药用植物学实验指导(hua)

药用植物学实验指导

实验一显微镜使用与植物细胞观察

一、实验目的：

1、学会正确使用与保养光学显微镜。

2、学会临时装片法。

3、学会绘制植物细胞图的基本技术，能绘出植物细胞图，并注明各部分名

称。

4、了解显微镜的类型、构造及简要的工作原理。

5、通过实验理解植物细胞的概念、结构及作用。

二、仪器用品及实验材料：

1. 仪器用品：显微镜、载玻片、盖玻片、镊子、刀片、0.03％中性红、1mol/L 硝酸钾溶液、4mol/L（24%）尿素溶液[备用]、稀甘油、稀碘液、氯化锌碘试液、去离子水、吸水纸。

2. 实验材料：洋葱、马铃薯

三、实验内容：

（一）显微镜的类型：略

（二）光学显微镜的结构：

光学显微镜是由光学部分和机械部分两大部分构成。

1、光学部分：主要包括物镜、目镜、反光镜和聚光镜四个部件。

2、机械部分：主要由精巧的金属零件组成，作用是支持光学部分，使其充分发挥效能。主要有镜座、镜臂、镜筒、载物台、物镜转换器和调焦装置等六部分。

(三）显微镜的使用

每台显微镜一般都配有低倍、高倍、油镜三个物镜头，在观察物体时，要先在低倍镜下观察，因低倍镜的视野范围大，容易找到观察物，然后转换高倍镜观察，若需要再放大时，再到油镜下观察。

低倍镜的使用取镜－对光－放置载玻片－调焦

高倍镜的使用由低倍—高倍—低倍

（四）显微镜的使用、保护的注意事项

1、显微镜应放在干燥的地方，避免强烈的日光照射。

2、拿取显微镜时，应右手握镜臂，左手托住底座，使镜身直立，切勿左

右摇晃，以免碰伤或目镜滑出。

3、保持显微镜的清洁，用擦镜纸擦拭镜头，不可用手或毛布擦物镜和目

镜；用绸布或纱布擦机械部分。

4、观察时应由低倍到高倍再到低倍，决不可先用高倍物镜，以免损坏玻

片而影响观察。

（五）植物细胞的结构

（1）用尖头镊子撕取洋葱（玉葱）鳞片内表皮薄片（0.3×0.3cm），浸到0.03％中性红溶液中（载玻片上）10～15min进行染色。观察：

1.1 将染色后的植物材料放到载玻片上，盖好盖玻片，在盖玻片的一侧滴加无离子水（或pH略高于7.0的自来水），另一侧放吸水纸吸干，以洗净撕片外粘附的中性红溶液，然后在显微镜下观察，可以看出液泡染成樱桃红色；原生质层（细胞质和细胞）则无色透明紧贴细胞壁（在细胞的角隅上可以看见）。

1.2 在第1项观察后，接着从盖玻片的一边滴2滴1mol/L硝酸钾溶液, 在盖玻片的另一边用吸水纸吸盖玻片下的水，将硝酸钾溶液引入盖玻片下浸渍植物材料，并立即镜检，可以看到细胞很快发生凸形质壁分离。

1.3 在第2项观察后，接着在盖玻片的一边加入2～3滴无离子水，在另一边用吸水纸吸去硝酸钾溶液，使质壁分离剂（即高渗的硝酸钾溶液）被基本上洗吸掉。立即镜检可以看到带有液泡的原生质体重新吸水膨大，最后充满整个细胞腔，即质壁分离复原（复原缓慢进行时，细胞仍可正常存活；如果进行很快，则会因原生质机械破坏而死亡）。

（2）另撕取内表皮少许，平展于载玻片的水滴上，加一滴水，加盖玻片制成临时装片。低倍镜下观察细胞结构。细胞壁较透明，细胞质颜色均匀，细胞核扁球形，仔细观察可见其内1－3个发亮的核仁。再在高倍镜下仔细观察。从一侧滴加稀碘液，细胞质被染成浅黄色，细胞核被染成深黄色。

（3）纤维素细胞壁观察：马铃薯块茎，徒手切片，滴加氯化锌碘试液，观察颜色反应（蓝紫色）。

四、实验报告：绘出洋葱内表皮细胞结构图，标明细胞壁、液泡、细胞质和细胞核。

实验二植物根尖的观察

一、实验目的：

1、了解植物根尖的构造；

2、区分根尖不同部位组织细胞的差异；

3、领会根尖不同部分的生理功能；

4、绘制根尖显微示意图。

二、仪器用品及实验材料：

1、仪器用品：显微镜、载玻片、盖玻片、刀片、清水。

2、实验材料：洋葱根尖。

三、实验内容：

1. 用刀片取洋葱根尖～1.2 cm（含根毛区），沿中轴切开，取其中一半置于载玻片上，纵切面朝上，制临时切片。

2. 显微镜观察不同部位组织细胞的形态。

四、实验报告：绘制洋葱根尖的纵切面图。

实验三植物细胞后含物的鉴定

一、实验目的：

1、识别细胞主要后含物的种类及鉴别方法。

2、学习徒手切片和组织粉末装片法。

3、通过实验理解后含物的概念、种类及在鉴定药材中的意义。

4、绘出不同类型淀粉粒、结晶的形态图。

二、仪器用品及实验材料：

1、仪器用品：显微镜、载玻片、盖玻片、斯氏液、稀碘液、苏丹III试液、水合氯醛、稀甘油。

2、实验材料：马铃薯块茎、小茴香粉末、杏仁（或蓖麻）、党参粉末、无花果叶、半夏粉末、大黄粉末、黄柏粉末。

三、实验内容：

（一）贮藏物：与淀粉鉴别

1、淀粉粒观察：刮取马铃薯块茎组织少许，加斯氏液制作临时装片，镜下

观察淀粉粒类型。加稀碘液，观察淀粉粒颜色变化。

2、糊粉粒观察：观察小茴香粉末（需透化），制临时装片。观察胚乳细胞

的糊粉粒。加稀碘液，观察糊粉粒颜色变化（暗黄色）。注：还有无色的、不被染色的球晶体，它不是蛋白质分子，而是无机磷酸化合物与钙、镁结合的盐类。

3、油滴观察：杏仁（或蓖麻）徒手切片（浸泡后切面在载玻片上抹过），

制临时装片，加苏丹III试液，观察油滴颜色变化（橙红色）。

4、菊糖观察：党参粉末，首先浸于乙醇溶液1周，进行软化，然后加透化

剂（水合氯醛）加热透化，加热时须续加透化剂，至待观察样品透化清晰为止。观察菊糖形态（类圆形或扇形）。

图3—10马铃薯块茎淀粉粒

A.单粒;

B.

C.D 复粒; E.半复粒

图3—11 蓖麻种子的胚乳细胞示糊粉粒

1.球晶体;

2.拟晶体;

3.无定形胶层;

4.糊粉粒;

5.细胞核

（二）晶体

1、取大黄粉末制临时装片，观察簇晶形态。

2、取半夏粉末制临时装片，观察针晶形态。

3、取黄柏粉末制临时装片，观察方晶形态。

4、撕取无花果叶表皮，制临时装片，观察表皮细胞中的钟乳体。

四、作业与思考：

植物细胞后含物（贮藏物）主要有哪些种类？产生和储藏的部位如何？如何鉴别？

五、实验报告：绘出不同类型淀粉粒、结晶的形态图。

实验四薄层色谱制备及应用

一、实验目的

1、初步掌握簿层色谱法的实验技术。

2、学会用薄层色谱法在生药学中的应用，了解薄层层析法分析单糖组分的

原理和方法。

二、实验原理

色谱法的基本原理是利用混合物中各组分在某一物质中的吸附或溶解性能（即分配）的不同，或其它亲和作用性能的差异，使混合物的溶液流经该物质时进行反复的吸附或分配等作用，从而将各组分分开。流动的混合物溶液称为流动相；固定的物质称为固定相（可以是固体或液体）。根据组分在固定相中的作用原理不同，可分为吸附色谱、分配色谱、离子交换色谱、排阻色谱等；根据操作条件不同，可分为柱色谱、纸色谱、薄层色谱、气相色谱及高效液相色谱等类型。

薄层色谱(Thin Layer Chromatography)常用TLC表示，又称薄层层析，属于固－液吸附色谱。是快速分离和定性分析少量物质的一种很重要的实验技术，属固－液吸附色谱，它兼备了柱色谱和纸色谱的优点，一方面适用于少量样品（几到几微克，甚至0.01微克）的分离；另一方面在制作薄层板时，把吸附层加厚加大，因此，又可用来精制样品，此法特别适用于挥发性较小或较高温度易发生变化而不能用气相色谱分析的质。此外，薄层色谱法还可用来跟踪有机反应及进行柱色谱之前的一种“预试”。

三、实验仪器与材料

常用薄层层析槽、薄层层析板、薄层层析点样管、展开剂（乙酸乙脂：吡啶：无水乙醇：水=8：1：1：2）、正丁醇：乙酸：水=4：1：5 (上层)[备用]、显色剂（苯胺-邻苯二甲酸-正丁醇饱和水溶液）、单糖混合品、单糖标准品、硅胶、0.5％羧甲基纤维素钠、电吹风、烘箱、铅笔（自备）。

四、实验步骤

1．薄层板制备：称取硅胶5 g于50 ml烧杯中，加入用15 mL 0.5％羧甲基纤维素钠（CMC）溶液，用玻璃棒慢慢搅拌至硅胶分散均匀，注意不能产生气泡。接着沿着板中线把硅胶倒在玻璃板上，可以用玻璃棒引着溶液平铺在玻璃板上（注意：硅胶厚度以0.2mm－1.0mm为宜，玻璃板事先应洗干净，没有划痕，没有缺口，4个角要“健全”）。然后在实验桌的一侧轻轻颠震玻璃板，使薄层板表面平整，各个角落都布满。制备完毕，放在平坦空处自然晾干。

薄层板活化：取已制备好的薄层板于110 ℃烘箱活化1 h，备用。

2．点样：用点样管吸取样品点样于薄层板上，一般为圆点，点样基线距底边1.5－2.0 cm，点样直径为2－4mm，点间距离约为1.5－2.0 cm，点间距离可视斑点扩散情况以不影响检出为宜。点样时必须注意勿损伤薄层表面。

3．展开：展开室如需预先用展开剂饱和，将点好样品的薄层板放入展开室的展开剂中，浸入展开剂的深度为距薄层板底边0.5－1.0 cm（切勿将样点浸入展开剂中），密封室盖，等展开剂前沿升至至离顶部1/3高度时，取出薄层板，晾干（或电吹风吹干）。

4．显色：凉干后的薄板。用喷雾器把显色剂喷在薄板上，置于85℃烘箱内加热10分钟即可显色。

薄层显色后，将样品图谱与标准样图谱进行比较，参考斑点颜色、相对位置及Rf值，确定样品中有哪几种糖。

五、作业

观察结果，绘制薄层色谱图，计算Rf值。

思考题：

1、在一定的操作条件下为什么可利用Rf值来鉴定化合物？

2、在混合物薄层色谱中，如何判定各组分在薄层上的位置？

3、展开剂的高度若超过了点样线，对薄层色谱有何影响？

附

1.Rf值的计算

薄层色谱是在被洗涤干净的玻板上均匀的涂一层吸附剂或支持剂，带干燥、活化后将样品溶液用管口平整的毛细管滴加于离薄层板一端约1cm处的起点线上，凉干或吹干后置薄层板于盛有展开剂的展开槽内，浸入深度为0.5cm。待展开剂前沿离顶端约1cm附近时，将色谱板取出，干燥后喷以显色剂，或在紫外灯下显色。记下原点至主斑点中心及展开剂前沿的距离，计算比移值（Rf），公式如下：

2.薄层色谱展开方式

薄层色谱展开需要在密闭容器中进行。为使溶剂蒸气迅速达到平衡，可在展开槽内衬一滤纸。常用的展开槽有：长方形盒式和广口瓶式。展开方式有：（1）上升法将色谱板垂直于盛有展开剂的容器中，适合于含粘合剂的色谱板。（2）倾斜上行法色谱板倾斜10—15°角，适用于干板或无粘合剂软板的展开；色谱板倾斜45—60°角适用于含有粘合剂的色谱板。

（3）下降法用滤纸或纱布等将展开剂吸到薄层板的上端，使展开剂沿板下行，这种连续展开的方法适用于Rf值小的化合物。

（4）双向色谱法将样品点在方形薄层板的角上，先向一个方向展开，然后转动90°角的位置，再换另一种展开剂展开。适合于成分复杂的化合物分离。

3.薄层色谱是否成功的关键－薄层色谱的上样技术

不良的上样是薄层色谱失败的主要原因：

[1]原点位置对样品容积的负荷量是极其有限的。

[2]上样环行色谱效应。

[3]供试液的溶剂在原点的残留。

[4]上样装置对薄层表面的机械损伤对色谱质量的影响。

实验五植物色素的提取分离

一、实验目的

1、学习萃取的原理及方法，掌握分液漏斗的使用；

2、学习柱色谱法的基本原理，掌握用柱色谱法分离提纯有机物的操作方法。

二、实验原理

利用萃取技术从植物叶中获得色素提取物，然后通过柱色谱法分离提纯获得较高纯度的色素样品。

三、仪器与试剂

干燥绿树叶（或绿草叶）、硅胶、石油醚（60～90 ℃）、丙酮、无水硫酸钠、饱和氯化钠溶液、蒸馏水、色谱柱、玻璃漏斗、分液漏斗、研钵、三角瓶、试管、滴管、玻棒、滤纸、脱脂棉。

四、实验步骤

1、绿色植物叶色素的提取：称取2.5 g绿色草叶，切成碎片，置于研钵中，

加15mL丙酮一起捣烂（丙酮蒸发快，可适当补之），过滤除去滤渣，滤液移至分液漏斗，加10mL石油醚。如有乳状液形成，可加入5-10 mL的饱和氯化钠溶液一起振摇，静置，弃水层后，用20 mL蒸馏水洗涤绿色溶液两次，分出有机层，用0.2 g无水硫酸钠干燥1小时，备用。

2、装柱：将一根洗净，烘干的色谱柱（2.5~3.0*30~40 cm）垂直固定在铁架

台上，于柱的下端放入少许的脱脂棉，关上活塞，沿柱壁倒入少量石油醚，润湿玻璃棉（或脱脂棉），并赶走气泡（如底部有砂芯隔板，上述加脱脂棉步骤可省略）。称取30 g硅胶（200-300目）于250 mL烧杯中，加入～100 mL 石油醚，充分搅拌使之悬浮，一次性倒入色谱柱（柱底部预装50 mL的石油醚）同时打开活塞，并随时用橡皮塞轻轻敲打柱身，底部收集的装柱溶剂可回收加到色谱柱上端，30 min后，当柱上端溶剂刚好与硅胶界面齐平时，关上活塞，最后在柱的上端加入少许脱脂棉。

3、上样：用滴管取2 mL第一步中已处理好的样品立即沿柱壁转一圈加入，

打开活塞，待样品刚刚完全进入硅胶时，关上活塞，并用少量石油醚沿柱壁洗下粘在柱壁的有色物质，并使之完全进入硅胶界面。

4、洗脱：缓慢加入石油醚洗脱液，控制洗脱速度（v=3 mL/min），观察色谱

带的出现（两条黄色带在前，两条绿色带在后）。当第一条黄色带（β-胡萝卜素）到达底部时，改用石油醚：丙酮混合溶剂（9：1）梯度洗脱，当第二条色带（叶黄素）到达底部时，同样换用石油醚：丙酮混合溶剂（7：3）梯度洗脱，最后用混合溶剂（1：1）梯度洗脱，收集的最后色带为黄绿色（叶绿素b）。

5、实验结束后，倒出柱中硅胶，并将色谱柱等实验器材清洗干净放回远处。

五、作业

1、萃取过程中，如出现乳浊液难于分层怎么办？

2、萃取过程中最应该注意的安全事项时什么？

3、为什么极性大的组分，要用极性大的溶剂洗脱？

4、柱子中若有空气或填装不均匀，会影响分离效果吗？为什么？如何避免？

萃取与柱色谱介绍

1. 萃取是天然药物实验中用来提取或纯化天然有机产物的常用操作之一。应用萃取可以从固体或液体混合物中提取出所需要的物质，也可以用来洗去混合物中少量的杂质，前者称为萃取，后者称为洗涤，二者在理论上和基本操作上有许多相同之处，但目的不同。

萃取是利用物质在两项（或更多项）不互溶（或微溶）溶剂中，溶解度或分配比的不同来达到分离，进行物质提取或纯化目的的一种操作。

有机物质在有机溶剂中的溶解度一般比在水中的溶解度大，所以可以将它们从水中萃取出来。在一定温度下，一种物质在两种互不相溶的溶剂中分配比为一常数K：

K = C A / C B = (W1/V) / [(W0– W1) / S] 或W1 = W0 [KV / (KV + S)]

C A和C B分别为物质在原溶液A和B中的浓度；

V = 原溶液体积；S = 溶剂体积；W0 = 原物质重量；W1 = 萃取后剩余重量。萃取几次后，在水中的剩余量W n为：W1 = W0 [KV / (KV + S)]n

实验证明：在一定温度下，用一定量的溶剂进行萃取（或洗涤）时，分几次萃取（或洗涤）要比用全部溶剂一次萃取（或洗涤）所得的效果更好。

萃取可分为从固体物质萃取及从液体物质萃取两种。

从固体混合物中萃取所需物质，最简单的方法是先将固体混合物研细，放在容器里，然后加入适量的萃取剂，振荡，最后用过滤的方法把萃取液和残留的固体分开。如果被萃取物的溶解度很小，则可以采用脂肪提取器（又称索氏提取器Soxhlet）来萃取。

从液体混合物中萃取所需物质，最常用的仪器是分液漏斗。将含有被萃取物质的液体和萃取剂放入分液漏斗中，盖好上塞，振荡分液漏斗，使两液层充分接触，提高萃取效率。振荡后，扭开旋塞，放出气体。振荡数次以后，将分液漏斗放在铁环上静置，使之分层，到两液相完全分开为止，然后分出萃取剂层，被萃取物质因进入萃取剂层而被分出。这样一次萃取不能将被萃取物全部萃取出时，可重复进行几次。最后将萃取液合并，进行干燥，待蒸馏精制。

2. 柱色谱是常用色谱分析法的一种。色谱法是分离，纯化和鉴定天然有机物质的重要方法之一，它的基本原理是利用混合物各组分在某一物质中的吸附溶解性能（分配）的不同，使混合物的溶液流经该物质进行反复的吸附或分配作用，从而使各组分分离。

柱色谱常用的有吸附色谱、分配色谱、离子交换色谱以及凝胶色谱。吸附色谱常用氧化铝和硅胶为吸附剂。分配色谱常以硅胶和纤维素为支持剂，以吸附较大量的液体为固定相。这里主要介绍以硅胶为吸附剂的柱色谱分离方法。

以硅胶为吸附剂的柱色谱实际上是一种固液吸附色谱柱。固体硅胶是固定相，液体样品通过固定相时，由于固定相对液体中各组分的吸附能力不同而使各组分分离开，这种分离是通过色谱柱来实现的。各组分如果为有色物质，则可能直接观察到不同颜色谱带；如果为无色物质，则不能直接观察到谱带；一般可按时间分段或按一定体积收集洗脱液，再分别鉴定；有时一些物质在紫外线照射下能发出荧光，则可用紫外灯照射观察。