取法 酶技术是近年来广泛应用到有效成份提取中的一项生物技术，在多糖的提取过程中，使用酶可降低提取条件，在比较温和的条件中分解植物组织，加速多糖的释放或提取。此外，使用酶还可分解提取液中淀粉、果胶、蛋白质等的产物，常用的酶有蛋白酶，纤维素酶，果胶酶等。 1．5 超声提取法 超声波是一种高频率的机械波，其主要原理是利用超声波产生的“空化作用”对细胞膜的破坏，有利用植物有效成分的释放，而且超声波能形成强大的冲击波或高速射流，有效地减小、消除与水相之间的阻滞层，加大了传质效率，有助于溶质的扩散。另外，超声波的热效应使水温基本在57℃，对原料有水浴作用。超声波提取与传统的提取方法相比，有提取效率高、时间短、耗能低等优点。超声提取的影响因素有：超声时间、超声频率（一般低频中提取效率高，但也有例外）、料液比和温度等。 1．6 微波提取 微波是频率介于300MHz和300GHz之间的非电离电磁波，微波提取的原理是微射线辐射于溶剂并透过细胞壁到达细胞内部，由于溶剂及细胞液吸收微波能细胞内部温度升高，压力增大，当压力超过细胞壁的承受能力时，细胞壁破裂，位于细胞内部的有效成份从细胞中释放出来，传递转移到溶剂周围被溶剂溶解。微波技术应用于植物细胞破壁，有效地提高了收率。具有穿透力强、选择性高、加
蛹虫草菌粉胶囊和虫草胶囊的本质区别
蛹虫草菌粉胶囊与虫草胶囊的本质区别 蛹虫草菌粉胶囊与虫草胶囊的本质区别是什么？蛹虫草菌粉胶囊与虫草胶囊是冬虫夏草中分离得到的菌丝体，在超低温下低温常温卫生的状态下经发酵培养所得菌丝体的干燥粉末再装成胶囊。更方便服用，因为是低温状态，所以在破壁的过程中基本上不会使虫草的营养成分比如腺苷，虫草多糖等挥发性有效成分损失，而且细胞打破后，入口即化，更利于人体的吸收，大幅度提高吸收率。那么蛹虫草是什么呢？北冬虫夏草草长5~8公分，金黄、桔黄色，又称北冬虫草、北虫草、蛹虫草，是一种名贵的药用真菌，与青海冬虫夏草同属于真菌门虫草属，有相似的药用和滋补功效。国内外对已经成为诱发虫草子实体的种类研究认为，北虫草食用和药用价值可与传统的冬虫夏草媲美，人工培养的北虫草虫草素含量高于传统冬虫夏草几十倍。现代医药学研究证明，虫草中含有虫草素、虫草酸以及各种氨基酸等营养物质，具有滋肺补肾、止血化痰、扩张气管、镇静、抗各类细菌、降血压等功效。 先让我们了解一下北冬虫夏草的生长习性 1、营养：首先，北冬虫夏草可利用的主要碳源物质是葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、淀粉、果胶等，但以单糖或小分子双糖的利用效果为佳。其次，氮元素是北冬虫夏草合成蛋白质和核酸物质的必要元素，北冬虫夏草能利用的氮类物质尤其是有机态氮的种类较多，如蛋白胨、豆饼粉、酵母膏等均可；也可利用若干无机态氮，但以有机态氮的利用效果为好。再次，北冬虫夏草菌丝及其子座生长中，必不可少的元素即是矿质元素，因此，生产中应予酌量添加。第四，适量的生长素有效刺激和促进北冬虫夏草菌丝的生长，并大大提高其生物量，生产上多以添加维生素类为主要措施。最后，合理的基质碳氮比（CN）是人工栽培北冬虫夏草的必需条件，否则，将导致菌丝产生长或者菌丝生长缓慢、或者污染严重、或者气生菌丝过旺，难以发生子座，即便有子座分化，其产品数量和质量均有不同程度的下降。生产中一般以调CN在3-4：1 之间为宜。 2、温度：北冬虫夏草菌丝生长温度为6-30°C，最适温度为18-22°C；原基分化温度在10-25°C 之间，生产中为刺激原基的适时形成，可适当调控温差在24小时内5-10°C 的范围；子座生长温度为10- 25°C，最适20-23°C；孢子弹射温度为28-32°C，最高应控制在34°C 以下；若非育种或分离以及特殊需要，单纯栽培、以获得子实体为目的时，不要达到或超过28°C。
冬虫夏草菌丝体液体培养基的优化
文章编号:167121114(2008)0120008204 冬虫夏草菌丝体液体培养基的优化 收稿日期:2007208227 基金项目:天津市科学技术委员会资助项目(06ZHCXNC05900) 第一作者:赵 润(1983— ),男,硕士研究生.通讯作者:郭成金(1952— ),男,副教授,主要从事蕈菌生物学的研究与开发.赵 润,郭成金 (天津师范大学化学与生命科学学院,天津300387) 摘 要:采用正交分析方法对冬虫夏草菌丝体的液体培养基配方进行了优化,结果表明,冬虫夏草生长最适液体培养基配方为:葡萄糖1.25%,蔗糖1.25%,蛋白胨0.02%,酵母粉0.0625%,KH 2PO 40.025%,MgSO 4?7H 2O 0.0125%,VB 10.0025%,p H 自然;培养温度24℃,周期192h ,其菌丝体生物量产率为19.5g/L ,是前人菌丝体 生物量产率的1.2～1.5倍. 关键词:正交分析;冬虫夏草;菌丝体;液体培养基;优化;生物量中图分类号:Q932335 文献标识码:A Optimizing on liquid culture media of Cor dyce ps sinensis mycelia Z HA O Run ,GUO Chengjin (College of Chemist ry and Life Science ,Tianjin Normal University ,Tianjin 300387,China ) Abstract :The liquid culture media of Cordyce ps sinensis mycelia was optimized by means of orthogonal analysis.The results showed that the optimal medium for the mycelia was 1.25%glucose ,1.25%sucrose ,0.02%peptone ,0.0625%yeast powder ,0.025%KH 2PO 4,0.0125%MgSO 4?7H 2O ,0.0025%VB 1and p H natural.In the cultural condition of 24℃and 192h ,the mycelia biomass reached to 19.5g/L ,which was as 1.2～1.5times as the amount with the previous way. K ey w ords :orthogonal analysis ;Cord yce ps sinensis ;mycelia ;liquid culture media ;optimize ;biomass 冬虫夏草属于真菌界(K ingdom Fungi )、子囊菌门(Ascomycota )、核菌纲(Pyrenomycetes )、麦角菌目(Clavicipitales )、麦角菌科(Clavicipitaceae )、虫草属[Cor d yceps (Fr.)Link.],英文名为Chinese Caterpillar Fungus [122].内含25%～32%粗蛋白及8.4%脂肪,富含缬氨酸、羟基缬氨酸、精氨酸、丙氨 酸、谷氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸等18种氨基酸和虫草酸(C 7H 12O 6)、四羟基环己酸以及虫草菌素(Cordycepin )等成分,虫草菌素具有一定的抗生作 用和抑制细胞分裂的作用 [1] . 现代医学认为,冬虫夏草含有可能提高人体免疫力、抗疲劳、耐缺氧、抗衰老、抗肿瘤等的虫草素、虫草酸、核苷类、甾醇类,以及人体必需的氨基酸、有益微量元素、维生素、虫草多糖、SOD 等多种营养物 质和有益的活性物质.临床研究表明,虫草具有多 方面功效:如能显著提高人体免疫系统能力,治疗呼吸系统疾病;抗缺氧、抗疲劳,以提高运动能力;能调节心、脑血管;具有补肾壮阳、抗肿瘤、抗衰老、抗菌、抗病毒、消炎的作用以及美容护肤的效果等[2]. 目前,通过液态深层培养可以实现菌丝体的快速生产,同时通过优化生产条件,以提高其生物活性物质的含量,便于提取目的组分[3].此外,还可通过连续性地大规模工业化生产,消除某些难以控制的环境因子,缩短生产周期,降低生产成本,为深加工提供广泛的应用领域. 因此,深层发酵培养冬虫夏草具有重要的实践和理论意义.本研究在已有工作的基础上,进一步优化了冬虫夏草菌丝体液体培养基,以期为今后工业化生产以及理论研究奠定更坚实的基础. Vol.28No.1 J an.2008 第28卷 第1期2008年1月 天津师范大学学报(自然科学版) Journal of Tianjin Normal University (Natural Science Edition )
多糖的提取和纯化
多糖的提取和纯化目前，真菌多糖的提取可从子实体和采用深层培养发酵液的菌丝中分离获得，但以从子实体中提取多糖为主。首先是将子实体粉碎，加入甲醇或乙醇乙醚1:1混合液，水浴加热搅拌1一3小时除去表面脂肪。其次是用残渣提取多糖，常用的方法有不同温度下的水提法、稀酸提法、冷热稀碱提法。水提法采用的较多，适合于提取水溶性多糖。稀酸提取法适用于提取酸溶性多糖、时间宜短，温度不超过50℃，以防止糖昔键断裂。稀碱法适合于提取碱溶性糖。然后除去小分子杂质，常采用透析法，将多糖提取液置于半透膜透析袋中，逆向流水透析1一3天。第四步是沉淀多糖。大部分多糖在有机溶剂中的溶解度极小，所以可用有机溶剂来沉淀。常用4一5倍低级醇、丙酮，一般在pH=7.0左右沉淀多糖，制得粗多糖。最后是除去蛋白质。除去多糖中的蛋白质常用的方法是三氯醋酸法。得到的溶液基本上是没有蛋白质与小分子杂质的多糖混合物或单一多糖。 多糖的纯化是将多糖混合物分离为单一的多糖。纯化方法很多，主要纯化方法有:(l)分步沉淀法根据不同多糖在不同浓度的低级醇或酮中具有不同溶解度的性质，逐次按比例由小而大加入这些醇或酮分步沉淀。此法适用于分离各种溶解度相差较大的多糖。(2)盐析法根据不同多糖在不同浓度盐中具有不同溶解度而分离。 纯度鉴定和分子量测定多糖纯度标准不能用通常化合物纯度标准来衡量，因为我们所说的多糖纯品实质上是一定分子量范围内的均一组成。因此，测得的分子量一般为平均分子量。过去常用粘度法、蒸气压渗透计法、沉降法、超速离心法、光散射法等测定高分子化合物分子量的方法测定真菌多糖的分子量，但由于这些方法测定起来比较麻烦，且误差较大，现多数已不采用。目前实验室常用的方法为凝胶过滤法和高压液相色谱法，对于分子量小于1百万的多糖用高压液相法为最好。 1.2.1发酵、提取 取香菇465菌株斜面菌种接人摇瓶培养基中振荡培养，逐级扩大培养至10O0L，25℃下通 气培养72h，压滤，得香菇深层培养菌丝体。 上述菌丝体经水洗涤后，用3倍量热水(90一100℃)浸取3h，浸取液经浓缩加3倍量95肠乙 醇，离心得乙醇沉淀物一Le[‘’。 1.2。2分离、纯化 取Le上样于DEAE一纤维素柱上，用O。Olmol/L pH 6.95 Tris-HCI缓冲液洗脱，洗脱液分 部收集，分别用UV(280nm)和酚硫酸法测定其吸收值(A值)，合并吸收峰重叠的洗脱液，经浓 缩、透析、冻干得淡黄色絮状物Le一2· Le一2进一步用DEAE一纤维素(DE52型)分离，先用pH7.8的0.oosmol/L硼酸缓冲液洗脱， 后用含lmol/L NaCI的o.Zmol/L硼酸缓冲液洗脱.各洗脱液按上法用UV230nm和酚硫酸法 检测，分别收集既含肤又含糖的洗脱液.用o.005mol/L硼酸缓冲液洗脱的组分为Le一2一1，用含 lmol/L NaCI的硼酸缓冲液洗脱的组分称Le一2一2o 1.2.3鉴定 1.2.3.1纯度 (l)HPLC法将样品配成1%浓度后进样.进样量20召L。流动相:0.002mol/L NaAc;
虫草菌丝体
虫草菌丝体 【产品名称】虫草菌粉虫草菌丝体 【产品来源】本品为从青海新鲜冬虫夏草中分离得到的麦角科真菌冬虫夏草[Cordyceps sinensis(Berk.)Sae.] 的无性世代---中华束丝孢(Synnematum sinense Yin et Shen sp.now)菌种经液体发酵培养所得菌丝体的干燥粉末。 【产品性状】虫草菌丝体为浅棕黄色或者棕黄色粉末；气微腥。 【产品目数】80目 【定量分析】 (1)氨基酸：取本品约20mg，精密称定，置180×18mm试管中，加盐酸液(6mol/L)6ml，真空封管，放入110℃(±1℃)烘箱中，水解24小时。打开试管封口, 把内容物移入蒸发皿中，试管用水25ml分次冲洗，洗液并入蒸发皿中，蒸干，残渣用盐酸液(0.02mol/L)分次洗涤，含并洗涤液，滤过，滤液移
至50ml量瓶中,稀释至刻度，摇匀。用氨基酸自动分析仪测定。本品含总氨基酸不得少于30.0%。其中酪氨酸的相对百分比含量不得少于2.0%。赖氨酸不得少于5.5%，组氨酸不得少于4.5%；精氨酸不得少于8.5%。 (2)甘露醇：取本品1g，精密称定,置150ml圆底烧瓶内,加乙醇100ml,回流2小时。放冷2小时,滤过,精密量取滤液4ml,照甘露醇含量测定法，自“置碘量瓶”起，依法测定。本品含甘露醇(C6H14O6)不得少于7.0%。 【功能与主治】 1.虫草菌丝体能增强青少年的生长发育，促进智力和体力的发展，必需氨基酸齐全，是少年、儿童必备的营养滋补品。 2.虫草菌丝体有促进代谢、改善心肌营养，增强肌体的免疫能力，是中老年十分理想的康复保健、滋补营养之上品。 3.虫草菌丝体对顽固性的神经衰弱、食欲不振、营养不良等症状均有良好效果。