非受体型酪氨酸激酶Syk蛋白的提取与纯化
论著
文章编号:1007-8738(2004)02-0230-04
非受体型酪氨酸激酶-Syk 蛋白的提取与纯化
单保恩1,董 青1,李宏芬1,陈 晶1,董金琢2,马 洪2
(1河北医科大学第四医院科研中心,河北石家庄050011;2美国MD 技术公司,Mo 63021,美国)
收稿日期:2003-06-07; 修回日期:2003-09-18基金项目:美国MD 技术公司合作课题基金资助(2002年)作者简介:单保恩(1962-),男,河北邯郸人,教授,博士生导师.
Tel:(0311)6033941-290;Email:baoenshan@yahoo.c https://www.360docs.net/doc/911951087.html,
Extraction and purification of non -recep -tor type PTKs -Syk
SHAN Bao -en 1,DO NG Qing 1,LI Hong -fen 1
,C HE N Jing 1,DO NG Jin -zhuo 2,MA Hong 2
1
Research Center ,The Fourth Hospital of Hebei Medical University,Shijiazhuang 050011,China;2MD Technologies Inc.845Pheasant Woods Drive Manchester,Mo 63021,USA
Abstract
AIM:To extract and purify Syk protein from Sf 21cells transfec-t ed by syk gene.METHODS:Sf 21cells were transfected with recom bi nant syk gene.After 48h of incubation at 28 ,the transfected cells were collected and sonicated with Sonfier son-i cator on ice.Filtered cell extract was loaded onto a R eactive Yellow -3res i n column and Toyopearl AF -H eparin -650M colum n respectively.The character of Syk protein in the fractions were i dentified by SDS -PAGE,W estern blotting and IEF.RESULTS:225m g of protein containing Syk were obtained from Sf 21cells (2.5 109)extract.There were two subpopulations in the elu -tion of Reactive Yellow -3resin column with the same relative molecular mass (M r )72 103.The two subpopulations were then applied on Toyopearl AF -H eparin -650M column and two pure proteins were obtained.The results of SDS -PAGE,W es-t ern blotting,and IEF showed the two proteins having the sam e relative molecular mass (72 103),corresponding to Syk,but with different pI.CONCLUSION:The y ield of Syk was 8m g from 2.5billion cells and the purity was >95%.The two purified Syk proteins have the sam e M r and different pI.The purified Syk protein can be applied to study Syk s m echanism,produce ant -i Syk antibody and invent Syk diagnosis kit,etc .Keywords:Syk;purification;chromatography;Sf 21cells
摘要
目的:从转染syk 基因的Sf21细胞中提取、纯化免疫相关因子
Syk 蛋白。方法:将syk 基因转染Sf21细胞,于28 培养48h,收集细胞,用超声波破碎仪裂解细胞,提取裂解液中总蛋白,用Yellow -3凝胶和Toyopear-l AF -Heptin -650M 凝胶层析柱分离、纯化。层析液中的Syk 蛋白存在和性质,用SDS -PAGE 、免疫印迹实验和等电聚焦实验鉴定。结果:从25亿个Sf21细胞裂解液中提取了含有Syk 的225mg 蛋白质。经Yellow -3凝胶层析分离,得到两个亚种的Syk 蛋白,相对分子质量(M r )均为72 103。进一步用Toyopear-l AF -Heptin -650M 凝胶层析纯化后,得到两个纯的Syk 蛋白,SDS -PAGE 、免疫印迹实验结果显示,两种Syk 的M r 均为72 103,与Syk 的理论相对分子质量吻合。但等电聚焦实验显示,这两种Syk 蛋白成分具有不同的pI 值。结论:从25亿个转染syk 基因的Sf21细胞中纯化出8mg Syk 蛋白,纯度高于95%。这两种Syk 的M r 虽然相同,但具有不同的pI 值,是两个亚种。这些Syk 可用于研究Syk 的作用机制、抗Syk 抗体的制备和Syk 诊断试剂盒的制备等。关键词:Syk;分离纯化;凝胶层析;Sf21细胞中图分类号:R392.11 文献标识码:B
非受体型酪氨酸激酶(spleen tyrosine kinase,Syk),是一种B 细胞激活信号转导中最重要的激酶
[1]
,与T 细胞激活中的ZAP -70属于同一个PTK 家
族,M r 为72 103。Syk 在T 细胞和B 细胞的成熟和活化过程中起关键作用[2]。该酶除有激酶活性中心SH1之外,还有两个SH2结构域,因而成为磷酸化I -TAM 招募的首选对象。被招募的Syk 立即成为Src 作用的第二个靶目标,进而启动B 细胞活化信号转导的三条主要途径(磷脂酰肌醇途径、MAP 激酶相关途径和磷酸肌醇3激酶途径),激活各种转录因子转位进入细胞核,与基因启动子区域中各种顺式作用元件或DNA 小盒结合,使相应基因发生转录激活和产物表达,调整B 细胞等细胞克隆的蛋白质表达、细胞分化或凋亡。研究发现,Syk 不但是免疫调节因子,在肿瘤发生发展中也发挥着重要作用。但是,用于研究Syk 的蛋白标准品、抗体和诊断用试剂很难取得。我们介绍从转染s yk 基因的Sf21细胞中提取、纯化免疫相关因子Syk 蛋白。
1 材料和方法
1.1 材料 兔抗Syk抗体购自美国Santa Cruz生物技术公司。酶标记绵羊抗兔二抗购自美国Lexington KY转导实验室。蛋白M r标准品[M r(14~97) 103 \ 和EC L购自华美公司分装的Amershan Pharmacia Biotech公司产品。PVDF膜使用Millipore产品。其他化学试剂均为分析纯。
1.2 方法
1.2.1 细胞株及细胞培养 Sf21细胞株来源于黏虫卵巢组织(Spodoptera frugiperda),由美国Inritrogen提供[4]。Sf21细胞应用Grace s培养基(含100mL/L FCS,10g/L抗菌素和抗霉菌素)(Gibco-BRL)进行培养[5]。将细胞调整到1 109/L左右的密度,用培养瓶(Bellc o Glass Inc.Vineland,NJ)于恒温摇床(80~ 100r/min)26~28 进行培养。经胎盼蓝染色检测活细胞百分率应为95%~100%。
1.2.2 重组s yk基因的杆状病毒制备 应用Luckow 建立的Bac-to-Bac方法进行制备[6]。该方法是基于在大肠杆菌中点特异性转录重组病毒的产生特性,表达水平较高,是较理想的基因表达载体。
1.2.3 纯化baconid syk DNA 应用脂质体介导技术[7],将转染s yk基因的Sf21细胞于28 培养4~ 6d,用cellfectin试剂(Gibco-B RL)进行选择培养,收集细胞制备s yk DNA。应用O Reill等[7]报道的噬菌体纯化法纯化病毒颗粒。经培养一些孔形成噬菌斑,将这些阳性培养孔细胞经SDS-PAGE检测,有M r为72 103蛋白条带的存在。
1.2.4 Sf21细胞的大量制备及Syk的分离、纯化 于3L培养瓶中加入1L呈对数生长期的Sf21细胞悬液[(1.0~1.2) 106/mL],加入25mL病毒贮存液( 2.5 108pfu/m L),于恒温摇床(80~100r/min)28 培养48h进行病毒感染(病毒感染率约为6)和细胞增殖[8]。收集细胞悬液低速离心(500g,7min),将细胞沉淀物(2.5 109)与细胞裂解液(20mmol/L磷酸钠pH7.4,1mmoL/L EDTA,1mmol/L EGTA,1 mmol/L DTT,1mL/L Triton-100,200mg/L抑蛋白酶肽,50mg/L亮抑蛋白酶肽,10mmol/L焦亚硫酸钠)共同培养30min,于冰浴中用超声波破碎仪(Branson sonic Power Co.Danburg.CT)震荡裂解3次,每次30s (设定输出功率为 3 档)。将细胞裂解液于4 100 000g离心60min(贝克曼LE-80K超速离心机)。收集上清液,用0.2 m滤器滤过。将滤液加入活化的Yello w-3层析柱(2.5 10cm,Sigma),用两倍体积的缓冲液(20mmol/L Na-Pi,pH7.4,1mmol/L EDTA,1 mmol/L EGTA,1mmol/L DTT)和1倍体积的含有200 mmol/L NaCl的缓冲液冲洗层析柱。Syk蛋白用3.5倍体积的含0.2~1mol/L NaCl的缓冲液洗脱,层析液中的Syk蛋白用SDS-PAGE和免疫印迹进行检测。
含有Syk的层析成分分别被收集到一起,用含有200mmol/L NaCl的缓冲液透析2h,再加入Toyopearl AF-Heptin-650M层析柱(2.5 12cm,Sigma)层析柱中,用含200mmol/L NaCl的缓冲液平衡后,Syk蛋白用含有(0.2~1)mol/L浓度梯度NaCl的缓冲液洗脱,层析成分用SDS-P AGE和免疫印迹分析Syk蛋白的存在。
1.2.5 蛋白电泳和免疫印迹实验 细胞溶解物或层析液进行SDS-PAGE分离(分离胶浓度为100g/L),凝胶用CBB-R250染色确认蛋白条带,并将此凝胶上的蛋白转移至PVDF膜,蛋白Marker用Ponceans(Sig-ma)染色。PVDF膜用30g/L B SA(B SA溶于TB ST缓冲液:1mm ol/L Tris-HCl,pH7.4,150mmol/L NaCl和1 mL/L T ween20)封闭1h后,与抗Syk抗体(用TB ST作1 20000稀释),室温反应1h。用化学发光显色系统显色(ECL,Amershan Phamacia Biotech)。
1.2.6 等电聚焦实验 Syk的等电聚焦实验应用Phamacia phast System和IEF Phast Gel系统,按产品说明书操作。
2 结果
2.1 从Sf21细胞中提取蛋白质 将转染syk基因的Sf21细胞(2.5 109)与细胞裂解液共同孵育30min,再用超声波破碎仪震荡裂解。裂解液经100000g离心,收集上清液,用0.2 m滤器滤过,从细胞裂解液中获取了225mg蛋白质。
2.2 Syk Yellow-3层析柱的分离和初步纯化 将从Sf21细胞提取的蛋白质,用Yellow-3层析柱分离得到两个Syk层析成分(图1A黑色区域,表示23~33和34~41两个层析成分的峰值),析出两个Syk的盐浓度梯度(虚线)分别在(420~500)m mol/L和(550~ 650)mmol/L NaCl之间。SDS-PAGE分离结果显示, 23~33和34~41两个层析成分均含有单一的蛋白条带,M r为72 103(图1B)。免疫印迹结果显示两种蛋白质均为Syk(图1C)。
图1 Yellow -3柱层析纯化Syk 结果
Fig 1 Puri fication of Syk through a Reactive Yellow -3resi n colu mn
A:The chromatogram of the elution from the Reactive Yello w -3resin column.The salt gradient used in the el ution from the column is sho wn as a dashed line.B:The results of SDS -PAGE.M:Molecular weight marker;S100:The extract of Sf21cells;FT:Flo wthrough.The other lanes are frac tions 23to 42.C:Western analysis c onfi rms the identi ty of the M r 72 103protein band as Syk.
2.3 Toyopearl AF -Heptin -650M 层析柱进一步纯化Syk 经Yello w -3凝胶层析分离的23~33层析成分进
一步用Toyopearl AF -Heptin -650M 层析柱分离,得到了单一的蛋白质峰(图2A,)。同样,34~41层析成分经Toyopearl AF -Heptin -650M 层析柱分离,得到了单一的蛋白质峰(图2B)
。
图2 Syk 成分进一步用T oyopearl AF -Heptin -650M 层析柱分离
的结果
Fig 2 Purification of Syk through a Toyopearl AF -Heparin -650M co-l
umn
A:No.22-33fractions of Reactive Yellow -3resin col umn;B:No.34-41frac -tions of Reactive Yellow -3resin column.The darkened area shows the peak consisting of fracti ons 22-28containi ng Syk.
2.4 Syk 的等电聚焦分析(IEF) 经Toyopearl AF -Heptin -650M 纯化的两个Syk 成分用免疫印迹分析虽显示相同结果,但经IEF 分析,这两个Syk 具有不同的pI 值(图3)。
图3 Syk 蛋白的等电聚焦分析(IEF)结果
Fig 3 Isoelectric focusing (IEF )of the two Syk proteins puri fied
through a Toyopearl AF -Heparin -650M column
Note:Lane 1and lane 2are respectivel y fractions 23-33and 34-41puryfied through Toyopearl AF -Heparin -650M col umn.The two Syk s howed different pI.
2.5 获得Syk 蛋白的不同纯化过程的总结 经SDS -PAGE 分离,CBB 染色结果显示,细胞裂解产物出现多条蛋白条带(图4A 泳道1)。细胞裂解产物经100000g 离心后的上清液也出现多条蛋白条带(图4A 泳道2)。但经Yellow -3凝胶层析(泳道A3),并进一步用Toyopearl AF -Heptin -650M 层析纯化后,显示单一的Syk 特异性蛋白条带(泳道A4)。免疫印迹结果显示,M r 72 103的蛋白质为Syk(图4B)。
图4 不同Syk 样品经SDS -PAGE 分离(A),CBB 染色和抗Syk
抗体免疫印迹结果(B)
Fig 4 Samples were subjected to SDS -PAGE and analyzed by Coomassie s taining (A)and wes tern blotting with ant-i Syk antibodies(B)
M :Protein marker;1:Whole cell lysate;2:100000g s upernatant (S100);3:Combined Syk contai ning fraction from the Reactive Yello w -3chromatogra -phy;4:Combined Syk containi ng frac tion from the chromatography on Toyopearl AF -Heparin -650M resin.
2.6 Syk蛋白的产量 从25亿个Sf21细胞中经Ye-l lo w-3层析分离和Toyopearl AF-Heptin-650M层析纯化,得到了8m g Syk,纯度高于95%(表1)。
表1 从Sf21细胞中制备和纯化重组Syk
Tab1 Purification and Yield of Recombinant Syk from Sf21Cells Purific atory step Total prote in(mg)ra t i o of total protei n(%) Ce ll lysate225100
Yell ow-3c olumn13.3
23~33fracti on14.4
34~41fracti on15.6
Toyope arl AF-Hepti n-
650M c olum n 3.55
23~33fracti on 3.52
34~41fracti on 4.45
3 讨论
Syk在T细胞和B细胞的成熟和活化过程中起关键作用[2],而近来对Syk与肿瘤相关性研究证实, Syk可以抑制多种恶性肿瘤生长,从而引发了对非受体酪氨酸激酶在肿瘤发生发展和转移过程中的作用研究。但是,有关Syk仍有许多问题需要深入研究,如其在不同种属组织间的表达情况,抑制肿瘤细胞侵袭性生长的具体机制,是否可以作为检测乳腺癌等肿瘤的标记分子及临床应用价值等[11]。然而,用于研究的Syk蛋白和抗Syk抗体尚未得以普及销售,我们从转染syk基因的Sf21细胞中提取、纯化了Syk 蛋白。在本研究中,我们将syk基因重组于昆虫细胞(Sf21细胞),从25亿个Sf21细胞中提取了225mg蛋白质。为了减少蛋白降解或活性丧失,迅速进行了层析分离。首先经Yellow-3层析柱分离,得到两个含有Syk蛋白的层析成分,两个成分分别在420~500 mmol/L和550~650mmol/L的盐浓度梯度之间被洗脱。蛋白印迹分析显示,两个蛋白质峰均含有Syk蛋白(M r为72 103)。将Yellow-3层析分离得到的两个Syk成分进一步用Toyopearl AF-Heptin-650M层析柱纯化,得到两个纯的Syk成分,两种成分均在22~28层析成分中被分离出来,即M r相同,与Syk的分子量吻合。该成分的NaCl洗脱液浓度为700~800 mmol/L。经SDS-PAGE分离,蛋白印迹实验证实,M r 在72 103处的蛋白条带为Syk。但是,两种Syk经等电聚焦分析(IEF)具有不同的pI值。
以前,应用普通的Sephercryl S系列凝胶层析柱分离Syk蛋白,回收率较低(从25亿个Sf21细胞中得到5.5mg蛋白质),得到的Syk蛋白质的纯度较低(75%)。为了得到高回收率、高纯度的Syk蛋白,我们对Sigma公司销售的多种亲和层析柱进行了筛选,结果显示,经Yellow-3和Toyopearl AF-Heptin-650M两种亲和层析柱联合分离、纯化,最终得到了8m g Syk,纯度高于95%,是Syk较理想的联合纯化方法。这些Syk可用于研究Syk的作用机制,进行抗Syk抗体和诊断用试剂盒的制备等用途。
参考文献:
[1]单保恩,董 青,王晓玲,等.兔抗Syk抗体制备和在乳腺癌诊断
中的应用[J].细胞与分子免疫学杂志,2003,19(5):458-460. [2]Zeo A.Jennifer A Pietenpol Syk:a new player in the field of breas t cancer
[J].Breast Cance r Res,2001,3:5-7.
[3]Chu DH,Mori ta CT,Weiss A.The Syk family of protein tyrosine kinases
in T-cell activation and development[J].Immunol Re v,1998,165:167 -180.
[4]Vaughn J L,Goodwi n R H,Tompkins GJ,et al.The es tablis hment of two
cell lines from the insect Spodoptera frugiperda[J].Le pido pte ra Noct uidae In Vitro,1977,13:213-217.
[5]Willi ams MD,Fieno AM,Grant RA,e t al.Expression and anal ysis of a
bacterial poly(hydroxyalkanoate)synthase i n insect cell s using a bac-ulovirus system[J].Prote in Expr Puri f,1996,7:203-211.
[6]Luckow VA,Lee SC,Barry GF,et al.Efficient generation of infectious
recombinant bacul oviruses by site-specific trans poson-mediated i nserti on of foreign genes into a baculovi rus genome propagated in Esche ric hia coli[J].
J V irol,1993,67:4566-4579.
[7]O Reill y D R,Miller LK,Lucko w VA.Bacul ovirus expression vectors:A
laboratory manual[M].New York:Freeman,1992.
[8]Kool M,Voncken JW,Van Lier FL,et al.Detection and analys is of Au-
tographa californica nuclear pol yhedrosis virus mutants with defecti ve i nter-fering properti es[J].Vi rology,1991,183:739-746.
[9]Coopman PJ P,Domt H,Barth M,et al.The Syk tyrosine kinase s up-
press es mali gnant growth of human breas t cancer cells[J].Nature,2000, 406:742-747.
[10]Baylin SB,Herman JG,Graff J R,et al.Alterations i n DNA me thyla-
tion:a funda mental aspect of neoplasia[J].Adv Cance r Reo,1997,72: 141-196.
[11]Martin F,Gisela Z,Anne CA,et al.M olecule characterization of the
muri ne Syk protein tyrosine kinase cD NA,transcripts and protein[J].
Bioc he mical and Biophysical Researc h Communications,1995,213:273 -281.
蛋白质的提取与检测
蛋白质的提取与检测
蛋白质的提取与检测 第一节细胞总蛋白的提取及含量测定 【基本原理】 蛋白质含量测定法是生物化学研究中最常用、最基本的分析方法之一。目前常用的有四种经典的方法，即定氮法、双缩脲法（Biuret法）、Folin-酚试剂法（Lowry法）和紫外吸收法。另外还有两种近年普遍使用起来的测定法，即考马斯亮蓝法（Bradford法）与二辛可宁酸法（BCA法）。值得注意的是，上述方法并不能在任何条件下适用于任何形式的蛋白质，因为一种蛋白质溶液用这几种方法测定有可能得出不同的结果。每种测定法都不是完美无缺的，都有其优缺点。在选择方法时应考虑：①实验对测定所要求的灵敏度和精确度；②蛋白质的性质；③溶液中存在的干扰物质；④测定所要花费的时间。 Lowry法：蛋白质与碱性铜溶液中的二价铜离子络和使得肽键伸展，从而使暴露出的酪氨酸和色氨酸在碱性铜条件下与磷钼钨酸反应并产生深蓝色，在750nm有最大光吸收值。在一定浓度范围内，反应液颜色的深浅与蛋白质中的酪氨酸和色氨酸的含量成正比,由于各种蛋白质中的酪氨酸和色氨酸的含量各不相同，因此在测定时需使用同种蛋白质作标准。 Bradford法：蛋白质与染料考马斯亮蓝G-250结合，使得染料最大吸收峰从465nm变为595nm，溶液的颜色由棕黑色变为蓝色。在一定的线性范围内，反应液595nm处吸光度的变化量与反应蛋白量成正比，测定595nm处吸光度的增加即可进行蛋白定量。
BCA （Bicinchoninic acid）法：二价 铜离子在碱性 的条件下，可以 被蛋白质还原 成一价铜离子 （Biuret reaction）并与 BCA相互作用 产生敏感的颜 色反应。两分子 的BCA螯合一 个铜离子，形成 紫色的反应复 合物。该水溶性 的复合物在 562nm处显示 强烈的吸光性， 吸光度和蛋白 浓度在广泛范 围内有良好的 线性关 0.118 0.05 0.154 0.1 0.213 0.2 0.283 0.3 0.329 0.4 0.404 0.5 第二节SDS-PAGE电泳 【基本原理】
酪氨酸激酶抑制剂类抗肿瘤药物研究方法进展
现代生物医学进展https://www.360docs.net/doc/911951087.html, Progress in Modern Biomedicine Vol.10NO.16AUG.2010 酪氨酸激酶抑制剂类抗肿瘤药物研究方法进展* 刘振凯1艾 菁2耿美玉1,2△ （1中国海洋大学医药学院山东青岛266003；2中国科学院上海药物研究所上海201203） 摘要：酪氨酸激酶（protein tyrosine kinases,PTKs ）在肿瘤细胞的增殖、分化、迁移、侵袭等相关信号通路中起到了关键的调控作用，已经成为肿瘤靶向性治疗的重要靶点。本文对靶向酪氨酸激酶的小分子抑制剂的筛选和评价方法进行综述，以期促进酪氨酸激酶抑制剂类抗肿瘤药物的研究。 关键词：酪氨酸激酶；抗肿瘤药物；小分子抑制剂；抑制剂筛选 中图分类号： R730.5，R915文献标识码：B 文章编号：1673-6273（2010）16-3134-04Advances in Research of Protein-tyrosine Kinases Inhibitors as Anticancer Drug* LIU Zhen-kai 1,AI Jing 2,GENG Mei-yu 1,2△ （1Marine drug and food Institute,Ocean university of China,Qingdao,266003,China;2Shanghai Institute of Materia Medica,Chinese Academy of Sciences,Shanghai,201203,China ） ABSTRACT:Protein tyrosine kinases (PTKs)have long been recognized as promosing therapeutic targets involved in a variety of human diseases and in particular several types of cancer.They play important roles in regulating intracellular signal transduction path-ways closely associated with the invasion,metastasis and angiogenesis of many tumors.An effort towards the development of new and more effective PTK inhibitors represents an attractive therapeutic strategy for cancer therapy.In this paper,we review the screening and evaluation methods of small-molecule inhibitors of PTKs with a view to promote the study of PTKs. Key words:Protein-tyrosine kinases;Antitumordrugs;Small-molecule inhibitors;Inhibitors screening Chinese Library Classification （CLC ）:R730.5R915Document code:B Article ID:1673-6273(2010)16-3134-04 *基金项目：国家杰出青年科学基金资助（No 30725046） 作者简介：刘振凯（1983-），男，硕士。研究方向：分子药理学。E-mail ：lzkai111@https://www.360docs.net/doc/911951087.html, △通讯作者：耿美玉（1963-），研究员、博士生导师。E-mail ：mygeng@https://www.360docs.net/doc/911951087.html, (收稿日期:2010-05-07接受日期：2010-06-01) 恶性肿瘤是严重威胁人类生命和健康的疾病。目前，临床上常用的抗肿瘤药物主要是细胞毒类药物，这类药物大多存在难以避免的选择性差、毒副作用强、易产生耐药等缺点[1]。近年来，随着生命科学研究的飞速发展，恶性肿瘤细胞内的信号转导、 细胞周期的调控、细胞凋亡的诱导、血管生成以及细胞与胞外基质的相互作用等各种基本过程正在被逐步阐明，给抗肿瘤药物的研发理念带来了巨大转变。以一些与肿瘤细胞分化增殖相关的细胞信号转导通路的关键酶/蛋白作为药物靶点，筛选发现选择性强、高效、低毒的新型抗癌药物已成为当今抗肿瘤药物研究开发的重要方向[2]。 蛋白酪氨酸激酶是一类具有酪氨酸激酶活性的蛋白质，它们能催化ATP 分子上的γ-磷酸基转移到底物蛋白的酪氨酸残基上，使其发生磷酸化。酪氨酸激酶分为受体型和非受体型两种。受体酪氨酸激酶是一种单次跨膜蛋白，目前至少已有近六十种分属20个家族的受体酪氨酸激酶被识别。不同的受体酪氨酸激酶和配体结合后，受体自身发生二聚化或结构重排，并进一步使受体胞内区特异的酪氨酸残基发生自身磷酸化或交叉磷酸化，从而激活下游的信号转导通路[3]。它们在信号由胞外转导至胞内的过程中发挥重要的作用。而非受体酪氨酸激酶是一种胞浆蛋白，现已经确认的有约30种，分为10大家族。蛋白酪氨酸激酶在细胞信号转导通路中占据了十分重要的地位， 调节细胞生长、分化、死亡等一系列生理生化过程。蛋白酪氨酸激酶功能失调则引发生物体内一系列疾病。大量资料表明，超过50%的原癌基因和癌基因产物都具有蛋白酪氨酸激酶活性，它们的异常激活或过度表达将导致细胞无限增殖，周期紊乱，最终导致肿瘤的发生发展[4]。 同时，酪氨酸激酶调控异常还与肿瘤的侵袭、 转移，肿瘤新生血管生成，肿瘤化疗抗性等密切相关。事实上，以酪氨酸激酶为靶点进行抗肿瘤药物的开发已成为国际研究的前沿。 1酪氨酸激酶抑制剂的开发策略 目前酪氨酸激酶抑制剂的开发策略主要分为胞外、胞浆和核内三个层面：细胞外策略主要是针对于受体型，配体与受体的生物拮抗剂以及特异性抗体，通过拮抗配体和受体的相互作用，抑制酪氨酸激酶的激活[5]；胞浆内策略主要分为抑制激酶区的激酶活性和拮抗酪氨酸激酶与其下游信号分子的相互作用两个方面[6]；核内策略主要是利用miRNA 降解或者干扰酪氨酸激酶的mRNA ，抑制激酶的蛋白表达而达到抑制激酶活性的目的[7,8]。其中研究最多的是抑制激酶区激酶活性的小分子抑制剂，而本文也主要是针对这部分抑制剂的研究方法进行探讨。酪氨酸激酶的自磷酸化过程和催化下游信号分子磷酸化的过程都涉及到ATP 上磷酸基团的转移，这一反应过程是酪氨酸 3134··
牛奶中酪蛋白的提取与分析
实验题目：牛奶中酪蛋白的提取与分析实验材料：牛奶 小组成员： 实验时间：
一：实验题目：牛奶中酪蛋白的提取与分析 二：报告撰写者 三、小组成员 实验仪器 温度计、布氏漏斗（*）、pH试纸（*）、抽滤瓶（*）水浴锅、烧杯、量筒、表面皿（*）、电子天平（*）、2个1000ml的容量瓶（*）、2张醋酸纤维薄膜（2cm×8cm 厚度120nm）成品（*）、培养皿9—10cm（*）、毛细管（*）、尺子、铅笔、单面刀片（*）、镊子、普通滤纸（*）、电泳槽、玻璃板8cm ×12cm（*）、752型分光光度计（*）、细布（*）、、、的移液管、试管、试管架、 四、实验材料 牛奶（蒙牛特仑苏和伊利金典） 五、实验试剂 特仑苏400ml、金典200ml、巴比妥（*）、巴比妥钠（*）、氨基黑10B（*）、50ml甲醇AR（*）、100ml冰醋酸AR（*）、95%的乙醇250ml（*)、95%的乙醚100ml（*）、L的乙酸100ml（*）、L的乙酸钠100ml（*）、25g氢氧化钠固体（*）标准酪蛋白、15mg五水硫酸铜（*）、60mg酒石酸钾钠（*）所需试剂配制方法： 乙醇乙醚混合液的配制： 10ml95%的乙醇 10ml95%的乙醚 乙醇钠缓冲液的配制： 配制乙醇乙醚1:1的混
L 的乙酸51ml L 的乙酸钠49ml 巴比妥钠缓冲液的配制： 巴比妥 巴比妥钠 染色液的配制： 氨基黑10B 50ml 甲醇AR 10ml 冰醋酸AR 漂洗液的配制： 45ml95%乙醇AR 5ml 冰醋酸AR 蒸馏水 透明液的配制： 25ml 的冰醋酸AR 75ml 的无水乙醇AR L 氢氧化钠溶液的配制： 16g 的氢氧化钠固体定容至1000ml 10%氢氧化钠溶液的配制： 5g 的氢氧化钠固体定容至50ml 双缩脲试剂的配制： 15mg 五水硫酸铜 配制巴比妥钠缓冲液（,./L ）, 将上 +40ml 蒸馏水， 混匀既得染 配制的乙酸钠缓冲液（l ） 混匀得染色液 混匀得透明液 溶于5ml 蒸馏水，在搅拌情况下，加入10%氢氧化钠溶液3ml ，用
蛋白酪氨酸激酶综述
蛋白酪氨酸激酶综述 目前至少已有近六十种分属20个家族的受体酪氨酸激酶被子识别。所有受体酷氨酸激酶都属于I型膜蛋白，其分子具有相似的拓朴结构：糖基化的胞外配体结合区，疏水的单次跨膜区，以及胞内的酪氨酸激酶催化结构域及调控序列。不同受体酪氨酸激酶结合，将导致受体发生三聚化，并进一步使受体胞内区特异的受体酪氨酸残基发生自身磷酸化或交叉磷酸化，从而激活下游的信号转导通路。许多肿瘤的发生、发展都与酪氨酸激酶的异常表达有着极其密切的联系，下面将对几类与肿瘤的发生发展最为密切的受体酪氨酸激酶的研究迸展做一简介。 一、表皮生长因子受体（Epidermal grovth factor receptor, EGFR）家族 EGFRPE包括EGFR、ErbB2、ErbB4等4个成员，其家族受体酪氨酸激酶（RTK）以 单体形式存在，在结构上由胞外区、跨膜区、胞内区3个部分组成，胞外区具有2个半氨酸丰富区，胞内区有典型的ATP结合位点和酪氨酸激酶区，其酪氨酸激酶活性在调节细胞增殖及分化中起着至关重要的作用。 人的egfr基因定位于第7号染色体的短臂（7p12.3-p12.1），它编码的产物EGFR由1210个氨基酸组成，蛋白分子量约为170kDa，其中，712-979位属于酪氨酸激酶区。EGFR的专一配体有EGF、TGF、amphiregulin,与其他EGFR家庭成员共有的配体有（cellulin(BTC)、heparin-binding EGF(HB-EGF)、Epiregulin(EPR) ）等。 EGFR在许多上皮业源的肿瘤细胞中表达，如非小细胞性肺癌，乳腺癌、头颈癌，膀胱癌，胃癌，前列腺癌，卵巢癌、胶质细胞瘤等。另外，在一些肿瘤如恶性胶质瘤、非小细胞性肺癌、乳腺癌、儿童胶质瘤、成神经管细胞瘤及卵巢癌等中还可检测到EGFR缺失。最为常见的EGFR缺失突变型是EGFRⅧ，EGFR Ⅷ失去了配体结合区，但是可自身活化酪氨酸激酶，刺激下游信号通路的激活，而不依赖于与其配全结合。EGFR在许多肿瘤中的过表达和/或突变，借助信号转导至细胞生长失控和恶性化。另外，EGFR的异常表达还与新生血管生成，肿瘤的侵袭和转移，肿瘤的化疗抗性及预后密切相关。EGFR高表达的肿瘤患者，肿瘤恶性程度高，易发生转移，复发间期短，复发率高，患者的存活期短。 ErbB2，又名HER-2/neu，是EGFR家族的第二号成员，ErbB2通过与EGFR家族中其它三位成员构成异源二聚体，而发挥生物学作用，尚未发现能与其直接结合的配体。编码ErbB2的基因neu最早从大鼠神经母细胞瘤中分离得到，人类体细胞内neu基因的同源基因，又称为HER-2或erbB2，位于人第17号染色体的长臂（17q21.1），它编码的产物ErbB2由1255个氨基酸组成，蛋白分子量约为185Kda，其中，720-987位属于酪氨酸激酶区。 ErbB2通常只在胎儿时期表达，成年以后只在极少数组织内低水平表达。然而在多种人类肿瘤中却过度表达，如乳腺癌（25-30%）、卵巢癌（25-32%、肺静癌（30-35%）、原发性肾细胞癌（30-40%）等。过度表达的原因主要是ErbB2基因扩增（95%）或转录增多（5%）。 1987年，Slamon等人首行先报道了ErbB2扩增和乳腺癌临床预后不良之间的显著关系，其显著性高于雌激素、孕激素等指标，并在以后的研究中得到大量证实。随后，ErbB2表达水平和乳腺癌治疗效果间的关系得到广泛研究，人们发现ErbB2高表达乳腺癌患者对他莫昔芬（tamoxifen）治疗、单独的激素疗法、以及环磷酰胺、甲氨喋呤、5-氟脲嘧啶联合化疗产生耐受。研究还表明，ErbB2在细胞的恶性转化中发挥重要作用，并能促进恶性肿瘤转移。ErbB2受体过度表达往往提示乳腺癌恶性程度高，转移潜力强，进展迅速，化疗缓解期短，易产生化疗和激素治疗抗性，生存率和生存期短，复发率高。 和ErbB4对肿瘤的作用目前尚不清楚，但在肿瘤形成模型的临床前研究发现，ErbB3、Erb3与EGFR、ErbB2共表达后会使肿瘤恶性程度明显增加。 二、血管内皮细胞生长因子受体（Vascular endothelial growth factor receptor, VEGFR）家族VEGFR家族的成员包括：VEGFR1（Flt-1）、VEGFR2（KDR/Flk-1）、VEGFR3（Flt-4）,这一家族的受体在细胞外存在着7个免疫球蛋白样的结构域，在胞内酪氨酸激酶区则含有一段亲水手插入序列。
牛奶中提取酪蛋白
牛奶中提取酪蛋白 [目的与要求] 1、了解等电点沉淀法 2、学习从牛奶中制备酪蛋白的方法 3、加深对蛋白质等电点性质的理解 [原理] 蛋白质是一种亲水胶体，在水溶液中蛋白质分子表面形成一个水化层。另外，蛋白质又是一种两性离子，在一定pH溶液能够维持一个稳定的状态。但是调节蛋白质溶液的pH值至等电点时，蛋白质会因失去电荷而变得不稳定，此时若再加脱水剂或加热，水化层被破坏，蛋白质分子就相互凝聚而析出。等电点沉淀法主要利用两性电解质分子在等电点时溶解度最低的原理，而多种两性电解质具有不同等电点而进行分离的一种方法。 牛乳中主要的蛋白质是酪蛋白含量约为35g/L。酪蛋白是一些含磷蛋白质的混合物，等电点为4.7。将牛乳的pH调至4.7时，酪蛋白就沉淀出来。用乙醇洗涤沉淀，除去脂类杂质后便可得到较纯的酪蛋白。 但单独利用等电点沉淀法来分离生化产品效果并不太理想，因为即使在等电点时，有些两性物质仍有一定的溶解度，并不是所有的蛋白质在等电点时都能沉淀下来，特别是同一类两性物质的等电点十分接近时。生产中常与有机溶剂沉淀法、盐析法并用，这样沉淀的效果较好。 本实验目的是使学生运用等电点沉淀法制备酪蛋白，从中加深对蛋白质等电点性质的理解。 [方法和步骤] 1、取预先放冰箱中冷却的消毒牛奶6mL，3 000r/min离心10min，除去脂肪层的乳液置50毫升烧杯内，加热至40℃左右，在搅拌下慢慢加入10mL左右预热的醋酸-醋酸钠缓冲液，此时混浊液中有大量絮状物沉下。冷至室温，3 000r/min离心10min，弃去上清液，得酪蛋白粗品。 2、用蒸馏水洗沉淀三次（每次5mL左右），3 000r/min离心10min，弃去上清液。 3、将沉淀置研钵中，研碎后，渐加5mL 95%乙醇，静置片刻，将全部悬浮液转移至布氏漏斗抽滤，抽干后的制品，用乙醇-乙醚混合液洗沉淀二次（每次5mL），最后用无水乙醚洗沉淀二次（每次5mL），抽干。 4、将沉淀摊开在表面皿上，风干，得酪蛋白制品（称重，记录）。 5、酪蛋白溶液的配制：称取酪蛋白0.1g，置10毫升烧杯中，加5mL 0.2mol/L氢氧化钠溶液，搅匀，隔水加热，溶解后转移至10毫升容量瓶中，用少量蒸馏水洗烧杯数次，洗液并入容量瓶中，最后加水至刻度处，摇匀，置冰箱中保存备用。 [结果与计算] 计算酪蛋白含量和得率： 1、含量：酪蛋白克数/100mL牛奶 2、 100 %? = 理论含量 测得含量 得率 式中理论含量3.5g/100mL牛奶
牛奶中酪蛋白的提取与分析培训讲学
牛奶中酪蛋白的提取 与分析
实验题目：牛奶中酪蛋白的提取与分析实验材料：牛奶 小组成员： 实验时间：
一：实验题目：牛奶中酪蛋白的提取与分析 二：报告撰写者 三、小组成员 实验仪器 温度计、布氏漏斗（*）、pH试纸（*）、抽滤瓶（*）水浴锅、烧杯、量筒、表面皿（*）、电子天平（*）、2个1000ml的容量瓶（*）、2张醋酸纤维薄膜（2cm×8cm 厚度120nm）成品（*）、培养皿9—10cm（*）、毛细管（*）、尺子、铅笔、单面刀片（*）、镊子、普通滤纸（*）、电泳槽、玻璃板8cm×12cm（*）、752型分光光度计（*）、细布（*）0.5ml、1.0ml、2.0ml、5.0ml 的移液管、试管、试管架、 四、实验材料 牛奶（蒙牛特仑苏和伊利金典） 五、实验试剂 特仑苏400ml、金典200ml、1.66g巴比妥（*）、12.76g巴比妥钠（*）、0.5g 氨基黑10B（*）、50ml甲醇AR（*）、100ml冰醋酸AR（*）、95%的乙醇250ml（*)、95%的乙醚100ml（*）、0.2mol/L的乙酸100ml（*）、0.2mol/L 的乙酸钠100ml（*）、25g氢氧化钠固体（*）标准酪蛋白、15mg五水硫酸铜（*）、60mg酒石酸钾钠（*） 所需试剂配制方法： 乙醇乙醚混合液的配制： 10ml95%的乙醇10ml95%的乙醚 配制乙醇乙醚1:1的混合
乙醇钠缓冲液的配制： 0.2mol/L 的乙酸51ml 0.2mol/L 的乙酸钠49ml 巴比妥钠缓冲液的配制： 巴比妥1.66g 巴比妥钠12.76g 染色液的配制： 0.5g 氨基黑10B 50ml 甲醇AR 10ml 冰醋酸AR 漂洗液的配制： 45ml95%乙醇AR 5ml 冰醋酸AR 蒸馏水 透明液的配制： 25ml 的冰醋酸AR 75ml 的无水乙醇AR 0.05mol/L 氢氧化钠溶液的配制： 16g 的氢氧化钠固体定容至1000ml 10%氢氧化钠溶液的配制： 5g 的氢氧化钠固体定容至50ml 双缩脲试剂的配制： 配制巴比妥钠缓冲液 +40ml 蒸馏水，混匀既得染 配制pH4.6的乙酸钠缓冲液 混匀得染色液 混匀得透明液 溶于5ml 蒸馏水，在搅拌情况下，
实验六-从淡奶粉中分离、鉴定酪蛋白和乳糖
实验六从淡奶粉中分离、鉴定酪蛋白和乳糖 教学要求: 1 掌握通过等电点分离蛋白质的原理和方法； 2 掌握蛋白质鉴定的特征反应； 3 掌握还原性糖的鉴定方法。 教学重点：掌握通过调节溶液体系的pH值利用等电点分离蛋白质。 教学难点：蛋白质和还原性糖鉴定反应的操作及其现象观察 教学时数：4 学时 一、实验目的 １、掌握分离蛋白质和糖的原理和操作方法； ２、掌握蛋白质的定性鉴定方法； ３、了解乳糖的一些性质。 二、实验原理 牛奶的主要成分是水、蛋白质、脂肪、糖和矿物质，其中，蛋白质主要是酪蛋白，而糖主要是乳糖。 蛋白质在等电点时溶解度最小，当把牛奶的ＰＨ值调到4.8时(酪蛋白的等电点),酪蛋白便沉淀出来。酪蛋白不溶于乙醇和乙醚，可用乙醇和乙醚来洗去其中的脂肪。 乳糖不溶于乙醇在滤去酪蛋白的清液中加入乙醇时，乳糖会结晶出来。 三、实验步骤 １、酪蛋白与乳糖的提取 ４g奶粉与80 mL 40℃温水调配均匀，以10%乙酸调节pH=4.7(用精密pH试纸测试)，
静置冷却，抽滤。 滤饼用6mL水洗涤，滤液合并到前一滤液中。滤饼依次用6mL95%乙醇，6mL乙醚洗涤，滤液弃去。滤饼即为酪蛋白，晾干称重。 在水溶液中加入2.5g碳酸钙粉，搅拌均匀后加热至沸，过滤除去沉淀，在滤液中加入1～2粒沸石，加热浓缩至8ml左右，加入10ml 95%乙醇（注意离开火焰）和少量活性炭，搅拌均匀后在水浴上加热至沸腾，趁热过滤，滤液必须澄清，加塞放置过夜，乳糖结晶析出，抽滤，用95%乙醇洗涤产品，晾干称重。 ２、酪蛋白的性质 缩二脲反应取10ml酪蛋白溶液，加入10% NaOH溶液2ml后，滴入1%CuSO4溶液1ml。振荡试管，观察现象(溶液呈蓝紫色)。 蛋黄颜色反应取10ml酪蛋白溶液，加入浓硝酸2ml后加热，观察现象（有黄色沉淀生成）。再加入10%NaOH溶液2ml，有何变化?(沉淀为橘黄色) 3、乳糖的性质 Fehling反应Ｆehling试剂A和Ｂ各3mL,混匀，加热至沸后加入0.5mL5%乳糖溶液，观察现象。 Tollen反应在2mLTollen试剂中加入0.5mL5%乳糖溶液，在80℃中加热，观察现象(有银镜生成)。 四、实验结果 品名性状产量收率
酪蛋白的提取与测定(参考资料)
牛乳中酪蛋白的制备与浓度测定 一、实验目的 1、学习从牛乳中分离酪蛋白的原理和方法 2、掌握等电点沉淀法提取蛋白质的方法 3、了解紫外吸收法测定蛋白质浓度的原理，熟悉紫外分光光度计的使用 4、学会用考马斯亮蓝结合法测定蛋白质浓度 二、实验原理 1、准备酪蛋白原理：牛乳中主要含有酪蛋白和乳清蛋白两种蛋白质，其中酪蛋白占了牛乳蛋白质的80%。牛乳在PH4.7时酪蛋白等电聚沉后剩余的蛋白质统称为乳清蛋白。酪蛋白是白色、无味的物质，不溶于水、乙醇等有机溶剂，但溶于碱溶液。乳清蛋白不同于酪蛋白，其粒子的水和能力很强，分散性高，在乳中呈高分子状态。本法利用等电点时溶解度最低的原理，将牛乳的PH调至4.7时，酪蛋白就沉淀出来。用乙醇洗涤沉淀物，除去脂类杂质后便可得到纯的酪蛋白。 2、紫外吸收法测定蛋白质浓度的原理：大多数蛋白质由于有酷氨酸和色氨酸的存在，在紫外光280nm有吸收高峰，可以进行蛋白质含量的测定。但是核酸在280nm也有吸收，干扰测定，不过核酸的最大吸收峰在260nm，通过测定在280nm和260nm时A的比值，然后通过计算消除核酸存在的影响，可以求得有核酸存在时蛋白质的浓度。 3、考马斯亮蓝结合法测定蛋白质浓度原理：考马斯亮蓝能与蛋白质的疏水微区相结合，这种结合具有高敏感性。考马斯亮蓝G250的磷酸溶液呈棕红色，最大吸收峰在465nm。当它与蛋白质结合形成复合物时呈蓝色，其最大吸收峰改变为595nm，考马斯亮蓝G250—蛋白质复合物的高消光效应导致了蛋白质定量测定的高敏感度。 在一定范围内，考马斯亮蓝G250—蛋白质复合物呈色后，在595nm下，吸光度与蛋白质含量呈线性关系，故可以用于蛋白质浓度的测定。 三、实验器材与试剂 1、制备酪蛋白： 烧杯、玻璃棒、量筒、精密PH试纸、离心机、布氏漏斗、表面皿、恒温水浴锅 牛奶、醋酸缓冲液、冰醋酸、95%乙醇、无水乙醚 2、紫外光吸收法： 紫外可见光分光光度计、容量瓶50ml(×1)、石英比色皿 0.9%NaCl、1mol/LNaOH溶液、1mol/L乙酸溶液 3、考马斯亮蓝法： 紫外可见光分光光度计、试管1.5cm×15cm(×9)、玻璃比色皿 牛血清白蛋白（0.1mg/ml）、考马斯亮蓝、0.9%NaCl 四、实验步骤
酪蛋白的提取
一、实验目的 1、掌握一种提取蛋白的方法。 2、掌握一种检测牛乳质量的方法。 二、实验原理 酪蛋白是乳蛋白质中最丰富的一类蛋白质，约占乳蛋白的80~82%，酪蛋白不是单一的蛋白质，是一类含磷的复合蛋白质混合物，以一磷酸酯键与苏氨酸及丝氨酸的羟基相结合。它还含有胱氨酸和蛋氨酸这两种含硫氨基酸，但不含半胱氨酸。它在牛乳中的含量约为35g/L，比较稳定，利用这一性质，可以检测牛乳中是否掺假。 酪蛋白在其等电点时由于静电荷为零，同种电荷间的排斥作用消失，溶解度很低，利用这一性质，经牛乳调到pH4.6，酪蛋白就从牛乳中分离出来。酪蛋白不溶于乙醇，这个性质被利用来从酪蛋白粗制剂中将脂类杂质除去。 三、仪器和试剂 仪器：温度计、布氏漏斗、pH 试纸、抽滤瓶、电炉、烧杯、量筒、表面皿、天平等。 试剂： 1. 95%乙醇、乙醚 2. pH4.6乙酸钠缓冲液0.2mol/L 3. 乙醇、乙醚混合液：乙醇∶乙醚=1∶1（体积比） 4. 市售牛乳 四、实验步骤 1.酪蛋白等电点沉淀 将100ml牛乳放到500ml烧杯中，加热至40℃左右的乙酸钠缓冲液，直到pH达4.6左右，用pH试纸或酸度计调试。将上述悬浮液冷却至室温，然后放置5min，用细布过滤，收集沉淀。 2.除脂类杂质 将上述沉淀用少量水洗数次，然后悬浮于30ml95%的乙醇中。将此悬浮液倾于布氏漏斗中，抽滤除去乙醇溶液，再倒入乙醇—乙醚混合液洗涤沉淀两次，最后再用一米洗涤沉淀两次，抽干。将沉淀从布氏漏斗中移去，在表面皿上摊开以除去乙醚，干燥后得到的是酪蛋白纯品。准确称重后，计算出每100ml牛乳所制备出的酪蛋白数量（g%），并与理论产量（3.5g%）相比较，求出实际获得百分率。 一、实验目的 酶是植物体内具有催化作用的蛋白质，植物体内的生化反应，一般都是在酶的作用下进行的，没有酶的催化反应，植物的生命也就停止了，因此对酶的研究是阐明生命现象本质中十分重要的部分。为要研究酶首先要将酶从组织中提取出来，加以分离、纯化，不同的研究目的对酶制剂的纯度要求也不相同，有些工作只需要粗的酶制剂即可，而有些工作则要求较纯的酶制剂，需根据不同情况区别对待。在酶的提取和纯化过程中，自始至终都需要测定酶的活性，通过酶活性的测定以监测酶的去向。 二、实验原理 （一）酶的提取 1.酶的存在位置? 存在于动植物以及微生物的细胞的各个部位。 2.如何将酶从细胞中分离? 从高等植物中提取酶常遇到一些实际问题，首先是细胞中含有许多种酶，每种酶的浓度又很低，只占细胞总蛋白质中的极小部分（叶中的双磷酸核酮糖羧化酶除外），而许多植物组织中蛋白质的含量又很低。此外，各种酶的存在状态不同，有在细胞外的外酶，在细胞内的内酶，内酶中又有与细胞器一定结构相结合的结合酶，也有的存在于细胞质中，提取时都应区别对待，作不
实验报告-从牛奶中分离酪蛋白
实验报告 一、实验名称：从牛奶中分离酪蛋白 二、实验目的： 1.学习从胶体中提取某一类物质的方法。 2.学习蛋白质的各种颜色反应及其原理。 三、实验原理： 1.蛋白质是两性化合物，溶液的酸碱性直接影响蛋白质分子所带的电荷。当调节牛奶 的pH值达到酪蛋白的等电点（pl）4.8左右时，蛋白质所带正、负电荷相等，呈电 中性，此时酪蛋白的溶解度最小，会以沉淀形式从牛奶中析出。 2.缩二脲反应原理：具有两个或两个以上肽键的化合物在碱性条件下与Cu2+反应,生 成红紫色的络合物。所有的蛋白质均有此显色反应。 3.蛋白黄色反应原理：硝酸将蛋白质分子中的苯环硝化，在加热状态下产生了黄色硝 基苯衍生物，再加碱颜色加深呈橙黄色。这是含有芳香族氨基酸特别是含有酪氨酸 和色氨酸的蛋白质所特有的颜色反应。 4.茚三酮反应原理：蛋白质与茚三酮共热，产生蓝紫色的还原茚三酮、茚三酮和氨的 缩合物。此反应为一切氨基酸及α-氨基酸所共有。 四、实验步骤及现象： 1.取50mL脱脂牛奶于150mL烧杯中，用热水浴加热至40℃，维持此温度，边搅拌 边加稀醋酸（1：9）溶液约2mL——有白色沉淀析出。 2.继续搅拌并使悬浊液冷却至室温，然后将混合物转入离心杯中，于3000r/min离心 15min。 3.离心完毕后，上清液倒入乳糖回收瓶中，沉淀用95%的乙醇（20ml）搅匀，然后用 布氏漏斗减压过滤，用乙醇-乙醚（1：1）混合液洗涤沉淀2次，每次约10ml，最 后用5ml乙醚洗涤沉淀一次，减压过滤至干——得到干燥的白色固体。 4.将干粉铺于表面皿上，称量并计算牛奶中酪蛋白含量。 5.称取0.5g酪蛋白，溶解于0.4M氢氧化钠溶液的生理盐水（5mL）中，然后滴加3-4 滴1%硫酸铜溶液，振荡试管——溶液变成紫色。 五、实验数据： 空表面皿的质量m0 =28.15g 表面皿与酪蛋白的总质量m1 =31.78g 牛奶中酪蛋白的质量m= m1 - m0 =3.63g 六、讨论与感想： 1.牛奶是一种胶体，在正常情况下是均一稳定的，要想分离出其中的某一成分，就应 该想办法使这种成分变成沉淀析出。通过本次实验，我知道了可以通过调节胶体的 酸碱性，来改变蛋白质分子所带电荷，使其达到等电点。此时蛋白质分子间的电荷 作用力最小，分子间没有了间隙，浮力减小，蛋白质就会沉淀。而实验中50ml牛 奶和2ml稀醋酸（1：9）所配成的混合液的pH恰好在4.8左右，正好是蛋白质的
酪蛋白的提取与测定
牛乳中酪蛋白得制备与浓度测定 一、实验目得 1、学习从牛乳中分离酪蛋白得原理与方法 ２、掌握等电点沉淀法提取蛋白质得方法 3、了解紫外吸收法测定蛋白质浓度得原理,熟悉紫外分光光度计得使用 4、学会用考马斯亮蓝结合法测定蛋白质浓度 二、实验原理 1、准备酪蛋白原理:牛乳中主要含有酪蛋白与乳清蛋白两种蛋白质,其中酪蛋白占了牛乳蛋白质得80%、牛乳在PH４。7时酪蛋白等电聚沉后剩余得蛋白质统称为乳清蛋白、酪蛋白就是白色、无味得物质,不溶于水、乙醇等有机溶剂,但溶于碱溶液。乳清蛋白不同于酪蛋白,其粒子得水与能力很强,分散性高,在乳中呈高分子状态。本法利用等电点时溶解度最低得原理,将牛乳得PH调至4。７时,酪蛋白就沉淀出来。用乙醇洗涤沉淀物,除去脂类杂质后便可得到纯得酪蛋白。 2、紫外吸收法测定蛋白质浓度得原理:大多数蛋白质由于有酷氨酸与色氨酸得存在,在紫外光280nm有吸收高峰,可以进行蛋白质含量得测定。但就是核酸在２80nm也有吸收,干扰测定,不过核酸得最大吸收峰在２６0nm,通过测定在28０nm与260ｎｍ时Ａ得比值,然后通过计算消除核酸存在得影响,可以求得有核酸存在时蛋白质得浓度。 3、考马斯亮蓝结合法测定蛋白质浓度原理:考马斯亮蓝能与蛋白质得疏水微区相结合,这种结合具有高敏感性。考马斯亮蓝Ｇ250得磷酸溶液呈棕红色,最大吸收峰在465nm、当它与蛋白质结合形成复合物时呈蓝色,其最大吸收峰改变为5９5nｍ,考马斯亮蓝G２5０—蛋白质复合物得高消光效应导致了蛋白质定量测定得高敏感度。 在一定范围内,考马斯亮蓝G250—蛋白质复合物呈色后,在595nm下,吸光度与蛋白质含量呈线性关系,故可以用于蛋白质浓度得测定。 三、实验器材与试剂 1、制备酪蛋白: 烧杯、玻璃棒、量筒、精密PH试纸、离心机、布氏漏斗、表面皿、恒温水浴锅 牛奶、醋酸缓冲液、冰醋酸、9５%乙醇、无水乙醚 ２、紫外光吸收法: 紫外可见光分光光度计、容量瓶50ml(×1)、石英比色皿 0.9％NaＣl、1ｍoｌ／LNaOH溶液、1ｍol/Ｌ乙酸溶液 3、考马斯亮蓝法: 紫外可见光分光光度计、试管1．5cm×１5cm(×9)、玻璃比色皿 牛血清白蛋白(0.1ｍg／ｍl)、考马斯亮蓝、0。9%ＮaCl 四、实验步骤 制备酪蛋白 1、将20mL pH４。７得醋酸-醋酸钠缓冲液预热至40℃ ２、将2０ｍＬ牛奶加热至４0℃,在搅拌下缓慢地加入20ｍL预热得ｐH4。7得醋酸—醋酸钠缓冲液 3、用精密pH试纸调pＨ至4.7,可见溶液变为乳白色悬浮液 ４、待悬浮液冷却至室温,400０ｒｐm离心5min,弃上清,得酪蛋白粗制品 5、用蒸馏水洗沉淀3次,3000rｐm离心5min,弃上清
实验二十四从牛乳中分离酪蛋白
实验二十四从牛乳中分离酪蛋白 实验二十四从牛乳中分离酪蛋白 1、目的 掌握从牛乳中分离酪蛋白的原理，学会操作方法。 2、原理 牛乳中含有多种蛋白质，它们有着不同的性质，在脱脂牛乳的蛋白质中酪蛋白约占80%，酪蛋白是一类含磷蛋白质的复杂混合物。利用等电点时溶解度最低的原理，将牛乳 的pH 调到4.7（酪蛋白的等电点）时，酪蛋白就沉淀析出。再用乙醇和乙醚洗涤沉淀， 除去脂类杂质，便可制得纯酪蛋白。 3、实验材料与仪器 3.1材料 新鲜牛乳 （1）95%乙醇 （2）乙醚 （3）0.2 mol/L醋酸溶液 （4）0.2 mol /L pH 4.7醋酸–醋酸钠缓冲液，配制方法如下：先分别配制A 液 和B 液： A 液（0.2 mol / L 醋酸钠溶液）称取分析纯醋酸钠（NaAc ·3H 2O ）27.22g 溶于蒸馏水中，定容至1000 ml。 B 液（0.2 mol / L 醋酸溶液）称取分析纯冰醋酸（含量大于99.8%）12.0g 溶于蒸馏水中，定容至1000 ml。 取A 液885 ml 和B 液615 ml 混合，即得pH 4.7 的醋酸－醋酸钠缓冲液1500 ml 。 3.2仪器 恒温水浴、普通离心机、精密pH 试纸或酸度计、布氏漏斗、抽滤瓶、表面皿、离心 管（80 ml、量筒、烧杯（100 ml）、玻棒、电子天平 4、操作步骤
（1）取30 ml鲜牛乳，置100 ml烧杯中，加热至40 ℃。在搅拌下慢慢加入预热至40 ℃、pH 4.7的醋酸–醋酸钠缓冲溶液40 ml，用精密pH 试纸或酸度计检查pH ，再用0.2 mol/L醋酸溶液调至pH 4.7，静置冷至室温。 （2）悬浮液出现大量沉淀后，转移至离心管中，在3 500 r /min下离心10 min，弃去上清液，所得沉淀为酪蛋白的粗制品。 （3）用40 ml 蒸馏水洗涤沉淀，将沉淀搅起，同上离心分离，弃去上清液。加入30 ml 95%乙醇，把沉淀充分搅起至成悬浊液，将其转移到布氏漏斗中抽滤，先用30 ml 95%乙醇洗涤，再用30 ml乙醚洗涤，最后抽干制得酪蛋白。 （4）将酪蛋白白色粉末摊在表面皿上风干，于电子天平称重M 。 5、计算 X=M/V 式中：M---酪蛋白白色粉末的重量（g ） V---鲜牛乳体积（ml ）
受体酪氨酸激酶RTK介绍
1、受体酪氨酸激酶(receptor tyrosine kinase, RTKs) RTKs是最大的一类酶联受体，它既是受体，又是酶，能够同 配体结合，并将靶蛋白的酪氨酸残基磷酸化。所有的RTKs都是由三 个部分组成的：含有配体结合位点的细胞外结构域、单次跨膜的疏 水α螺旋区、含有酪氨酸蛋白激酶（RTK）活性的细胞内结构域。 已发现50多种不同的RTKs,主要的几种类型包括： ①表皮生长因子（epidermal growth factor, EGF）受体； ②血小板生长因子（platelet-derived growth factor, PDGF）受体和巨噬细胞集落刺激生长因子（macrophage colony stimulating factor, M-CSF）； ③胰岛素和胰岛素样生长因子-1 （insulin and insulin-like growth factor-1, IGF-1）受体； ④神经生长因子（nerve growth factor, NGF）受体； 各类受体酪氨酸激酶 ⑤成纤维细胞生长因子（fibroblast growth factor, FGF） 受体； ⑥血管内皮生长因子（vascularendothelial growth factor, VEGF）受体和肝细胞生长因子（hepatocyte growth factor, HGF）受体等。 受体酪氨酸激酶在没有同信号分子结合时是以单体存在的，并 且没有活性；一旦有信号分子与受体的细胞外结构域结合，两个单 体受体分子在膜上形成二聚体，两个受体的细胞内结构域的尾部相 互接触，激活它们的蛋白激酶的功能，结果使尾部的酪氨酸残基磷 酸化。磷酸化导致受体细胞内结构域的尾部装配成一个信号复合物（signaling complex）。刚刚磷酸化的酪氨酸部位立即成为细胞内 信号蛋白（signaling protein）的结合位点，可能有10～20种不 同的细胞内信号蛋白同受体尾部磷酸化部位结合后被激活。信号复 合物通过几种不同的信号转导途径，扩大信息，激活细胞内一系列
牛奶中酪蛋白的制备
牛奶中酪蛋白的制备 一、实验目的 1. 学习从牛奶中制备酪蛋白的原理和方法。 2. 掌握等电点沉淀法提取蛋白质的方法。 二、实验原理 利用酪蛋白的等点点为4.7，所以调节牛奶的pH4.7使酪蛋白沉淀洗出。等电点是调节溶液的pH,使蛋白质所带的正电荷和负电荷恰好相等，总净电荷为零，以两性离子存在，不想阳极移动也不想阴极移动，此溶液的pH称为蛋白质的等电点。酪蛋白不溶于乙醇、乙醚等试剂。因而加入乙醇乙醚洗涤沉淀物除去脂类杂质后便可得到纯酪蛋白。 三、实验材料、试剂与仪器 （一）材料与试剂 95%乙醇、新鲜牛奶、乙醇-乙醚混合液（乙醇：乙醚=1：1） 0.2mol/L pH4.7醋酸-醋酸钠缓冲液 A液：0.2mol/L醋酸钠溶液称NaAC·3H2O 27.22g，定容至1000 mL。 B液：0.2mol/L醋酸溶液，称优纯醋酸（含量大于99.8%）6.0g定容至500 mL。 取A液590mL，B液410mL混合即得pH 4.7的醋酸-醋酸钠缓冲液1000 mL。 （二）器具 离心机、抽滤装置、精密pH试纸、玻璃棒、量筒、恒温水浴 四、实验步骤 （一）酪蛋白的粗提 100mL牛奶加热至40℃。在搅拌下慢慢加入预热至40℃、pH4.7的醋酸缓冲液100mL，用精密pH试纸或酸度计调pH至4.7。将上述悬浮液冷却至室温。离心15分钟（3000 r /min）。弃去清液，得酪蛋白粗制品。 （二）酪蛋白的纯化 1. 用水洗涤沉淀3次，离心10分钟（3 000r/min），弃去上清液。 2. 在沉淀中加入30mL乙醇，搅拌片刻，将全部悬浊液转移至布氏漏斗中抽滤。用乙醇-乙醚混合液30 mL洗沉淀2次。最后用乙醚洗沉淀2次，抽干。 3. 将沉淀摊开在表面皿上，风干；得酪蛋白纯品。 （三）准确称重，计算含量和得率。
牛奶中酪蛋白含量的测定
牛奶中酪蛋白的提取及含量测定 一、实验原理 1、牛乳的主要成分：碳水化合物（5%）、脂类（4%）、蛋白质（3.5%）、维生素、微量元素（Ca、P等矿物质）、水（87%） 牛奶中的糖主要是乳糖。乳糖是一种二糖，它由D?半乳糖分子和D?葡萄糖分子通过P -1,4-糖昔键连接而成。乳糖溶于水，不溶于乙醇，当乙醇混入乳糖水溶液中时，乳糖会结晶出来，从而达到分离的目的。 牛奶中的蛋白质主要是酪蛋白和乳清蛋白两种，其中酪蛋白占了牛乳蛋白质的80%。酪蛋白是白色、无味的物质，不溶于水、乙醇等有机溶剂，但溶于碱溶液。而乳清蛋白水合能力强，分散性强，在牛乳中呈高分子状态。 2、等电点沉淀法： 在等电点时，蛋白质分子以两性离子形式存在，其分子净电荷为零（即正负电荷相等），此时蛋白质分子颗粒在溶液中因没有相同电荷的相互排斥，分子相互之间的作用力减弱，其颗粒极易碰撞、凝聚而产生沉淀，所以蛋白质在等电点时，其溶解度最小，最易形成沉淀物。酪蛋白的等电点为4.7左右（不同结构的酪蛋白等电点有所不同），本实验中将牛乳的pH调值4.7时，酪蛋白就沉淀出來。 市售牛奶通常会添加耐酸碱稳定剂來增加粘稠度，以致即使pH调至等电点酪蛋白也沉淀的很少，故实验时可将pH稍微调过多一点再调回等电点。同时，市售牛奶由于生产过程通常导致酪蛋白组分发生变化，因而使pl偏离了 4.7,通常偏酸。3、酪蛋白的提纯 根据乳糖、乳清蛋白等和酪蛋白的溶解性质差异，可以用纯水洗涤来除去乳糖、乳清蛋白等溶于水的杂质，再用乙醇除去脂类，然后过渡到用乙瞇洗涤，由于乙瞇很快挥发，最终得到纯粹的酪蛋白结晶。 4、蛋白质含量的测定（考马斯亮蓝结合法） 考马斯亮蓝能与蛋白质的疏水微区结合，这种结合具有高敏感性。考马斯亮蓝G520的磷酸溶液呈棕红色，最大吸收峰在465nm o当它与蛋白质结合形成复合物时呈蓝色，其最大吸收峰变为595nm o在一定范围内，考马斯亮蓝G520- 蛋白质复合物呈色后，在595nm下，吸光度与蛋白质含量呈线性关系，故可以测定蛋白质浓度。 二、实验器材与试剂 1、器材：恒温水浴锅、离心机、抽滤装置、蒸发皿、精密pH试纸、旋涡混合器、紫外分光光度计、试管四、5mL吸管、50mL容量瓶、100mL ft筒、电子分析天平 2、试剂：鲜牛奶、pH4.7醋酸■醋酸钠缓冲溶液、乙醇■乙艇混合液（95%乙醇、无水乙瞇体积比1： 1）、0.9%NaCl溶液、标准蛋白液（0.1mg/mL牛血清蛋白）、考马斯亮蓝G520染液 三、实验操作记录 1、酪蛋白的制备 将20mL牛奶盛于100mL的烧杯中加热到40*C,在搅拌下慢慢加入预热至40?C、pH4.7的醋酸缓冲溶液20mLo用冰醋酸调节溶液pH至4.7,此时即有大量的酪蛋白沉淀析出。将上述悬浮液冷却至室温，离心Smin (4000r/min),弃去上清液，沉淀即为酪蛋白粗品。
牛乳中酪蛋白的分离及其特性研究
212《乳业科学与技术》2010年第5期（总第144期） 牛乳中酪蛋白的分离及其特性研究 牛欣，何迎春 西南大学食品科学学院，重庆 400716 摘 要：将鲜乳高速离心分离得到酪蛋白。并以分离得到的酪蛋白为原料，从流变学特性、粒径、Zeta 电位和透光度等几个指标研究了其在不同pH下的变化情况。试验结果表明：在pH值5.0~7.0范围内，Zeta电势值（绝对值）、电导率值和粘度都是随着pH值的增大而增大，而酪蛋白胶粒的粒径先增大后减小，在pH值5.8和6.2时最小。分散稳定性分析仪测定结果显示，酪蛋白溶液在pH 6.2到pH 6.6时最稳定。进一步的分析表明，这种现象与其微观结构的变化有关。 关键词：酪蛋白；稳定性；分离 中图分类号：TS252.1 文献标识码：A 文章编号：1671-5187(2010)05-0212-04 The Separation and Particularities Research of Casein in Milk Niu Xin, He Yingchun College of Food Science, Southwest University, Chongqing 400716, China Abstract: To centrifugalize fresh milk at a high speed, getting the casein. Taking the casein which has been centrifugalized as raw material, we do a research on its change history in different pH in terms of rheology characteristics, grain diameter, Zeta electric potential, and transmittance. The result shows that when the pH ranges from 5.0 to 7.0, the Zeta potential number and the electrical conductivity escalate along with the pH number. The grain diameter of casein first increases and then decreases, it reaches its minimum between pH 5.8 to pH 6.2. However, the viscosity is gradually increases. The stability measurement result shows the casein solution is most stable when the pH ranges from 6.2 to 6.6, which is identical with previous measurement result. Further analysis shows that this phenomenon has a close relationship with the change of micromechanism. Key words: casein, stability, isolation 酪蛋白是牛乳中的最主要的蛋白质，含量约为26 g/L，占牛乳中蛋白质总量的80 %，常温下在水中可溶解0.8 %~1.2 %，溶于稀碱和浓酸中，能吸收水分，当浸入水中则迅速膨胀。蛋白具有磷酸化作用和两性特征，在乳中以酪蛋白酸钙-磷酸钙复合胶束的形式存在，胶束中含有92 %的蛋白质，以磷酸钙为主的无机组分占8 %。在牛乳pH值（6.6~6.7）下，酪蛋白胶束带负电荷，吸引乳中带正电荷的离子集中于胶束表面，构成扩散双电层，有着良好的稳定性。目前主要作为食品原料或微生物培养基使用，利用蛋白质酶促水解技术制得的酪蛋白磷酸肽具有防止矿物质流失、预防龋齿，防治骨质疏松与佝偻病，促进动物体外受精，调节血压，治疗缺铁性贫血、缺镁性神经炎等多种生理功效，尤其是其促进常量元素（Ca、Mg）与微量元素（Fe、Zn、Cu、Cr、Ni、Co、Mn、Se）高效吸收的功能特性使其具有“矿物质载体”的美誉[1-4]。 但是，乳制品易出现脂肪上浮、蛋白质沉淀、 收稿日期：2010-07-18； 作者简介：牛欣，男，硕士研究生，研究方向为食品安全与质量控制。絮凝或分层等胶体分散体系不稳定现象，严重影响产品的质量。而解决这些质量问题的核心就是要控制酪蛋白的稳定性，因此对酪蛋白胶束的研究变得十分重要。本文将通过测定粒径、透光度、电导率、Zeta电位、粘度等来阐明产品的稳定机制。而电导率、Zeta电位是表征胶体分散体系稳定性的重要指标，能够从胶体粒子的微观带电特性说明胶体的稳定性。进而对乳制品的生产提供一定的理论指导。 1材料与方法 1.1材料与试剂 鲜牛乳由泰安宝乐乳品厂提供； 其他试剂均为分析纯。 1.2试验仪器 TURBISCAN LAB分散稳定性分析仪（北京盛淮基业科技有限公司）；E-201-C-9型pH复合电极（上海理达仪器厂）；ACS-H1电子计重秤（凯丰集团有限公司）；DJS-1C数显电导率仪（上海雷磁新泾仪器有限公司）；JS94Hs微电泳仪（上海中晨数字技术有限公司）；BECKMAN J-30I高速冷冻离心机（USA）。