常用抗体介绍
常用抗体介绍
细胞角蛋白
细胞角蛋白作为一种中间丝，存在于所有上皮细胞及部分非上皮细胞。事实上，几乎所有肿瘤类型中都被证实存在角蛋白，包括子宫平滑肌瘤、大部分软组织肉瘤、黑色素瘤、神经胶质瘤、浆细胞瘤和某些淋巴瘤。
诊断应用：
癌的鉴别
显示不同上皮样分化肉瘤的鉴别
☆滑膜肉瘤
☆上皮样肉瘤
肉瘤中的异常染色可为间皮瘤、黑色素瘤、平滑肌肉瘤和内皮细胞肿瘤的诊断提供线索，在小细胞癌中可以看到细胞核周“圆点状”染色，如麦克尔细胞癌、肉瘤及髓细胞瘤可显示异常免疫反应性。
许多儿童的小圆细胞肿瘤表达角蛋白，包括尤文氏肉瘤/PNET、横纹肌肉瘤、肾母细胞瘤和促结缔组织增生性小圆细胞肿瘤。
仅仅只有CK8和CK18表达阳性，这两种存在于所有组织中的原始角蛋白胚胎源性表达也许可以解释CK8和CK18的异位性表达。
腺癌：CK阳性
上皮膜抗原（EMA、MUC1）这是在人乳脂球膜(HMFGP)中发现的一种糖蛋白。因为HMFGP 在高尔基体中被包裹，高尔基体的颗粒反应性可以看见。这种可被EMA识别的糖蛋白是糖蛋白或粘蛋白系列之一，命名为MUC1。。大多数多抗对重复区内的优势表位有反应，由于糖基化的不同使得有一系列抗体识别不同的糖蛋白结构。
膜有显著反应性，纯胞浆染色被认为是假阳性而被忽略。
诊断应用
由于肿瘤广泛表达EMA和更具特异性的上皮组织分化标志物的应用，其诊断应用有限
CEA（CD66e、癌胚抗原）
免疫组化表达
这种糖蛋白在胎胚性上皮细胞中表达，在正常成年人上皮细胞及良性肿瘤中的表达较少，它大量存在于胃肠道(包括胰腺)及肺的腺癌和甲状腺髓样癌中。它也常常在一些骨髓瘤中表达。
诊断应用
腺癌+、间皮瘤-
区分反应性间皮细胞（阴性）和癌脱落细胞（阳性）。
区分肝细胞癌和其他转移性癌，多克隆CEA对肝细胞癌有独特性。
Vimentin（波形蛋白）
波形蛋白分子量为57KD，被认为是原始的中间丝，它是分布最广泛的中间丝，在所有间叶细胞均可表达。
诊断应用
波形蛋白是一个有用的控制性的标志物，就是说，如果波形蛋白不能够很容易证明存在于非肿瘤性内皮细胞、成纤维细胞及其他间叶组织中，可能存在影响免疫反应性的组织保存问题。
波形蛋白的肿瘤诊断价值，因它广泛存在而十分有限。不管怎样，在恶性横纹肌样瘤中，它常常被假设为特殊的球形的胞浆结构，压迫细胞核。
区分间皮瘤和腺癌。波形蛋白在间皮瘤的上皮细胞中与角蛋白共表达更普遍。
未知的原发癌：波形蛋白和角蛋白的较强的共表达,提示原发性肾癌、子宫内膜癌或甲状腺癌。
Desmin（结蛋白）
这种中间丝最初发现于1977年,被命名为骨架，它的分子量为53KD，具有头尾及中间连接的α螺旋蛋白部分，后者在物种之间具有高度保守性，最具特征的三种单抗（D33、DER-11和DEB-5）和其他中间丝无交叉反应
可在平滑肌和横纹肌细胞中表达，在肌纤维母细胞中少量表达，实性平滑肌比血管平滑肌表达要多。
诊断应用
诊断平滑肌和骨骼肌肿瘤
鉴别反应性间皮细胞（阳性）与扩散的癌细胞（阴性）
Muscle-specific actin（HHF35）肌肉特异性肌动蛋白（MSA）
这种抗体能识别普遍存在于α-骨骼肌，α-心肌和r-平滑肌肌动蛋白中的一种抗原。
诊断应用：用于平滑肌肿瘤的诊断，与平滑肌肌动蛋白（SMA）、波形蛋白（Vimentin）联用最好。
Smooth muscle actin（SMA）平滑肌肌动蛋白免疫组化表达
平滑肌细胞，包括肌上皮细胞
诊断应用
平滑肌肿瘤的诊断
乳腺、唾液腺和汗腺肌上皮细胞的鉴别
Myo-D1
Myo-D1是转录因子Myo-D家族的成员，是负责起动横纹肌分化，需抗原复性，染色限于细胞核。
诊断应用
鉴别骨骼肌分化。
CD34
CD34是一种110KD跨膜糖蛋白，基因位于1q32，抗体在石蜡包埋组织中有效。
免疫组化表达
内皮细胞
胃肠间质瘤（GIST）
孤立性纤维性肿瘤（SFT）
隆突性皮肤纤维肉瘤
CD45 (白细胞共同抗原，LCA)
CD45家族至少有5种蛋白，CD45（LCA）抗体识别所有CD45异构蛋白，包括CD45RA和CD45RO。抗体可在石蜡包埋组织中应用。
免疫组化表达
几乎所有的淋巴造血细胞
CD3除了NCL-CD3-PS1外，单抗仅在新鲜冰冻组织中有用，多抗在石蜡包埋的组织中
有用。
免疫组化表达
存在于胸腺细胞、静止和活化T淋巴细胞上的一种T细胞标记物，B淋巴细胞、巨噬细胞、骨髓细胞及任何其它细胞均不表达，除了小脑中的蒲肯野细胞。福尔马林固定石蜡包埋的组织需要应用多克隆抗体。
诊断应用
T-细胞ALL
非瘤性和瘤性T淋巴细胞
NK细胞
CD45RO（UCHL1，A6，OPD4）免疫组化表达
90%的皮质胸腺细胞
50%的髓质胸腺细胞
50-70% CD2-/CD3+外周淋巴细胞
正常B淋巴细胞很少阳性
成熟单核细胞和巨噬细胞UCAL1阳性，OPD4阴性
粒细胞
一些肠上皮内淋巴细胞CD45RO阴性
诊断应用
区分低级别T细胞和B细胞淋巴瘤：敏感性95%，特异性95%。
区分高级别T细胞和B细胞淋巴瘤：敏感性80%，特异性85%
CD20表位L26在石蜡包埋的组织中起反应。
免疫组化表达
所有成熟B淋巴细胞但不包括浆细胞
大多数B细胞淋巴瘤
大约50%的B淋巴母细胞淋巴瘤瘤CD20阳性
一些T淋巴细胞显示弱染色
一些骨髓瘤
诊断应用
B细胞淋巴瘤
毛细胞白血病
诊断应用
鉴别内皮分化程度。不管肿瘤分级如何均敏感，血管肉瘤、卡波西肉瘤敏感性大于85％，但缺乏特异性。
鉴别胃肠间质瘤，和CD117联合效果更好。
鉴别孤立性纤维性肿瘤（通常阳性）和肉瘤样间皮瘤（通常阴性）。
鉴别隆突性皮肤纤维肉瘤（通常阳性）和良性纤维组织细胞瘤（通常阴性）。
鉴别乳腺梭形细胞癌（CD34-）和恶性叶状肿瘤（CD34+）。
CD79a是膜相关免疫球蛋白，它和异二聚体（CD79a）mb-1和B29（CD79b）蛋白相关。
免疫组化表达
B淋巴细胞（从前体B到成熟浆细胞）
79%的B细胞淋巴瘤
前B细胞ALL
淋巴细胞为主的霍奇金淋巴瘤的R-S细胞
一些浆细胞瘤
CD68（Kp1，PG-M1）
这是最可靠的巨噬细胞标志物，这种抗原常在和溶酶体相关的胞浆蛋白中表达。抗体可应用于石蜡包埋组织。
免疫组化表达
单核细胞
巨噬细胞
郎罕氏细胞组织细胞增多症
GFAP（胶质纤维酸性蛋白）
这是一种主要类型的中间丝，它的分子量为51KD
免疫组化的表达
正常的、反应性的和肿瘤性的星形胶质细胞
生长发育的、反应性的和肿瘤性的室管膜细胞
生长发育的和肿瘤性的少突胶质细胞
视网膜Muller细胞
雪旺细胞和周围神经鞘瘤
肝枯否细胞
一些软骨细胞和软骨肿瘤
唾液腺和汗腺的混肿瘤（错构瘤）
诊断应用
诊断应用是有限的。
Chromogranin（嗜铬蛋白）
CD99（MIC2）
Synaptophysin（突触素）
HMB-45（anti-gp100）
这种单抗鉴别不成熟黑素体。
免疫组化表达
活性和肿瘤性黑色素细胞
血管周细胞肿瘤
Ki-67
Ki-67在细胞增殖G1后期、S期、G2期表达，G0期不表达，常表现为核染色或核周染色，与Ki-S2联合可用于诱导细胞周期。单抗Ki-67作用于冰冻切片，抗原复性后可用于石蜡切片。多抗在石蜡切片中具有免疫反应性。其中冰冻切片中的单抗、石蜡切片中的多抗及细胞增殖的其它指标在免疫反应性方面具有较好的相关性。因此其免疫反应性存在并不依赖固定，优于PCNA
诊断应用
Ki-67可评估细胞增殖速度，其免疫反应性作为诊断指标在大量恶性肿瘤中作了研究。也可用于鉴别良恶性肿瘤。
噬菌体抗体库技术及其应用研究进展
综述doi:10．3969／j．issn．1009－0002．2010．04．031 噬菌体抗体库技术及其应用研究进展 潘博1，2，童贻刚1 1．军事医学科学院微生物流行病研究所，病原微生物生物安全国家重点实验室，北京100071； 2．东北农业大学动物医学院，黑龙江哈尔滨150030 ［摘要］噬菌体呈现抗体库是近年发展的一项分子生物学新技术，它的建立是抗体技术领域中的一次革命性进展。它以其独特的构建和筛选系统，彻底改变了抗体制备的传统途径，使抗体工程技术进入了一个新的发展阶段，并对生物学领域中许多技术的发展起到了巨大的推动作用。该技术是迄今发展最成熟、应用最广泛的制备抗体技术。我们简要综述此项技术的研究应用进展。 ［关键词］噬菌体抗体库；抗体人源化；抗体工程技术 ［中图分类号］R392．1［文献标识码］A［文章编号］1009－0002(2010)04－0581－05 Phage Antibody Library Technology and its Application PAN Bo1,2,TONG Yi－Gang1 1．State Key Laboratory of Pathogen and Biosecurity,Beijing Institute of Microbiology and Epidemiology,Beijing 100071;2．College of Veterinary Medicine,Northeast Agricultural University,Haerbin150030;China ［Abstract］Phage－displayed antibody library is a new thchnique which has been developed very rapidly and leads to revolution in the area of antibody engineering in recent years．This technology employes an unique system of antibody construction and screening,and changes the classical method of antibody preparation completely．It pro-motes antibody engineering,into a new developing stage and improves many other technologies in biological fields．So far phage antibody library is the most developed and widely applied technique in the field of antibody prepara-tion．In this review,we focused on the progress of this technique． ［Key words］phage antibody library;antibody humanization;antibody engineers and technicians 抗体是机体防御系统的重要分子，用于识别和清除外来入侵物。自19世纪末发现抗血清能中和细菌毒素以来，制备抗体技术的研究经历了3个发展阶段。第一阶段为抗血清多克隆抗体，即第一代抗体。第二阶段始自1975年德国学者Kohler和英国学者Milstein应用杂交瘤技术制备了鼠单克隆抗体[1]，即第二代抗体。这类抗体具有纯度高、特异性好、能无限传代等优点。然而，当把第二代单克隆抗体应用于人类疾病治疗时，由于单抗的异源性特点，常会引起人抗鼠抗体（human anti－mouse anti-body，HAMA）反应，导致治疗不能持续有效地进行。虽然人们一直希望用这种技术制备出人单克隆抗体，但却因人的染色体易丢失、杂交瘤不稳定、产量低及亲和力差等因素，用人杂交瘤技术[2－3]制备人源单抗进展缓慢。因此，围绕着如何生产人源化单克隆抗体，对现有鼠源性单克隆抗体进行人源化改造等问题，第三代抗体—— —基因工程抗体应运而生，它包括嵌合抗体、改形抗体和用抗体库技术制备的抗体。目前，抗体工程领域中最突出的研究进展就是噬菌体抗体库技术。该技术的出现开创了一条简便、快捷的基因工程抗体生产路线[4]，并在许多领域得到了广泛应用，已显示出强大的生命力。 1噬菌体抗体库技术的基本原理 噬菌体抗体库技术的产生主要依赖于3项技术的进展：一是PCR技术的出现，使人们可以用一套引物，通过RT－PCR，直接从总RNA中克隆出全套免疫球蛋白可变区基因[5]；二是大肠杆菌分泌有结合功能的免疫球蛋白分子片段获得成功[6]；三是建立了噬菌体表面展示技术[7]。在此3项技术的基础上，噬菌体抗体库技术的操作路线变得十分便捷。其 ［收稿日期］2010－01－13 ［作者简介］潘博（1984－），男，硕士研究生， （E－mail）panbo198401＠yahoo．com．cn
噬菌体展示肽库的筛选方法及其应用
噬菌体展示肽库的筛选方法及其应用 1985年,SmithGP利用基因工程手段将一段外源肽序列展示在丝状噬菌体的表面[1]。1988年[2]他们又将合成的随机序列的寡核苷酸片段克隆到丝状噬菌体,表达后每个噬菌体粒子的表面展示一种肽段,所有这些展示不同肽段的噬菌体构成了噬菌体展示肽库。1990年,他们通过亲合筛选,得到了与特定蛋白结合的结合肽,并由于噬菌体表达的肽与编码基因直接相关,扩增和分离目的克隆后,很容易得到其DNA序列[3]。这样就建立了噬菌体表面展示的随机肽库技术,这项技术一经产生就显示其无与伦比的生命力,被广泛用于生命科学的各个领域,并带来广泛而深远的影响。传统的药物筛选大多数是从自然界的动、植物及微生物中分离天然的具有特定药理作用的化学物质,然后直接应用或再以此作为药物化学的先导化合物,再进一步设计、加工、合成,筛选有效的功能药物。此方法具有一定的盲目性,筛选周期长。而采用分子进化工程技术则会大大加速这一过程。根据所需要的药物特性,选用适当的方法构建含有大量异质性分子的组合库,用靶分子进行筛选,先筛选药物先导化合物,然后进一步优化设计,最终确定候选的药物结构。近年来,引入组合策略和模拟进化思想,建立了一种从噬菌体随机肽库中筛选药物先导化合物的新方法[4],即用库容量极大的随机肽库去快速筛选具有较高特异性和亲和力的理想目的肽。通过此种方法可以快速筛选生物活性肽、蛋白质、受体及其他化合物等新型药物或先导化合物。这一方法具有传统的药物筛选无法比拟的优越性,将药物开发带入了一个崭新的时代。1噬菌体展示系统的建立早在1986年Geysen就认为含有关键残基的短肽能够模拟蛋白质上的决定族。在多数情况下,几个关键残基与它的结合分子所形成的非共价键构成了全部结合的主要部分,即蛋白质之间的相互作用或识别是通过局部残基肽段间的相互作用来实现的。1982年,Dulbecco提出将病原体的免疫原与λ噬菌体和其他病毒的衣壳蛋白融合,便可产生能够用作疫苗的表面展示外来多肽的病毒颗粒。1985年,Smith描述了外源肽段在丝状噬菌体fd表面的展示结果。1988年,他们建立了新的表达载体——可选择抗体的丝状噬菌体fd载体,能将外源短肽表达并伸展到噬菌体表面,用亲和筛选可选到表达特异肽的噬菌体,通过测定噬菌体序列,就可以知道所表达肽段的氨基酸序列。这为噬菌体展示肽库的建立提供了技术保障。2噬菌体展示系统的类别噬菌体展示系统因载体和宿主细胞不同分别有:丝状噬菌体展示系统(包括p 、p 和噬菌体粒展示系统)、λ噬菌体展示系统及T4噬菌体展示系统。2.1丝状噬菌体展示系统:丝状噬菌体展示系统是外源基因与g3p或g8p基因融合,并将它以外壳蛋白表面多肽的形式展示出来。它是最早被用来展示外源肽或蛋白质的系统,也是目前应用最广、发展最完善的噬菌体展示系统。丝状噬菌体是单链DNA病毒,其通过与细菌纤毛的相互作用感染宿主细胞,然后将病毒DNA注入细菌的胞质,利用细菌胞质内的酶转变成复制的双链DNA,并通过滚动复制产生子一代DNA分子。噬菌体展示技术正是利用丝状噬菌体DNA的结构和复制特点,把丝状噬菌体M13或fd 作为良好的基因工程的载体。因它的DNA复制与装配不受DNA分子的限制,因此可以将外源DNA插入到其一些非必须区,仅导致噬菌体颗粒的加长,而不影响其感染宿主及装配,这样即可得到一些插入外源DNA的基因重组体。噬菌体还可把插入的DNA片段以融合蛋白的形式表达在衣壳蛋白上。2.2λ噬菌体展示系统:是将外源肽或蛋白质与λ噬菌体的主要尾部蛋白PV或λ噬菌体头部组装的必需蛋白——D蛋白融合而被展示。2.3T4噬菌体展示系统:T4噬菌体展示系统是将外源肽和蛋白质与T4噬菌体的小衣壳蛋白SOC的C端融合而被展示,也有将外源蛋白与T4噬菌体的次要纤维蛋白(Fibritin)的C末端融合而被展示。由于T4噬菌体是在寄主细胞内组装而不必通过分泌途径,因此它可展示的肽/蛋白质范围较广,尤其适合于展示那些不能被E.coli分泌的复杂蛋白质[6]。3噬菌体展示肽库的筛选方法3.1生物淘金法:是目前常用的、最早由Smith等设计的一种筛选方法。将靶分子包被在固相介质上,加入噬菌体肽库与之吸附,洗去非亲和性或低亲和性的噬菌体,回收等亲和性的噬菌体,经过几轮“淘选”,可富集到特异性的噬菌体多肽。用于噬菌体肽库筛选的目标蛋白可以直
抗体库筛选技术介绍
抗体库筛选技术介绍 导读 自从噬菌体展示技术于1985年创立以来，细胞生物学、免疫学、蛋白质工程以及医药行业等领域深受影响。它从根本上了改变了传统的单抗制备流程（杂交瘤技间接术），宣告在体外改良抗体的特异性以及进行亲和力成熟。随着该技术的不断发展，继而出现了核糖体展示、mRNA展示、细菌展示和酵母展示等多种展示技术。这篇文章主要以噬菌体展示抗体库为例，来介绍抗体库的筛选技术。 抗体库的筛选是指从抗体库中筛选出针对某一抗原的特异性抗体，是获得高亲和力抗体过程中的关键环节。 那什么是抗体库呢？通过PCR和DNA重组技术克隆人类或者动物体内全套抗体可变区基因（关于抗体的具体结构详见抗体的基本结构），并通过展示技术进行表达，得到的全套抗体基因表达文库即为抗体库。 图1、抗体库克隆的抗体基因片段（SCFV）
图2、噬菌体展示抗体库构建流程 由于单抗性质的千差万别，抗体库的筛选需要根据不同的单抗制定严格的筛选条件，优化筛选方法，因此抗体库的筛选技术一直处于发展和改进的状态，根据出现时间的先后，主要分为经典筛选法和新型筛选法。 1、经典筛选法 经典筛选法主要包括固相筛选法和液相筛选法，适合针对性质明确并且可纯化的抗原进行抗体筛选。 固相筛选法是通过包被在酶标板或者免疫试管等固相介质上的抗原富集高亲和性的噬菌体；液相筛选法是将生物素化的抗原包被在与亲和素偶联的磁珠或琼脂糖上，通过磁珠富集能与抗原特异性结合的噬菌体抗体，再通过洗涤、洗脱、回收等步骤。如此反复筛选数次，可得到高亲和性的噬菌体。这两种方法可通过添加脱脂牛奶或者BSA来减少非特异性结合。
2、新型筛选法 对于抗原无法提纯或者性质不明确的情况（如癌细胞表面受体），或者经典筛选过程可能造成抗原失活的情况，需要开发新的筛选方法。目前的新型筛选法主要有细胞筛选法、组织切片或体内筛选法、选择感染筛选法和蛋白质芯片筛选法等。 细胞筛选法： 细胞筛选能维持抗原和抗体的天然构象，因此在对肿瘤细胞筛选方面应用较多，该技术还适合于细胞表面受体筛选和抗原鉴定等。但是细胞筛选存在一定的难度，由于细胞膜表面成分复杂，增加了非特异性的结合，筛选的轮次过多又容易丢失特异性结合的抗体。为了减少非特异性结合，细胞筛选法发展出了扣除筛选、竞争筛选和内化筛选等方法。 扣除筛选是通过将抗原阴性细胞在筛选前或筛选后与抗体库结合，从而起到减少非特异性结合。 内化筛选的原理是一些与细胞表面抗原结合的抗体会进入细胞内，因此可以通过细胞的内化来进行抗体筛选。具体操作是先用抗原阴性细胞对待筛抗体库进行扣除筛选，再将抗体库与抗原阳性细胞一起孵育，洗去细胞膜表面结合的抗体，裂解细胞获得细胞内的特异性结合抗体，随后进行扩增与下一轮筛选。 竞争筛选是将过量阴性和阳性抗原同抗体库一起孵育，而针对阳性细胞的回收方法的不同，竞争筛选又分为荧光激活细胞分离法（fluorescently-actiscvated cell sorting, FACS）和免疫磁性细胞分离法（immolunomagnetic cell separation methods）。FACS法是将能待筛抗体标记上荧光素，洗涤，再通过流式细胞仪进行分选。