免疫组化 protocol 方法与原理大全
免疫组化（SP 法） 第一天 (5h)
准备：60℃ 烘片2-4h
1. 二甲苯脱蜡1 30min
2. 二甲苯脱蜡2 30min
3. 100% 乙醇 10min 2次
4. 95% 乙醇 3min
5. 85% 乙醇 3min
6. 75% 乙醇 3min
7. ddH 20 1min 2次 轻晃以防掉片
8. 抗原修复：
使用1L 烧杯，9ml 柠檬酸（0.1M 现配）溶液和41ml 柠檬酸钠（0.1M ）加450ml ddH 20（ph=6）罩上锡纸，封烧杯口，扎洞若干，煮沸20min （可先煮沸再放片子，也可以先放片子再一起煮，温度先调至420℃多，煮沸后调到250℃左右，计时15-20min ）之后自然冷却（30-40℃） 9ml 柠檬酸配法：9ml ddH 20加0.18g 柠檬酸。可以直接称取0.18g 柠檬酸加41ml 柠檬酸钠加450ml 水
0.1M 柠檬酸钠配法：29.41g 柠檬酸钠加入1L 蒸馏水中，或14.7g 加入500ml 蒸馏水中
9. 3%H 202孵育10min （200ml
，盒子装，现配，用甲醇稀释30%H 202至3%H
202）以消除内源性过氧化物酶活性（内源性过氧化物酶能与HRP 反应，造成假阳性），PBS 冲洗3min 3次
10. 加试剂A （山羊血清，起到封闭作用）一滴（蓝色）室温孵育10-15min 盖盖防干，倾去勿洗，先甩再擦（试剂A,B,C 放在1号冰箱侧门，擦干玻片，放在湿盒里，盒子两侧不要放玻片，以防接触到盒壁，抗体流出，要求试剂刚好覆盖组织，全部滴完计时10min ，用黄枪头抹匀试剂）
11. 加一抗，4℃过夜，25-50ul 每个组织，一抗用PBS 稀释，4℃放置，加完一抗后，先不要盖盖，放到冰箱里后再盖盖
第二天(3h)
12.PBS 3min 3次（将1xPBS倒进盒子里，里面放架子，片子甩干后放进架子里）
13.加试剂B（黄色）室温孵育10-15min，盖盖（试剂B是生物素化的二抗，能与一抗结合）
14.PBS 3min 3次
15.加试剂C（橙黄色）室温孵育10-15min，盖盖（试剂C是HRP标记的链霉亲和素，一个亲和素可以与四个生物素非共价键结合，不可逆，结合紧密。因此试剂C与试剂B会结合）
16.PBS 3min 3次，置于ddH20中
17.DAB避光显色，显色后置于ddH20中（准备一个小烧杯，装有ddH20，DAB显色后在烧杯中洗下）DAB的配法：1. 关灯2. 取1号冰箱里的DAB①② 3. 取棕色EP管，12张片子约用1mlDAB，每张片子需3-4滴4. 1ml DAB②加一滴DAB①（剧毒），配好后避光放置
18.苏木精1min左右（苏木精伊红避光，苏木精配好后需要用纱布过滤）
19.流水冲洗2min
20.盐酸酒精分化2-3s（快速涮两下）
21.流水冲洗反蓝20min
22.75% 乙醇4min
85% 乙醇4min
95% 乙醇4min
100% 乙醇4min
23.二甲苯1 10min
24.二甲苯2 10min
25.封片，鼠房抽屉里有中性树胶，长枪头沾取滴1-2滴（长盖玻片滴4滴）拿出片子，擦去背面多余的二甲苯，二甲苯易挥发，与中性树胶可溶，在组织旁滴上中性树胶后，立刻盖上准备好的盖玻片，放置通风处过夜晾干
病理科免疫组化在临床上的应用及其意义
病理科免疫组化在临床上得应用及其意义 免疫组化技术就是以免疫学得抗原抗体反应为其理论基础发展起来得一门方法学,在生物学领域尤其就是在医学得基础与临床研究中发挥重要得作用,对疾病尤其就是肿瘤得诊断、鉴别诊断及发病机制得研究提供了强有力得手段、免疫组化技术就是２0世纪70年代初Sｔeｒb Bergｅr 在酶标法得基础上发明得,80年代在外国开始应用于临床研究与诊断,90年代初在我国逐渐开始应用于疑难病例得诊断与鉴别诊断。随着新技术得不断发展,抗体种类从研发开始得十几种发展到目前数百种抗体应用于临床科研得各个领域,我国在临床病理诊断上可用抗体293种。由于抗体较昂贵,所以各院根据活检量与病种不同选择不同得抗体,这些抗体对大部分疑难病例得诊断起到重要得辅助作用、对病人得预后及指导治疗具有重要得意义。 一、目前常用得抗体分四大类 １。上皮性标记物:ＣＫhigh(AE3), CK loｗ,CＫ－paｎ,CK1９,ＣＫ7, CＫ20,EMＡ,CEA,－CA １5-３,SCLC , E—Ｃalｄeｈerin,CA125, Tg(甲状腺球蛋白) ,TTＦ—1?AＦP。这些抗体阳性,表明肿瘤组织起源于上皮组织,如果就是恶性肿瘤,就就是癌2?.间叶组织标记物:SMA ,Dｅsｍｉｎ,Ｖiｍｅｎtｉn,Lysｏzymｅ,AAＣT, CD68 MｙoD1,CＤ11７,这些抗体阳性,表明肿瘤组织起源于间叶组织,如果就是恶性肿瘤,就就是肉瘤、3?、神经及神经内分泌标记物:CgA ,Ｓｙnaptｏphyｓin,NSＥ,S－１00:NF (神经纤维丝蛋白),GFＡP,CD９9,CD56、 4淋巴细胞标志物: T ceｌl标记物:CD3, CＤ45ＲＯ, CD43,CＤ5, CD8,ＣD4,ALK,GｒａｎmB , CD５6 。?Ｂｃell标记物:CＤ—20 ,CD79a,CD2３, ＣD10,Ｋappa ,Laｍｂｄa ＣD2１CD38 ,CyｃlinD1 ,Bcl—2。?其它:LCA,ＣD1５,ＣD3０,MPO,CD3４,TｄＴ,这些抗体用于淋巴瘤33个亚型得诊断与鉴别诊断。? 二、目前开展得系列检查与意义 1。乳腺癌五项(ＥR、PR、C—ｅｒbB-２(Her－2)、Ki—6７、Ｐ53) ER、PR阳性,90％得病人对三苯氧胺类药物疗效好。C-ｅｒｂB-2阳性(2+—3+)可服用抗Her—２基因药物。如果ER与ＰR均阴性,Ｃ－eｒbB－2强阳性预示预后不好。 Ki—6７就是细胞生长指数,代表细胞周期中除G０期以外得细胞生长速度。Ｋi—67值越高表明肿瘤细胞生长越快,预后越不好。Ｐ5３就是广谱致癌基因,在许多肿瘤中都有表达,表达值越高预后越不好。据报道,国际上目前有抗P53基因阳性得药物用于治疗肿瘤。 2。垂体腺瘤功能六项检查 ＬH( 促黄体生成素),ＦSＨ(卵泡刺激素),ACTH(促肾上腺皮质激素),ＴSH( 促甲状腺素),PR Ｌ(泌乳素)GH(生长激素) 。根据某一种抗体阳性表达进行术后药物治疗。 ３.恶性肿瘤得Kｉ—6７与P53常规检查 目前得研究表明,大部肿瘤得复发、转移取决于Ki—67值与Ｐ５3值,而与肿瘤得组织得分型关系不就是十分密切,如中分化腺癌,如果Ki-6７与P５3值超过50％,预后不佳,相反,如肿瘤得组织分型为低分化腺癌,而Ki－67与P53值较低,预后也会较中分化或高分化癌得预后稍好。4?.GIST(胃肠道间质瘤)与EGIＳＴ(胃肠道外间质瘤)得诊断?GIＳT就是90年代新发现得肿瘤,过去均诊断为平滑肌瘤或平滑肌肉瘤,现在经过一组免疫组化可将其诊断,GIST得生物学形为一般无良性,因为小于２cｍ得ＧＩST偶而也有转移。其良恶性程度取决于肿瘤得大小与核分裂像,国际确定GI ＳT侵袭行为危险性得推荐方案如下: 危险程度大小核分裂数?很低〈2ｃm <５/５０HPＦ?低2－５cｍ〈５/５0HＰF 中等<5cm5-10cm 6—１0/5０ＨPF〈5/５0ＨＰF?高〉5cm＞10cm不计>5/50ＨＰF不计>10／50HPＦ?ＧIST得免疫组化结果为:ＣD1１7(+)、ＣD34(±)、S—100(±)Actin(±)、Deｓmｉn(—)、ＣD１17阳性可用格林卫治疗,且效果较好。
免疫组化技术全程原理
免疫组化技术全程原理 一、概念和常用方法介绍 1、定义 用标记的特异性抗体对组织切片或细胞标本中某些化学成分的分布和含量进行组织和细胞原位定性、定位或定量研究，这种技术称为免疫组织化学（immunohistochemistry）技术或免疫细胞化学（immunocytochemistry）技术。 2、原理 根据抗原抗体反应和化学显色原理，组织切片或细胞标本中的抗原先和一抗结合，再利用一抗与标记生物素、荧光素等的二抗进行反应，前者再用标记辣根过氧化物酶（HRP）或碱性磷酸酶（AKP）等的抗生物素（如链霉亲和素等）结合，最后通过呈色反应或荧光来显示细胞或组织中化学成分，在光学显微镜或荧光显微镜下可清晰看见细胞内发生的抗原抗体反应产物，从而能够在细胞爬片或组织切片上原位确定某些化学成分的分布和含量。 3、分类 1）按标记物质的种类，如荧光染料、放射性同位素、酶（主要有辣根过氧化物酶和碱性磷酸酶）、铁蛋白、胶体金等，可分为免疫荧光法、放射免疫法、免疫酶标法和免疫金银法等。 2）按染色步骤可分为直接法（又称一步法）和间接法（二步、三步或多步法）。与直接法相比，间接法的灵敏度提高了许多。 3）按结合方式可分为抗原-抗体结合，如过氧化物酶-抗过氧化物酶（PAP）法；亲和连接，如卵白素-生物素-过氧化物酶复合物（ABC）法、链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连结（SP）法等，其中SP法是比较常用的方法；聚合物链接，如即用型二步法，此方法尤其适合于内源性生物素含量高的组织抗原检测。 4、目前几种常用免疫组化方法简单介绍 1）免疫荧光方法 是最早建立的免疫组织化学技术。它利用抗原抗体特异性结合的原理，先将已知抗体标上荧光素，以此作为探针检查细胞或组织内的相应抗原，在荧光显微镜下观察。当抗原抗体复合物中的荧光素受激发光的照射后即会发出一定波长的荧光，从而可确定组织中某种抗原的定位，进而还可进行定量分析。由于免疫荧光技术特异性强、灵敏度高、快速简便，所以在临床病理诊断、检验中应用较广。 2）免疫酶标方法
免疫组化技术(原理、分类、步骤及主要试剂、设备准备)
免疫组化技术 原理 抗原抗体反应，即抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂 (荧光素、酶、金属离子、同位素) 显色来确定组织细胞内抗原(多肽和蛋白质)，对其进行定位、定性及定量的研究。 众所周知，抗体与抗原之间的结合具有高度的特异性。免疫组化正是利用这一特性，即先将组织或细胞中的某些化学物质提取出来，以其作为抗原或半抗原去免疫实验动物，制备特异性抗体，再用这种抗体（第一抗体）作为抗原去免疫动物制备第二抗体，并用某种酶（常用辣根过氧化物酶）或生物素等处理后再与前述抗原成分结合，形成抗原 - 一抗 - 二抗复合物，将抗原放大，由于抗体与抗原结合后形成的免疫复合物是无色的，因此，还必须借助于组织化学方法将抗原抗体反应部位显示出来（常用显色剂DAB显示为棕黄色颗粒）。通过抗原抗体反应及呈色反应，显示细胞或组织中的化学成分，在显微镜下可清晰看见细胞内发生的抗原抗体反应产物，从而能够在细胞或组织原位确定某些化学成分的分布、含量。组织或细胞中凡是能作抗原或半抗原的物质，如蛋白质、多肽、氨基酸、多糖、磷脂、受体、酶、激素、核酸及病原体等都可用相应的特异性抗体进行检测。 分类（常用） 1、免疫荧光方法 最早建立的免疫组织化学技术。它利用抗原抗体特异性结合的原理，先将已知抗体标上荧光素，以此作为探针检查细胞或组织内的相应抗原，在荧光显微镜下观察。当抗原抗体复合物中的荧光素受激发光的照射后即会发出一定波长的荧光，从而可确定组织中某种抗原的定位，进而还可进行定量分析。由于免疫荧光技术特异性强、灵敏度高、快速简便，所以在临床病理诊断、检验中应用比较广。 2、免疫酶标方法 免疫酶标方法是继免疫荧光后，于60年代发展起来的技术。基本原理是先以酶标记的抗体与组织或细胞作用，然后加入酶的底物，生成有色的不溶性产物或具有一定电子密度的颗粒，通过光镜或电镜，对细胞表面和细胞内的各种抗原成分进行定位研究。免疫酶标技术是目前定位准确、对比度好、染色标本可长期保存，适合于光、电镜研究等。免疫酶标方法的发展非常迅速，已经衍生出了多种标记方法，目前在病理诊断中广为使用的当属PAP法（过氧化物酶-抗过氧化物酶）、ABC法（卵白素-生物素-过氧化物酶复合物）、SP 法（链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶）、即用型二步法（聚合物链接）等。 3、免疫胶体金技术 免疫胶体金技术是以胶体金这样一种特殊的金属颗粒作为标记物。胶体金是指金的水溶胶，它能迅速而稳定地吸附蛋白，对蛋白的生物学活性则没有明显的影响。因此，用胶体金标记一抗、二抗或其他能特异性结合免疫球蛋白的分子(如葡萄球菌A蛋白)等作为探针，就能对组织或细胞内的抗原进行定性、定位，甚至定量研究。由于胶体金有不同大小的颗粒，且胶体金的电子密度高，所以免疫胶体金技术特别适合于免疫电镜的单标记或多标记定位研究。由于胶体金本身呈淡至深红色，因此也适合进行光镜观察。如应用银加强的免疫金银法则更便于光镜观察。 4、免疫铁蛋白法 5、放射免疫自显影法 标本 1、组织标本：石蜡切片（病理切片和组织芯片）、冰冻切片 2、细胞标本：组织印片、细胞爬片、细胞涂片
免疫组化操作步骤
免疫组化操作步骤集团标准化工作小组 #Q8QGGQT-GX8G08Q8-GNQGJ8-MHHGN#
免疫组化操作流程 试剂准备 1. PBS缓冲液（～）： NaCl 137mmol/L，KCl L，Na2HPO4 L， KH2PO4 L。 2. L柠檬酸盐缓冲液（CB，，1000ml）：柠檬酸三钠 3g，柠檬酸。即抗原修复液 : PBS+吐温-20（1000:1）洗液可全部运用PBST 4. 3% 甲醇-H2O2溶液：用30%H2O2和80%甲醇溶液配制。 5. 封片剂：中性树脂+二甲苯。 操作流程 免疫组织化学染色 SP法： 1. 脱蜡、水化： 脱蜡前，应将切片在60℃恒温箱中烘烤60~120分钟，观察石蜡应溶解。 从烤箱拿出切片后尽快置于二甲苯中浸泡30分钟，更换二甲苯后再浸泡30分钟； 无水乙醇中浸泡3分钟； 95%乙醇中浸泡3分钟； 70%乙醇中浸泡3分钟（我用80%）； 50%乙醇中浸泡3分钟； 自来水中浸泡3分钟；
梯度脱蜡 2. 抗原修复：（用于福尔马林固定的石蜡包埋组织切片） 高压热修复高压锅里放少许水，用一量杯或容器（大小能容纳玻片架为宜）装抗原修复液放入高压锅里一起煮沸，再放入玻片架，盖上不锈钢高压锅的盖子，将排气阀门套上，待听到阀门冒气时，即可倒计时2min，之后将玻片杯一起放入凉水中，静置15min，平衡至室温。电磁炉1000W 2min。 3.丢弃抗原修复液，将玻片浸泡在去离子水中（时间不限）可省略 4.用组织笔沿组织边缘画线（可与组织边缘留适当间隙），画完立即放入PBST溶液中浸泡3遍X3min（三个容器，每个容器3min，时间不限制）。 5. 3%H2O2滴加在切片上，室温静置15分钟(3%的H2O2用30%的 H2O2加双蒸水稀释10倍，现配现用。目的为阻断内源性过氧化物酶)； 6. PBST洗3次各3分钟(过三缸) 7. 滴加正常山羊血清封闭液,室温30分钟。用与一抗不同源的血清即可，本人用Western-blotting的含胎牛血清封闭液。 8. 甩去封闭液（注：不要冲洗），滴加一抗50ul（至少50ul否则易干片），4℃孵育过夜。4℃过夜后需在37℃复温45分钟（未验证：室温静置1小时或者4℃过夜或者37℃1小时。）。 9. PBST洗3次各3分钟；
病理科为什么要做免疫组化
龙源期刊网 https://www.360docs.net/doc/911955135.html, 病理科为什么要做免疫组化 作者：郑宏 来源：《学习与科普》2019年第15期 随着医学技术的快速发展，免疫组化也被越来越多的应用到了病理科检查里面。但是，很多病人在接受免疫组化时心里都是充满了疑惑的，其既不知道免疫组化是什么，也不明白自己为什么要接受免疫组化。甚至还有一部分病人认为医生让自己接受免疫组化就是为了挣钱，导致了医患矛盾的出现，对治疗工作的顺利展开造成了极大的阻碍。所以，接下来本文就对免疫组化及其原理进行了简单介绍，然后阐述了病理科为什么要安排病人进行免疫组化检查。 一、什么是免疫组化？ 所谓免疫组化实际上就是应用抗原抗体反应这一原理，通过化学反应来让标记抗体的显色剂显色对组织细胞里多肽和蛋白质等抗原进行定位、定性以及相对定量研究的一种新细胞化学技术。按照标记物种类的不同，免疫组织化学技术主要分为免疫荧光法、免疫酶法、免疫铁蛋白法、免疫金法及放射免疫自显影法等几种。 免疫组化的基本原理就是抗原抗体反应。抗原和抗体结合的时候会出现非常大的特异性，免疫组化就是通过此原理的有效利用，先完成细胞或者组织里面的相应化学物质制取，将其当成抗原或者半抗原，然后再利用免疫动物完成特异性抗体的获取，最后再通过这个特异性抗体去探测细胞或者组织里面是否有同类抗原存在。又因为抗原、抗体以及其复合物都是没有颜色存在的。所以，还需要通过组织化学的方法完成抗原抗体结合部位的着色，从而更加准确的完成对人体里面未知抗原的定位、定性以及定量研究工作，为后续的判断工作提供更有力的支持和保障，有效避免判断失误的情况发生。 二、病理科安排病人做免疫组化的原因？ 在最近这几年，随着各种特异性抗体的产生，通过传统的检查技术已经没有办法完成病情的准确判断了。以肿瘤研究为例，在免疫组化技术出现以前，对肿瘤的诊断和分类还局限于细胞水平，而引入免疫组化技术后，则使研究的深度提高到了生物化学水平、分子水平。同时免疫组化这一新的细胞化学技术还拥有特异性强、敏感性高、定位准确以及形态功能相结合等优点，可以帮助医生更为精准的完成病情判断，从而为后续治疗工作的展开提供更为强有力的依据。 首先，通过免疫组化可以让医生完全肿瘤来源的准确确认。我们身体器官以及组织里面的细胞，由于起源都是一样的，所以它们的形态结构也十分相似，很多时候根据形态根本没有办法准确的完成区分工作。仅仅通过肉眼进行分辨的话，会有极大可能因为主观性或者疏忽导致病情判断错误的情况出现，影响到后续的治疗工作，甚至有可能会对人们的身体健康造成更为恶劣的影响。而免疫组化这种方法则会对相应的细胞组织进行染色处理，将其情況更为直观的
免疫组化原理和步骤
免疫组化原理及步骤 免疫组化操作规程 一、实验原理与意义免疫组织化学又称免疫细胞化学，是指带显色剂标记的特异性抗体在组织细胞原位通过抗原抗体反应和组织化学的呈色反应，对相应抗原进行定性、定位、定量测定的一项新技术。它把免疫反应的特异性、组织化学的可见性巧妙地结合起来，借助显微镜（包括荧光显微镜、电子显微镜）的显像和放大作用，在细胞、亚细胞水平检测各种抗原物质（如蛋白质、多肽、酶、激素、病原体以及受体等）。 二、实验器材微波炉、吹风机、组化笔、湿盒、烤箱、振荡器、染缸、光学显微镜、纯木浆卫生纸、计时器和通风橱等。 三、试剂配制 1. 0.01 M PBS（pH 7.34 ）：9.0 g NaCl + 50 ml 0.2 M PB 加双蒸水至1000 ml ； 1000 ml 0.2M PB （pH 7.4）＝5.93 g NaH 2 PO 4 2·H 2 O ＋58.02 g Na 2 HPO 4 ·12H 2 O in 1000 ml 双蒸水或＝190 ml A + 810 ml B （A. 0.2 M NaH 2 PO 4 2·H 2 O ：15.6 g in 500 ml ddH 2 O ； B. 0.2 M Na 2 HPO 4 ·12H 2 O ：71.632 g in 1000 ml dH 2 O ）。 2. Citrate Buffered Saline （0.01 M 柠檬酸缓冲液， PH6.0 ）：28 ml A + 72 ml B + 200 ml ddH 2 O （A.Citrate acid
（柠檬酸）：10.5 g
加双蒸水至 1000 ml ； B.Citrate sodium （柠檬酸钠）： 29.41 g 加 双蒸水至 1000 ml ）。 3. 细胞通透液：由终浓度分别为 0.3% 双氧水和 0.5%Triton X-100 混合而成。配制方法是先用微波加热的 36 ml PBS ，再接着 加 120 ul TritonX-100, 并加热一儿，冷却至临用前加 0.4 ml 30 ％ H 2 O 2 。 4. 5％羊血清或封闭血清，用 PBS 稀释。 5. 含 0.03 ％ H 2 O 2 的 0.05 ％DAB （避光） ：用 20×DAB （1％， 10 mg/ml ）5 ul ＋0.1 ul 30% H 2 O 2 ＋95 ul PBS 。 6. 一抗、二抗均用 PBS 稀释。 7. Xylene 、梯度 Ethanol （100 ％×2、95％、80％、70％、50％）、 双蒸水、中性树胶（封裱剂）。 8. 苏木精染液： 四、操作步骤 1 、脱蜡、水化 60 ℃× 20 min →Xylene 2 × 10 minut ；es 80% ethanol 2 minutes ； 70% ethanol 2 minutes ； distilled water:5 min ； PBS 洗 3 次×3 min 。 1) 2) 3) 4) 5) 6) 7) 100% absolute ethanol ：2 ×5 minutes ； 95% ethanol 2 minutes ；
免疫组化操作方法原理步骤以及常见问题处理大总结
免疫组化操作方法、原理、步骤以及常见问题处理大总结 1、方法操作不难，最大的难处是出现异常结果时如何解决？这就需要掌握免疫组化实验原理，每一步知道为什么这样做，这样你才敢大胆地改革先前的不对的方法步骤。如抗体孵育条件主要是抗体浓度、温度、时间，这三者一般是相互成反比的（相对），其中浓度是最重要的先决条件，温度决定反应的速度、时间决定反应的量。就拿温度来说，可以有4度、室温、37度，我推荐4度最佳，反应最温和，背景较浅；而37度反应速度较快，时间较短；室温我不太提倡，除非你每次都把环境温度控制在一定的范围，否则，尽量选择前两者。 2、免疫组化最大的优势是定位和定性。相比于其他蛋白检测方法，免疫组化具有定性灵敏度高、定位较直接准确，是定位检测分析首选方法。尤其对于有些因子的转位研究十分有用。 3、免疫组化结果定量分析的前提是高质量的染色切片。免疫组化结果也能定量分析，但必须是背景染色浅而特异性染色较深的情况下，分析最为准确，这种原则可能也是我们日常审稿时判定研究结果的必备条件。 4、免疫组化实验一定要设置阳性对照和阴性对照。阳性对照一般是用肯定表达这种抗原的切片来做；阴性对照一般是用PBS或非一抗替代一抗来进行反应，其余步骤均一致。前者是排除方法和实验系统有无问题；后者是排除有无一抗外的非特异性染色。 5、免疫组化的应用广泛，是当前实验研究的最重要方法之一。如今发SCI论文时，明显感觉仅靠量化的数据来发文章很难，加一些形态学数据或图片，老外十分欢迎，可能是怕你学术造假吧。当然也不能做假阳性或假阴性结果。 6、免疫组化技术掌握与否的鉴定标准是同一切片或不同切片中不同抗原均从摸索浓度或条件而做出优良的染色切片。我在平时带教中就发现许多研究生把我已经摸索很成熟的反应条件、浓度、方法步骤，重复运用于同一性质的切片和同一种抗体，做出来后就觉得自己已经掌握了免疫组化方法，更换一种抗体后，居然连二抗的种属来源都拿错了。失败往往促进你去思考试验原理和过程，成功有时也加快你自傲。 7、实验方法需要动手+动脑。如今我还不敢说我在免疫组化什么都知道。我只所以今天敢在这里说这说那，这是因为我经过了反复的动手+动脑，把理论原理运用于实践，在把实践中发现的问题带到理论知识中去解决，最终把理论与实践融会贯通。 一、概念和常用方法介绍 1、定义用标记的特异性抗体对组织切片或细胞标本中某些化学成分的分布和含量进行组织和细胞原位定性、定位或定量研究，这种技术称为免疫组织化学（immunohistochemistry）技术或免疫细胞化学（immunocytochemistry）技术。 2、原理根据抗原抗体反应和化学显色原理，组织切片或细胞标本中的抗原先和一抗结合，再利用一抗与标记生物素、荧光素等的二抗进行反应，前者再用标记辣根过氧化物酶（HRP）或碱性磷酸酶（AKP）等的抗生物素（如链霉亲和素等）结合，最后通过呈色反应或荧光来显示细胞或组织中化学成分，在光学显微镜或荧光显微镜下可清晰看见细胞内发生的抗原抗体反应产物，从而能够在细胞爬片或组织切片上原位确定某些化学成分的分布和含量。 3、分类 1）按标记物质的种类，如荧光染料、放射性同位素、酶（主要有辣根过氧化物酶和碱性磷酸酶）、铁蛋白、胶体金等，可分为免疫荧光法、放射免疫法、免疫酶标法和免疫金银法等。2）按染色步骤可分为直接法（又称一步法）和间接法（二步、三步或多步法）。与直接法相比，间接法的灵敏度提高了许多。3）按结合方式可分为抗原-抗体结合，如过氧化物酶-抗过氧化物酶（PAP）法；亲和连接，如卵白素-生物素-过氧化物酶复合物（ABC）法、链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连结（SP）法等，其中SP法是比较
免疫组化基本步骤
细胞免疫组化染色步骤 1．细胞爬片，取出后，PBS洗三遍，每次3分钟。4℃冷丙酮固定10分钟，（或用4%多聚甲醛固定30分钟），干燥30分钟。 2. 用PBS洗三次，每次5分钟，加3%过氧化氢30μl，室温孵育10分钟，（以消除内源性过氧化物酶的活性）蒸馏水冲洗，PBS洗三次，每次5分钟。 3．加1%的Triton X-100 30μl，室温孵育10分钟，增加细胞膜的通透性。蒸馏水冲洗，PBS洗三次，每次5分钟。 4．滴加正常山羊血清30μl，封闭非特异性结合位点，以消除非特异性染色，室温孵育30分钟，倾去勿洗。 5．滴加适当稀释度的一抗，空白对照组以PBS代替一抗，4℃湿盒孵育过夜。PBS洗三次，每次5分钟。 6．滴加生物素标记的二抗工作液30μl，室温孵育30分钟。PBS洗三次，每次5分钟。 7．滴加辣根酶标记链酶卵白素30μl，室温孵育30分钟。PBS洗三次，每次5分钟。 8．滴加DAB显色剂30μl，显微镜下观察显色，自来水冲洗。 9. 将处理好的玻片细胞核衬染：浸入苏木精染液染色2min，自来水洗，迅速过盐酸酒精溶液，自来水洗，过氨水溶液，自来水洗。 10.梯度酒精脱水，过70%酒精1次，95%酒精2次，无水乙醇3次，每次1min 11.二甲苯透明，过二甲苯溶液3次，每次１min。 12.中性树胶封片将有细胞的一面向下，用中性树脂封片。 稀盐酸酒精溶液：用75%酒精配制1%盐酸。 淡氨水溶液：在400ml自来水中滴2滴浓氨水(使细胞核蓝化) 另外：需1%TritonX-100增加细胞膜通透性。苏木素复染时间和盐酸酒精脱色时间需自己摸索，我是染5-6秒脱色1-2秒。盐酸酒精还可用70%乙醇配制1%盐酸。我没用淡氨水溶液。若为悬浮细胞则需涂片，20μl即可。
常见肿瘤病理诊断中免疫组化抗体选择
泌尿与男性生殖系统肿瘤 1.前列腺癌：CK、P63、34?E12、PSA、P504S(9AMAC)、AR 2.前列腺增生/腺瘤：CK、P63、34BE12、P504S 3.肾癌：CK、EMA、Inhibin、Melan-A、CK7、Vimentin、PAX2、CD10 4.肾母细胞瘤：WT-1、CK、P53、Ki-67 5.膀胱尿路上皮癌：CK7、CK20、P53、Ki-67、P63 6.精原细胞瘤：CK、PLAP、CD117、LCA、OCT3/4 淋巴造血系统肿瘤 7.胸腺肿瘤：CK、CD3、CD5、CD20、TdT、EBV* 8.霍奇金淋巴瘤：CD30、CD15、ALK-1、EMA、CD3、CD20、EBV*、PAX-5 9.非霍奇金淋巴瘤：CD3、CD20、CD45RO、CD79α、TdT、CD43 10.间变大细胞淋巴瘤：CD30、CD15、ALK-1、EMA、CD3、CD20、EBV* 11.弥漫性大B细胞淋巴瘤：CD3、CD20、CD45RO、CD79α、CD43、CD30、Ki-67 12.小B细胞淋巴瘤：CD3、CD5、CD10、CD20、CD23、CD79α、CyclinD1、TdT 13.T细胞淋巴瘤：CD3、CD20、CD43、CD45RO、CD79α、TdT、TiA-1、Perforin 14.套细胞淋巴瘤：CD3、CD5、CD20、CD79α、CyclinD1、TdT、Bcl-2、Ki-67 15.T/NK细胞淋巴瘤：CD3、CD20、CD45RO、CD79α、CD56、TiA-1、Perforin、粒酶B 16.淋巴上皮病变/癌：CK、EMA、S-100、Ki-67、P53、EBV*、P63、CD30、CD20 17.Burkitt淋巴瘤：CD3、CD20、CD79α、CD10、Bcl-2、Bcl-6、Ki-67、EBV*、TdT 18滤泡性淋巴瘤：CD3、CD20、CD45RO、CD79α、CD10、Bcl-2、Bcl-6、Ki67 19.脂膜炎样T细胞淋巴瘤:CD2、CD3、CD7、CD20、CD43、Perforin、TiA-1、EBV* 20.浆细胞瘤：CD3、CD20、CD38、CD138、CD79α、EMA、κ*、λ* 21.坏死性淋巴结炎：CD3、CD20、CD45RO、CD79α、CD43、CD68、Mac387、CD163 22.粘膜相关淋巴瘤：CK、CD3、CD5、CD10、CD20、CD23、CD43、CD79a、CyclinD1 23.血管免疫母细胞性淋巴瘤：CD3、CD20、CD45RO、CD43、CD79α 24.组织细胞肉瘤：S100、CD10、CD21、CD35、CD68、Lysozyme、MPO、CD33、CD34、CD11c、CD14、CD45R O 25.朗格罕氏细胞增生症/肉瘤：S100、CD1α、CD68、CD35、HMB45、CK、EMA、Ki67、CD45 26.指状突树突细胞肉瘤/肿瘤：S100、CD1α、CD68、CD21、CD35、CD3、CD20、CD30、CK、EMA、Ki67、C D45 27.滤泡树突细胞肉瘤/肿瘤：CD21、CD35、S100、CD1α、CD68、CD3、CD23、EMA、VIM、MPO、CD34、CD7 9α、CK、HMB45 28.肥大细胞肿瘤：CD117、CD45、CD33、CD68、CD15、CD3、CD20 消化系统肿瘤 29.胃癌：CK7、CK20、Villin、CEA、P53、Ki-67、CDX-2、GST-π、AB/PAS** 30.肠癌：CK7、CK20、Villin、CEA、P53、Ki-67、CDX-2、GST-π、AB/PAS** 31.肝细胞癌：AFP、CD34、CEA、CK8/18、CK19、Ki-67、P53、HbsAg、Hepatocyte 32.肝胆管细胞癌：CK7、CK20、Villin、AFP、CD34、CEA、CK8/18、CK19、Ki-67、Hepatocyte、HbsAg 33.食道癌：P53、Ki-67、CDX-2、GST-π、P63 34.胰腺癌：CEA、P53、Ki-67、CDX-2、GST-π、Villin、CK7、CK20、 35.胰岛细胞瘤：CD56、Syn、CgA、Ki-67、Insulin、CK8/18、CK19 39.肝炎病毒：HbsAg、HbcAg、HCV 涎腺肿瘤 37.涎腺粘液性囊腺癌：CK、P63、SMA、Vimentin、Myosin-heavy chain
免疫组化与免疫荧光的区别
免疫组化与免疫荧光 一、两者都是蛋白定位的检测（也就是确定蛋白是表达在细胞核/浆/膜）。 二、区别是： 1、概念和基本原理 免疫组织化学又称免疫细胞化学，是指带显色剂标记的特异性抗体在组织细胞原位通过抗原抗体反应和组织化学的呈色反应，对相应抗原进行定性、定位、定量测定的一项新技术。它把免疫反应的特异性、组织化学的可见性巧妙地结合起来，借助显微镜的现像和放大作用，在细胞，亚细胞水平检测各种抗原物质，并可在原位显示相应的基因和基因表达产物。免疫组织化学技术现已有：免疫荧光组织（细胞）化学技术、免疫酶组织（细胞）化学技术、亲和组织化学技术、免疫金银及铁标记免疫组织化学技术等。 免疫荧光组织（细胞）化学技术是采用荧光素标记的已知抗体（或抗原）作为探针，检测待测组织、细胞标本中的靶抗原（或抗体），形成的抗原抗体复合物上带有荧光素，在荧光显微镜下，由于受高压汞灯光源的紫外光照射，荧光素发出明亮的荧光，这样就可以分辨出抗原（或抗体）的所在位置及其性质，并可利用荧光定量技术计算抗原的含量。以达到对抗原物质定位、定性、定量测定的目的。 2、标本制作： 免疫荧光一般用冰冻切片，减少杂质干扰；而酶免疫组化一般用石蜡切片或冰冻切片均可以。 3、实验步骤：免疫荧光染色步骤简单，而酶免疫组化方法较为复杂，多了DAB显色过程。 4、染色后的标本保存：免疫荧光染色后的标本一般短时间拍照，时间长了荧光衰退；而酶免疫组化染色标本可以长期保存。 5、免疫组化结果除了知道蛋白是在细胞浆还是细胞膜表达高些，还可以用软件做相对定量分析。 6、免疫荧光得到的图片是彩色的，漂亮些，可以发高档次文章。 免疫学三大工具：免疫组化、Western、ELISA，分别用于定位，定性和定量。
免疫组化原理、步骤及要注意的事项
免疫组化原理、步骤及要注意的事 项 免疫组化 ，免疫组织化学简介免疫组织化学又称免疫细胞化学，是指带显色剂标记的特异性抗体在组织细胞原位通过抗原抗体反应和组织化学的呈色反应，对相应炕原进行定性、定位、定量测定的一项新技术。它把免疫反应的特异性、组织化学的可见性巧妙地结合起来，借助显微镜（包括荧光显微镜、电子显微镜）的显像和放大作用，在细胞、亚细胞水平检测各种抗原物质（如蛋白质、多肽、酶、激素、病原体以及受体等）。 二，免疫组化技术的基本原理 免疫组化技术是一种综合定性、定位和定量；形态、机能和代谢密切结合为一体的研究和检测技术。在原位检测出病原的同时，还能观察到组织病变与该病原的关系，确认受染细胞类型，从而有助于了解疾病的发病机理和病理过程。 免疫酶组化技术是通过共价键将酶连接在抗体上，制成酶标抗体，再借酶对底物的特异催化作用，生成有色的不溶性产物或具有一定电子密度的颗粒，于普通显微镜或电镜下进行细胞表面及细胞内各种抗原成分的定位，根据酶标记的部位可将其分为直接法（一步法）、间接法（二步法）、桥联法（多步法）等, 用于标记的抗体可以是用免疫动物制备的多克隆抗体或特异性单克隆抗体，最好是特异性强的高效价的单克隆抗体。直接法是将酶直接标记在第一抗体上，间接法是将酶标记在第二抗体上，检测组织细胞内的特定抗原物质。目前通常选用免疫酶组化间接染色法。 ，免疫组化步骤 1, 切片，烤片60C, 1h;
2, 脱蜡及复水 二甲苯10min，100%乙醇5min，95%乙醇5min，90%乙醇5min，85%乙醇5min，80%乙醇5min，75 %乙醇5min，60%乙醇5min，50%乙醇5min，30%乙醇5min，自来水1min，双氧水1min ； 3，1份30%H2O加10份蒸馏水，室温10min，蒸馏水洗3次，每次3min; 4, 微波修复 将切片浸入0.01M枸橼酸缓冲液，微波中最大火力（98E -100C）加热至沸腾，冷却（约5-10min）,反复两次； 5, 将切片自然冷却至室温，PBS洗涤3次，每次5min； 6, 封闭，5%BSA室温20min,甩去多余液体； 7, 滴加一抗，37C, 1h,或者4C过夜； 8, PBS洗涤3次，每次3min； 9, 滴加二抗，37°C, 15-30min ； 10, PBS洗涤3次，每次3min； 11, 滴加SABC 37C, 30min ； 12, PBS洗涤3次，每次5min； 13, 1ml蒸馏水中分别滴加显色剂，混匀； 14, DAB显色剂配置好后，滴加于切片，室温，镜下检测反应时间（约5min）; 15, 自来水冲洗干净，过蒸馏水； 16, 苏木素复染2min,自来水冲洗； 17, 脱水 30%乙醇3min, 50%乙醇3min, 70%乙醇3min, 80%乙醇3min, 90%乙醇3min, 95%乙醇3min, 100%乙醇3min,二甲苯20min ； 18, 树胶封片，镜检。
免疫组化超详细步骤
免疫组化超详细步骤 Prepared on 22 November 2020
免疫组化 一实验目的：分别用KRAS、NRAS、HRAS蛋白抗体检测肺癌组织中KRAS、NRAS、HRAS蛋白的表达情况 二实验原理:应用基本原理——抗体反应，即抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使的（、酶、、）显色来确定组织细胞内抗原（多肽和），对其进行定位、定性及定量的研究，称为或. 三实验试剂及耗材:经病理医生确认的肺癌组织切片、KRAS、NRAS、HRAS蛋白抗体、DAB显色试剂盒、抗原修复液、PBS、苏木素染料、1%盐酸酒精溶液、%氨水、二甲苯、等 四实验设备：切片机、4℃冰箱、显微镜、烤片机 五主要试剂配置: 缓冲液 应用液配成1000毫升溶液 应用液BNa2HPO4·配成1000毫升溶液 配制1000毫升PBS需要14毫升应用A液，36毫升应用B液，加。 枸橼酸钠抗原修复液 应用液A枸橼酸配成1000毫升溶液 应用液B柠檬酸三钠（三水合柠檬酸三钠）配成1000毫升溶液 配制500毫升抗原修复液需要9毫升应用A液，41毫升应用B液。 苏木素染液配方：苏木素2g,无水乙醇250毫升，硫酸铝蒸馏水750毫升，碘酸钠，冰醋酸20毫升。先将苏木素溶于无水乙醇，再将硫酸铝溶于蒸馏水水中。两液溶解后将其混合，加入碘酸钠，最后加入冰醋酸。 抗体说明书建议的抗体稀释度 N-Ras1:50-1:500 H-Ras1:50-1:500 K-Ras1:20-1:200 六实验步骤： 1组织常规石蜡切片厚度3-5um，防脱片捞片后晾干，放入72℃烤箱烤片2小时。 2切片脱蜡水化程序 ⑴二甲苯Ⅰ、Ⅱ脱蜡各12分钟； ⑵无水乙醇Ⅰ、Ⅱ各3分钟；（洗二甲苯） ⑶95%乙醇3分钟； ⑷85%乙醇3分钟； 3自来水漂洗3分钟，洗涤一定要充分。 4组织修复采用高温高压法：压力锅中加入，抗原修复液约1000ml，切片插入塑料架上，放入压力锅，盖上锅盖（此时不扣上压力阀）1600W预热至沸腾，扣上压力阀1300W，待高压锅阀门喷气开始计时，修复时间为2分钟。 5停止加热并用流水冲洗高压锅以降温，室温冷却。 6将抗原修复后切片置自来水中，浸泡2分钟。将样本置于内源性过氧化物酶阻断剂 3%H2O2，室温放置4分钟。（需要盖盖子）自来水洗2分钟，PBS缓冲液洗涤2分钟。
病理科免疫组化在临床上的应用及其意义
病理科免疫组化在临床上的应用及其意义 免疫组化技术是以免疫学的抗原抗体反应为其理论基础发展起来的一门方法学，在生物学领域尤其是在医学的基础和临床研究中发挥重要的作用，对疾病尤其是肿瘤的诊断、鉴别诊断及发病机制的研究提供了强有力的手段。免疫组化技术是20世纪70年代初Sterb Berger在酶标法的基础上发明的，80年代在外国开始应用于临床研究和诊断，90年代初在我国逐渐开始应用于疑难病例的诊断和鉴别诊断。随着新技术的不断发展，抗体种类从研发开始的十几种发展到目前数百种抗体应用于临床科研的各个领域，我国在临床病理诊断上可用抗体293种。由于抗体较昂贵，所以各院根据活检量和病种不同选择不同的抗体，这些抗体对大部分疑难病例的诊断起到重要的辅助作用。对病人的预后及指导治疗具有重要的意义。 一、目前常用的抗体分四大类 1．上皮性标记物：CK high（AE3），CK low ，CK-pan，CK19，CK7，CK20，EMA，CEA，-CA15-3，SCLC , E－Caldeherin, CA125, Tg(甲状腺球蛋白) ,TTF-1 AFP。这些抗体阳性，表明肿瘤组织起源于上皮组织，如果是恶性肿瘤，就是癌 2．间叶组织标记物：SMA ，Desmin，Vimentin，Lysozyme，AACT , CD68 MyoD1，CD117，这些抗体阳性，表明肿瘤组织起源于间叶组织，如果是恶性肿瘤，就是肉瘤。 3．神经及神经内分泌标记物：CgA ，Synaptophysin，NSE，S-100：NF （神经纤维丝蛋白），GFAP，CD99，CD56。 4淋巴细胞标志物： T cell标记物：CD3, CD45RO , CD43, CD5, CD8,CD4,ALK,GranmB , CD56 。 B cell标记物：CD-20 ，CD79a ，CD23，CD10 ，Kappa ，Lambda CD21 CD38 ，CyclinD1 ，Bcl-2。 其它：LCA，CD15，CD30，MPO ，CD34，TdT，这些抗体用于淋巴瘤33个亚型的诊断和鉴别诊断。 二、目前开展的系列检查和意义 1.乳腺癌五项（ER、PR、C-erbB-2(Her-2)、Ki-67、P53） ER、PR阳性，90％的病人对三苯氧胺类药物疗效好。C-erbB-2阳性（2+－3+）可服用抗Her-2基因药物。如果ER和PR均阴性，C－erbB－2强阳性预示预后不好。 Ki-67是细胞生长指数，代表细胞周期中除G0期以外的细胞生长速度。Ki-67值越高表明肿瘤细胞生长越快，预后越不好。P53是广谱致癌基因，在许多肿瘤中都有表达，表达值越高预后越不好。据报道，国际上目前有抗P53基因阳性的药物用于治疗肿瘤。 2.垂体腺瘤功能六项检查 LH（促黄体生成素），FSH（卵泡刺激素），ACTH（促肾上腺皮质激素），TSH（促甲状腺素），PRL（泌乳素）GH（生长激素）。根据某一种抗体阳性表达进行术后药物治疗。 3.恶性肿瘤的Ki-67和P53常规检查 目前的研究表明，大部肿瘤的复发、转移取决于Ki-67值和P53值，而与肿瘤的组织的分型关系不是十分密切，如中分化腺癌，如果Ki-67和P53值超过50％，预后不佳，相反，如肿瘤的组织分型为低分化腺癌，而Ki-67和P53值较低，预后也会较中分化或高分化癌的预后稍好。 4.GIST（胃肠道间质瘤）和EGIST（胃肠道外间质瘤）的诊断 GIST是90年代新发现的肿瘤，过去均诊断为平滑肌瘤或平滑肌肉瘤，现在经过一组免疫组化可将其诊断，GIST的生物学形为一般无良性，因为小于2cm的GIST偶而也有转移。其良恶性程度取决于肿瘤的大小和核分裂像，国际确定GIST侵袭行为危险性的推荐方案如下： 危险程度大小核分裂数
免疫组化技术(原理、分类、步骤及主要试剂、设备准备)
免疫组化技术 免疫组化技术
业精于勤而荒于嬉 行成于思而毁于随
免疫组化技术
原理
抗原抗体反应，即抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂 (荧光素、酶、金属离子、同位素) 显色 来确定组织细胞内抗原(多肽和蛋白质)，对其进行定位、定性及定量的研究。 众所周知，抗体与抗原之间的结合具有高度的特异性。免疫组化正是利用这一特性，即先将组织或细胞中的某些化学物质提取 出来，以其作为抗原或半抗原去免疫实验动物，制备特异性抗体，再用这种抗体（第一抗体）作为抗原去免疫动物制备第二抗体，并 用某种酶（常用辣根过氧化物酶）或生物素等处理后再与前述抗原成分结合，形成抗原 - 一抗 - 二抗复合物，将抗原放大，由于抗 体与抗原结合后形成的免疫复合物是无色的，因此，还必须借助于组织化学方法将抗原抗体反应部位显示出来（常用显色剂 DAB 显示 为棕黄色颗粒） 。通过抗原抗体反应及呈色反应，显示细胞或组织中的化学成分，在显微镜下可清晰看见细胞内发生的抗原抗体反应产 物，从而能够在细胞或组织原位确定某些化学成分的分布、含量。组织或细胞中凡是能作抗原或半抗原的物质，如蛋白质、多肽、氨 基酸、多糖、磷脂、受体、酶、激素、核酸及病原体等都可用相应的特异性抗体进行检测。
分类（常用）
1、免疫荧光方法
最早建立的免疫组织化学技术。它利用抗原抗体特异性结合的原理，先将已知抗体标上荧光素，以此作为探针检查细胞或组织内 的相应抗原，在荧光显微镜下观察。当抗原抗体复合物中的荧光素受激发光的照射后即会发出一定波长的荧光，从而可确定组织中某 种抗原的定位，进而还可进行定量分析。由于免疫荧光技术特异性强、灵敏度高、快速简便，所以在临床病理诊断、检验中应用比较 广。
2、免疫酶标方法
免疫酶标方法是继免疫荧光后， 60 年代发展起来的技术。 于 基本原理是先以酶标记的抗体与组织或细胞作用， 然后加入酶的底物， 生成有色的不溶性产物或具有一定电子密度的颗粒，通过光镜或电镜，对细胞表面和细胞内的各种抗原成分进行定位研究。免疫酶标 技术是目前定位准确、对比度好、染色标本可长期保存，适合于光、电镜研究等。免疫酶标方法的发展非常迅速，已经衍生出了多种 标记方法，目前在病理诊断中广为使用的当属 PAP 法（过氧化物酶-抗过氧化物酶） 、ABC 法（卵白素-生物素-过氧化物酶复合物） SP 、SP 、即用型二步法（聚合物链接）等。 法（链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶） 链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶）
3、免疫胶体金技术
免疫胶体金技术是以胶体金这样一种特殊的金属颗粒作为标记物。胶体金是指金的水溶胶，它能迅速而稳定地吸附蛋白，对蛋白 的生物学活性则没有明显的影响。因此，用胶体金标记一抗、二抗或其他能特异性结合免疫球蛋白的分子(如葡萄球菌 A 蛋白)等作为 探针，就能对组织或细胞内的抗原进行定性、定位，甚至定量研究。由于胶体金有不同大小的颗粒，且胶体金的电子密度高，所以免 疫胶体金技术特别适合于免疫电镜的单标记或多标记定位研究。由于胶体金本身呈淡至深红色，因此也适合进行光镜观察。如应用银 加强的免疫金银法则更便于光镜观察。
4、免疫铁蛋白法 5、放射免疫自显影法
标本
1、组织标本：石蜡切片 石蜡切片（病理切片和组织芯片） 、冰冻切片 石蜡切片 2、细胞标本：组织印片、细胞爬片、细胞涂片
---------------------------------------------------------------------------------华中科技大学同济医学院
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免疫组化原理、步骤及要注意的事项
免疫组化 一，免疫组织化学简介 免疫组织化学又称免疫细胞化学，是指带显色剂标记的特异性抗体在组织细胞原位通过抗原抗体反应和组织化学的呈色反应，对相应炕原进行定性、定位、定量测定的一项新技术。它把免疫反应的特异性、组织化学的可见性巧妙地结合起来，借助显微镜(包括荧光显微镜、电子显微镜)的显像和放大作用，在细胞、亚细胞水平检测各种抗原物质(如蛋白质、多肽、酶、激素、病原体以及受体等)。 二，免疫组化技术的基本原理 免疫组化技术是一种综合定性、定位和定量；形态、机能和代谢密切结合为一体的研究和检测技术。在原位检测出病原的同时，还能观察到组织病变与该病原的关系，确认受染细胞类型，从而有助于了解疾病的发病机理和病理过程。 免疫酶组化技术是通过共价键将酶连接在抗体上，制成酶标抗体，再借酶对底物的特异催化作用，生成有色的不溶性产物或具有一定电子密度的颗粒，于普通显微镜或电镜下进行细胞表面及细胞内各种抗原成分的定位，根据酶标记的部位可将其分为直接法（一步法）、间接法（二步法）、桥联法（多步法）等，用于标记的抗体可以是用免疫动物制备的多克隆抗体或特异性单克隆抗体，最好是特异性强的高效价的单克隆抗体。直接法是将酶直接标记在第一抗体上，间接法是将酶标记在第二抗体上，检测组织细胞内的特定抗原物质。目前通常选用免疫酶组化间接染色法。 三，免疫组化步骤 1，切片，烤片60℃，1h； 2，脱蜡及复水 二甲苯10min，100％乙醇5min，95％乙醇5min，90％乙醇5min，85％乙醇5min，80％乙醇5min， 75％乙醇5min，60％乙醇5min，50％乙醇5min，30％乙醇5min，自来水1min，双氧水1min； 3，1份30％H2O2加10份蒸馏水，室温10min，蒸馏水洗3次，每次3min； 4，微波修复 将切片浸入0.01M枸橼酸缓冲液，微波中最大火力（98℃-100℃）加热至沸腾，冷却（约5-10min），反复两次； 5，将切片自然冷却至室温，PBS洗涤3次，每次5min；