桶装水中铜绿假单胞菌检测方法的比较

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桶装水中铜绿假单胞菌检测方法的比较

张淑红，吴清平，徐晓可，张菊梅，潘宝怡、彭飞艇

（广东省菌种保藏与应用重点实验室,广东省微生物应用新技术公共实验室,广东省华南应用微生物重点实验室-省部共建国家重点实验室培育基地,广东省微生物研究所，广东广州 510070）

摘要：分别采用传统国标GB/T 8538-2008方法、基于OprL 基因的PCR 方法和环介导等温扩增(LAMP)方法检测桶装水中的铜绿假单胞菌，比较三种方法的检测效果。结果显示，采集的46份市场水样中，用传统GB8538-2008方法检出了3份阳性样品，检出率为6.5%，检测时间至少2天；而PCR 和LAMP 方法都检出4份阳性样品，检出率为8.7%，并且可在24 h 内报告结果。PCR 和LAMP 方法与传统方法相比具有快速灵敏等优点，可用于大批量水样的快速检测和结果初筛。

关键词：铜绿假单胞菌；传统方法；PCR ；LAMP 文章篇号：1673-9078(2011)11-1403-1405

Comparison of Detection of Pseudomonas aeruginosa in Bottled Water

ZHANG Shu-hong, WU Qing-ping, XU Xiao-ke, ZHANG Ju-mei, PAN Bao-yi, PENG Fei-ting

(Guangdong Provincial Key Laboratory of Microbial Culture Collection and Application, Guangdong Open Laboratory of Applied Microbiology, State Key Laboratory of Applied Microbiology (Ministry-Guangdong Province Jointly Breeding

Base ),South China Guangdong Institute of Microbiology, Guangzhou 510070, China)

Abstract: Three methods including traditional method GB/T 8538-2008, PCR assay based on OprL gene and LAMP assay were used to

detect the Pseudomonas aeruginosa in bottled water and the results were compared. It was found that 3 bottled water samples (6.5%) were positive detected by GB8538-2008 method, while 4 bottled water samples were detected positive by both PCR and LAMP methods with the positive rate of 8.7%. As for the test of time, the traditional method need at least 2 days to finish, compared to less than 24h using PCR and LAMP methods. Therefore, PCR and LAMP assays were more rapid and sensitive than traditional method, which may be used for rapid detection of large quantities of water samples.

Key words ：Pseudomonas aeruginosa ; Traditional Method; PCR; LAMP

铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa ）是一种重要的水源性致病菌，广泛存在于各类型水中，对消毒剂、干燥、紫外线等理化因素具有很强的抵抗力，可引起急性肠道炎、脑膜炎、败血症和皮肤炎症等疾病[1~3]。近年来，随着全球范围内桶装饮用水消费量的不断上升，国内外有关铜绿假单胞菌污染桶装水的报道逐渐增多，引起了诸多学者和消费者的普遍关注[4~10]

。目前桶装饮用水铜绿假单胞菌检测技术方面，除传统的生化培养外，PCR 和环介导等温扩增技术（LAMP ）等分子方法逐步建立起来，应用于水样快速检测中。本文通过对市场销售的桶装水进行抽样检测，比较了传统培养法与PCR 和LAMP 方法的特点，为桶装饮用水的快速检测提供参考。

收稿日期：2011-08-01

基金项目：广东省科技计划项目（2009A080209002、2010B031000020）作者简介：张淑红（1978-），女，硕士，助理研究员，研究方向：食品微生物安全检测技术通讯作者：吴清平研究员

1 材料与方法

1.1 样品来源和标准菌株

所检测的46份水样为广州市场销售的各类品牌桶装饮用水（包括34份矿泉水、2份纯净水和10份山泉水），样品均在保质期内。 1.2 主要仪器

SIGMA1-15微量离心机、SIGMA 3K30台式高速冷冻离心机、PE2400 PCR 仪、电泳仪、UV Ⅰ凝胶成像系统、TOMYES-215日本全自动灭菌、移液器、恒温培养箱、FMC-1000恒温水浴锅、超净工作台等。 1.3 主要试剂

DNA Marker2000购自TaKaRa 公司；PCR Mix 购自Fermentas 公司；铜绿假单胞菌LAMP 试剂盒购自华峰生物科技有限公司；琼脂糖购自美国Promega 公司。LB 肉汤、CN 琼脂及配套试剂、乙酰胺肉汤、金氏B(King ′s B)培养基、氧化酶试纸等购自广东环凯微生物科技有限公司。

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1.4 铜绿假单胞菌的传统检测方法

参考《饮用天然矿泉水检验方法》GB/T 8538-2008/54铜绿假单胞菌-滤膜法和ISO16266：2006（E ）水质-铜绿假单胞菌的检测和计数－滤膜法进行检验[11~12]。具体步骤：将250 mL 水样用孔径为0.45 μm 的滤膜过滤，并将滤膜移至CN 琼脂选择性培养基上，36 ±1℃ ℃恒温培养48 h 。铜绿假单胞菌在CN 琼脂出现的菌落形态有3种：有脓青素产生的蓝/绿色、无荧光的菌落，直接判为检出；产生有荧光素的黄色菌落，进一步做产氨(乙酰胺肉汤)试验确认，产氨试验阳性的判为检出；产生红脓素的红褐色、无荧光的菌落，要继续做氧化酶试验、产氨试验、荧光(金氏B 斜面)试验，若氧化酶阳性、产氨试验阳性结果判为铜绿假单胞菌检出。

1.5 铜绿假单胞菌PCR 检测方法

将250 mL 水样用孔径为0.45 μm 的滤膜过滤，将滤膜转移至100 mL LB 肉汤（内含0.02 g 溴化十六烷基三甲胺和1.5 mg 萘啶酮酸），选择增菌18 h 后，吸取1 mL 增菌液，煮沸法提取DNA 。参考文献[13]报道，根据外膜蛋白基因oprL 进行PCR 扩增，引物序列为如下，F ：5’-A TG GAA A TG CTG AAA TTC GGC-3’；5’-CTT CTT CAG CTC GAC GCG ACG-3’，扩增片段大小504bp 。以铜绿假单胞菌A TCC27853为阳性对照。 1.6 铜绿假单胞菌LAMP 检测方法

样品过滤、滤膜增菌和DNA 提取同1.5方法，LAMP 扩增根据华峰生物公司铜绿假单胞菌LAMP 试剂盒说明书进行扩增。

2 结果与分析

2.1 传统检测方法检测结果

采集的46份市场桶装水水样，通过传统国标GB/T 8538-2008方法检测，共检出阳性样本3份（样品编号分别为8#、19#和22#）。3份水样经过膜过滤后，将滤膜转移至CN 平板，36 ℃±1 ℃培养48 h 后，在CN 平板上均长出典型的、有脓青素蓝/绿色无荧光的菌落，经镜检为革兰氏阴性无芽孢杆菌，判断检测结果阳性。

2.2 PCR 和LAMP 方法检测结果 2.2.1 PCR 检测结果

用PCR 方法检测46份桶装水样，结果有4份水样检出铜绿假单胞菌（见图1）。从图1可以看出，样品2#、8#、19#和22#经过PCR 扩增出504bp 大小的目的条带，与对照菌株A TCC27853条带一致，说明检测结果阳性。

图1 实际水样PCR 扩增结果

Fig.1 The PCR result of water samples

注：M-DL2000；1-阴性CK ；2-1#；3-4#；4-8#；5-2#；

6-19#；7-22#；8-阳性CK 。 2.2.2 LAMP 法检测结果

利用华峰生物科技有限公司的LAMP 试剂盒对46份桶装水进行铜绿假单胞菌检测，结果有4份样品检测结果阳性（如图2所示）。其中2#、8#、19#和22#样品经过LAMP 扩增和显色反应后，反应管变为绿色，与对照菌株A TCC27853颜色反应一致，而其他样品为橙色，表明4份样品有铜绿假单胞菌检出。

图2 实际水样LAMP 检测结果 Fig.2 The LAMP result of water samples

注：1-阳性CK ；2-2#；3-8#；4-19#；5-22#；6-15#；7-3#；

8-13#。 2.3 三种方法检测结果的比较

传统方法与分子方法的检测结果见表1。传统方法检测3份阳性样品，检出率6.5%，而PCR 和LAMP 方法检测结果吻合，都检测出4份阳性样品，检出率8.7%。其中2#样品PCR 产物经过测序和GeneBank 数据库Blast 比对，与铜绿假单胞菌相似率大于99%。产物序列如下：

GTGGCTCTGGCCTGGCTGTGGCTGTGGGTTGCTCCTCCA AGGGCGGCGA TGCTTCCGGTGAAGGTGCCAA TGGCGGC GTCGACCCGAACGCAGGCTA TGGCGCCAACAGCGGTGC CGTTGACGGCAGCCTGAGCGACGAAGCCGCTCTGCGTG CGA TCACCACCTTCTACTTCGAGTACGACAGCTCCGACC TGAAGCCGGAAGCCA TGCGCGCTCTGGACGTACACGCG AAAGACCTGAAAGGCAGCGGTCAGCGCGTAGTGCTGGA AGGCCACACCGACGAACGTGGCACCCGCGAGTACAACA

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TGGCTCTGGGCGAGCGTCGTGCCAAGGCCGTTCAGCGCT

ACCTGGTGCTGCAGGGCGTTTCGCCGGCCCAGCTGGAAC TGGTTTCCTACGGTAAAGAGCGTCCGGTCGCCACCGGCC ACGACGAGCAGTCCTGGGCTCAGAACCGTCGCGTCGAG CTTGAAGAAGA 表1 传统方法、PCR 和LAMP 方法检测结果的比较 Table 1 Comparison of traditional method, PCR and LAMP assay 样品来源

（数量）

传统方法 PCR 方法 LAMP 方法

矿泉水（34）

2 3 3 山泉水（10）

1 1 1 纯净水（2）

0 0 0 合计（46）

3 4 4 3 讨论

在饮用水安全问题不断出现的情况下，桶装水以

其天然卫生、不含杂质及添加物得到了众多消费者的

喜爱，家庭和集体场所饮用桶装水己相当普遍。但是

近年来桶装水中铜绿假单胞菌污染问题逐步显现出

来，成为公共卫生的重大隐患。WHO 的HACCP 评

估中明确指出铜绿假单胞菌是婴儿瓶装饮用水的危害

指示菌[14]。国际水质卫生管理方面，美国、加拿大、

巴西、日本、欧洲各国及世界卫生组织/粮农组织

(WHO/FAO)等，均限定瓶装饮用水(包括天然矿泉水

水源)铜绿假单胞菌MPN<3／L 或每250 mL 中不得检

出。我国新修订的《GB 8537-2008 饮用天然矿泉水》

标准中也明确规定每250 mL 水样中铜绿假单胞菌不

得检出，并且要求对每批成品出厂前进行铜绿假单胞菌检测[15]。

目前这些标准中采用的主要是传统生化方法，包括分离培养、生化鉴定等，不能实现大批量水样的快速检测。为进一步拓展和应用分子生物学方法，本文抽查了广州市场上46份各品牌桶装成品水，平行采用传统国标、PCR 方法和LAMP 方法对铜绿假单胞菌进行检测。结果发现，传统国标方法GB8538-2008检出3份阳性样品（8#、19#和22#），而PCR 和LAMP 方法结果一致，都可以检出4份阳性样品（2#、8#、19#和22#）。三种检测方法对8#、19#和22#样品的检测结果吻合，2#样品采用传统的膜过滤和平板培养方法未检出，但是经过PCR 产物测序证明样品中存在铜绿假单胞菌。造成这种差异结果的原因主要有两方面，一方面，分析可能是铜绿假单胞菌处于逆境下的不可

培养态。另一方面，在桶装水中大量死菌存在时PCR

可以检测出（PCR 灵敏度约为103 cfu/mL ），而传统方法分离不到，PCR 检测结果假阳性。事实上，按照国家标准要求，我国饮用水处理工厂的水源水和水处理工艺相对严格，铜绿假单胞菌不可能达到很高的数量，

成品水中存在大量死菌的情况比较少，因此，PCR 检测结果是假阳性的可能性较小，基本是由于活菌数量

增长检测出的结果。很多情况下，铜绿假单胞菌经过

水源水消毒，管道消毒和臭氧消毒后，其活力会大大降低，处于非可培养状态，导致传统方法培养不出和检测结果的假阴性，另外，在受到水中其他杂菌的抑制时也可能导致检测结果的假阴性[16~17]。鉴于此，本文在利用PCR 和LAMP 方法时进行了一定时间增菌（前期试验发现18 h 是两种检测方法最低的增菌时间），以尽量避免或减少检测结果假阴性。

综合比较三种检测方法可以看出，传统方法的检测周期较长，至少2天报告结果，检测灵敏度低，而PCR 和LAMP 方法都可以在24 h 内完成样品检测，具有简便、快速、灵敏等特点。PCR 方法整个过程约需要22 h （包括过滤1 min 、增菌18 h 、过滤1 min 、DNA 提取15 min 、PCR 扩增3 h 、电泳0.5 h ）；LAMP 方法整个检测时间约为19 h （包括过滤1 min 、增菌18 h 、DNA 提取15 min 、LAMP 扩增45 min ）。与其他方法相比，LAMP 方法操作更简单，不需昂贵仪器，仅水浴锅就可以完成，且结果可用肉眼直接观察，已被成功应用于各种食源性致病菌的快速检测[18~19]。同样，在水样检测方面，为提高检测效率，可以将PCR 和LAMP 应用于出厂水样铜绿假单胞菌的快速初筛。参考文献

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（下转第1335页）

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铜绿假单胞菌感染和耐药机制

铜绿假单胞菌感染和耐药机制 [摘要] 铜绿假单胞菌是医院内感染的重要的致病菌之一，它可导致较高的发病率和病死率，铜绿假单胞菌容易出现耐药性，并且容易表达多种毒性因素，这一切使得现在临床上所用的治疗方法常常无效，本文针对这种状况，首先介绍铜绿假单胞菌在临床上引起的常见的感染和疾病，其次介绍铜绿假单胞菌的耐药性机制，最后提出对抑制铜绿假单胞菌耐药性的药物研究的展望。 [关键词] 铜绿假单胞菌耐药性毒性因素药物铜绿假单胞菌是革兰氏阴性杆菌，是条件致病菌，它对健康的机体几乎不会引起感染，但是对免疫受损的机体可以引起严重的感染，免疫受损的机体包括囊性纤维化患者，癌症病人，艾滋病毒感染者，严重烧伤病人[1]。由于传统的抗生素治疗，使铜绿假单胞菌对许多抗生素产生了严重的耐药性，它可以产生各种灭活酶或修饰酶, 如内酰胺酶等; 菌体蛋白结构和功能改变逃避抗菌药物作用; 膜屏障与主动排外;形成生物保护膜等[4]，来抵制抗生素的作用。这也是在临床上很棘手的问题，使铜绿假单胞菌不仅成为难以治疗的病原菌，也使其成为众多研究细菌致病性和耐药性的对象。首先来了解一下铜绿假单胞菌引起的常见的感染和疾病。 1、铜绿假单胞菌引起的常见的感染和疾病在临床上发现呼吸科和烧伤科铜绿假单胞菌感染率和检出率较高。 1.1铜绿假单胞菌相关性肺炎它包括慢性阻塞性肺疾病( COPD)，医院获得性肺炎（CAP），呼吸机相关性肺炎( V AP)，气管镜相关性肺炎，囊性纤维变性（CF）等。慢性阻塞性肺疾病( COPD) 慢性阻塞性肺疾病( COPD) 是以感染为主要表现的疾病, 由于其呼吸道防御功能下降, 支气管清除能力减弱, 故能引起多种细菌的感染, 铜绿假单胞菌感染是COPD 病人急性加重的主要原因。铜绿假单胞菌一开始就被认为是引起慢性阻塞性肺疾病( COPD)的重要的致病菌[10]，Laura 的研究证明铜绿假单胞菌引起COPD病人的慢性感染[11]。医院获得性肺炎（CAP）铜绿假单胞菌在社区获得性肺炎中不常见，但在医院获得性肺炎（CAP）中较常见的病原菌之一[2]。CAP 是COPD 常见并发症和重要死亡原因之一, 近年来国内关于COPD 患者合并CAP 方面的研究得到广泛关注。同时由于社会人口的老龄化、免疫损害宿主增加、病原菌变迁和抗菌药物耐药率上升等原因, 其致病菌的组成和耐药特性在不同国家、不同地区之间存在着明显差异, 而且随着时

铜绿假单胞菌下呼吸道感染诊治专家共识

铜绿假单胞菌下呼吸道感染诊治专家共识铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa，P. aeruginosa，PA）是一种革兰阴性杆菌，也是临床最常见的非发酵菌，在自然界广泛分布，可作为正常菌群在人体皮肤表面分离到，还可污染医疗器械甚至消毒液，从而导致医源性感染，是医院获得性感染重要的条件致病菌，具有易定植、易变异和多耐药的特点。下呼吸道是医院内细菌感染最常见的发生部位，感染种类主要包括支气管扩张合并感染、慢性阻塞性肺疾病（简称慢阻肺）合并感染和肺炎等，由多重耐药PA（multidrug resistant P aeruginosa，MDR-PA）引起的下呼吸道感染病死率高，治疗困难，因此规范PA下呼吸道感染的诊断和治疗具有特别重要意义。一、微生物学特点假单胞菌属为需氧、有鞭毛、无芽孢及无荚膜的革兰阴性杆菌，和不动杆菌属、黄杆菌属、嗜麦芽窄食单胞菌及洋葱伯克霍尔德菌等共同构成非发酵糖（Nonfermenters）革兰阴性杆菌，是常见的条件致病菌，是医院感染的主要病原之一。PA是假单胞菌的代表菌株，占所有假单胞菌感染的70%以上。PA呈球杆状或长丝状，宽约0.5～1.0 μm，长约1.5～3.0 μm，一端有单鞭毛，无芽孢，成双或短链排列。PA能产生多种色素，如绿脓素和荧光素等，专性需氧，部分菌株能在兼性厌氧条件下生长。二、流行病学（一）流行状况近年来，PA感染的流行病学特点突出地表现在两个方面，一是院内感染尤其是肺部感染的发病率不断增加。国内已有多项大型流行病学调查显示我国PA感染的严重性，其中最具代表性的“中国CHINET细菌耐药性监测”资料显示，2012年综合性教学医院PA的分离率占所有分离菌的第5位，2005-2012年PA的分离率分别占革兰阴性菌的11.6%、14.1%、16.9%、16.4%、15.8%、14.8%、14.2%和14.0%，居第2~5位[1]。有13家教学医院参与的中国医院院内获得性细菌耐药性分析（CARES）结果显示，2009年和2011年PA在所有分离细菌中也是居第4位，分离率分别为10.8%和12.6%[2]，且MDR-PA的比例高达12.7%。这一点在呼吸系统感染更为突出，根据美国疾病预防控制中心（CDC）的全国医院感染研究数据显示，PA 肺炎的发生率在逐年升高，1975-2003年医院获得性肺炎（HAP）中PA比例从9.6%上升至18.1%，几乎翻了一倍[3]。一项大规模ICU感染病原学的流行病学调查结果显示，PA是最常见的革兰阴性需氧菌，占23%（8 244/35 790），也是最常见的从呼吸道分离出的细菌（31.6%）[4]。美国一项关于呼吸机相关肺炎（VAP）的回顾性研究结果显示，PA分离率达9.3%。即便得到有效地治疗，PA导致的感染总病死率仍高达42.1%~87.0%，直接病死率为 32.0%~42.8%[5]。2005年胡必杰等[6]报道562例HAP中PA的分离率为18.6%，列第1位；我国近期进行的13家大型教学医院HAP的临床调查结果显示，PA的分离率为20.9%，居第2位[7]。2011年CARES研究也证实HAP中PA的分离率为22.9%，居第2位[2]。二是PA的耐药率居高不下，全球细菌耐药监测数据（SENTRY）显示PA在HAP致病原中居前几位，同时对常用抗菌药物耐药率的逐年升高[8]。中国CHINET 2005-2012年连续监测资料显示，PA对常用抗菌药物的耐药率保持在较高水平，但略呈下降趋势。如亚胺培南的年度耐药率分别为31.0%、42.8%、35.8%、30.5%、30.5%、30.8%、29.1%和29.1%，对美罗培南的年度

铜绿假单胞菌致下呼吸道感染的控制与护理对策

铜绿假单胞菌致下呼吸道感染的控制与护理对策铜绿假单胞菌是革兰阳性杆菌、非发酵菌、假单胞菌属，是医院感染中主要的病原菌之一，本文以神经外科重病室患者铜绿假单胞菌致下呼吸道感染的控制与护理对策展开分析。标签：重病室；铜绿假单胞菌；感染控制；护理对策铜绿假单胞菌广泛分布于医院各种潮湿地方、物品上，对外界环境的抵抗力较其他细菌更强，铜绿假单胞菌可引起泌尿道、伤口、皮肤与软组织等部位感染，其传播途径可来自环境污染（如消毒液、尿壺、尿管等），医务人员的手，患者之间的交叉感染，以及患者自身的内部源性感染，以及患者自身的内部源性感染。铜绿假单胞菌引起医院感染发生率逐年上升，耐药谱广，日益受到重视[1]。2009年在7月～8月在神经外科重病房发现了3例铜绿假单胞菌感染患者，均为下呼吸道感染。流行病学调查结果如下。 1微生物学特点假单胞菌属为需氧、有鞭毛、无芽孢及无荚膜的革兰阴性杆菌和不动杆菌属、黄杆菌属、嗜麦芽窄食单胞菌及洋葱伯克霍尔德菌等共同构成非发酵糖革兰阴性杆菌，是常见的条件致病菌，尤其是医院感染的主要病原之一。PA是假单胞菌的代表菌株，占所有假单胞菌感染的70%以上。PA呈球杆状或长丝状，宽约0.5～1.0 μm，长约1.5～3.0 μm，一端有单鞭毛，无芽孢，成双或短链排列。PA能产生多种色素，如绿脓素和荧光素等，专性需氧，部分菌株能在兼性厌氧条件下生长。 2流行状况国内已有多项大型流行病学调查显示我国PA感染的严重性，其中最具代表性的”中国CHINET细菌耐药性监测”资料显示，2012年综合性教学医院PA的分离率占所有分离菌的第5位，2005～2012年PA的分离率分别占革兰阴性菌的6%，14.1.%、16.9%、16.4%、15.8%、14.8%、14.2%和14.0%，居第2～5位《3b 有13家教学医院参与的中国医院院内获得性细菌耐药性分析（CARES）结果示，2009年和2011年PA在所有分离细菌中也是居第4位，分离率分别为10.8%和12.6%，且MDR-PA的比例高达12.7%。这一点在呼吸系统感染更为突出，美国疾病预防控制中心（CDC）的全国医院感染研究数据显示，PA肺炎的发生率在逐年升高，1975～2003年医院获得性肺炎（HAP）中PA比例从9.6%上升至18.1%，几乎翻了I倍。中国CHlNET 2005～2012年连续监测资料显示，PA对常用抗菌药物的耐药率保持在较高水平，但略呈下降趋势。如亚胺培南的年度耐药率分别为31.0%、42.8%、35.8%、30.5%、30.5%、8%、29.1%和29.1%，对美罗培南的年度耐药率

保健用品微生物检验方法-—铜绿假单胞菌测定

保健用品微生物检验方法第3部分：铜绿假单胞菌测定警示——使用本标准的人员应有正规实验室工作的实践经验。本标准并未指出所有可能的安全问题。使用者有责任采取适当的安全和健康措施，并保证符合国家有关法规规定的条件。 1 范围本标准规定了保健用品中微生物中铜绿假单胞菌的测定方法。本标准适用于生产和经营的保健用品中的铜绿假单胞菌测定。 2 规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB 19489 实验室生物安全通用要求 3 术语和定义下列术语和定义适用于本文件。 3.1 铜绿假单胞菌 Pseudomonas aeruginosa 属于假单胞菌属，为革兰氏阴性杆菌，氧化酶阳性，能产生绿脓菌素。此外还能液化明胶，还原硝酸盐为亚硝酸盐，在42 ℃±1 ℃条件下能生长。 4 试剂和材料除另有规定外，所有试剂均为分析纯。实验用水符合GB/T 6682中二级水的要求。 4.1 灭菌生理盐水:详见附录A.1。 4.2 灭菌液体石蜡:详见附录A.2。 4.3 灭菌吐温-80:详见附录A.3。 4.4 SCDLP:详见附录A.4。 4.5 十六烷基三甲基溴化铵:详见附录A.5。 4.6 乙酰胺:详见附录A.6。 4.7 革兰氏染液:详见附录A.7。 4.8 绿脓菌素测定培养基:详见附录A.8。 4.9 硝酸盐蛋白胨水:详见附录A.9。 4.10 明胶液化培养基:详见附录A.10。

5 仪器和设备 5.1 天平：感量0.1 g。 5.2 灭菌刻度吸管:10 mL、5 mL、1 mL。 5.3 高压灭菌器。 5.4 量筒：100 mL、200 mL、2000 mL。 5.5 恒温水浴箱或隔水式恒温箱:44.5 ℃±0.5 ℃。 5.6 无菌锥形瓶：100 mL、200 mL、250 mL、2000 mL。 5.7 研钵。 5.8 振荡器。 5.9 恒温培养箱：36 ℃±1 ℃、42 ℃±1 ℃、28 ℃±2 ℃。 5.10 接种针、接种环。 5.11 显微镜。 5.12 小倒管。 5.13 玻璃棒。 5.14 冰箱：2 ℃～5 ℃。 6 样品 6.1 样品的采集所采集的样品，应具有代表性，一般视每批保健用品数量大小，随机抽取相应数量的包装单位。检验时，应从不少于2 个包装单位的取样中共取10 g(5.1)或10 mL(5.2)。包装量小于20 g的样品，采样时可适量增加样品包装数量。 6.2 注意事项 6.2.1 供检验样品，应严格保持原有的包装状态。容器不应有破裂，在检验前不得打开，防止样品被污染。 6.2.2 接到样品后，应立即登记，编写检验序号，并按检验要求尽快检验。如不能及时检验，样品应放在室温阴凉干燥处，不要冷藏或冷冻。 6.2.3 若只有一个样品而同时需做多种分析，如微生物、毒理、化学等，则宜先取出部分样品做微生物检验，再将剩余样品做其它分析。 6.2.4 在检验过程中，从打开包装到全部检验操作结束，均须防止微生物的再污染和扩散，所用器皿及材料均应事先灭菌(5.3)，全部操作应在符合生物安全要求的实验室中进行。 6.2.5 如检出铜绿假单胞菌，自报告发出之日起该菌种应保存一个月。 6.3 样品的制备 6.3.1 液体样品水溶性液体样品，用灭菌吸管吸取10 mL加到90 mL（5.4）灭菌生理盐水（4.1）中，混匀后，制成1:10匀液。油性液体样品，取样品10 g，先加5 mL 灭菌液体石蜡（4.2）混匀，再加10 mL灭菌的吐温-80，在 40 ℃～44 ℃水浴中（5.5）振荡混合10 min，加入灭菌的生理盐水75 mL（在40 ℃～44 ℃水浴中预温），在40 ℃～44 ℃水浴中乳化，制成1:10的悬液。

铜绿假单胞菌

铜绿假单胞菌（也称绿脓杆菌）,为革兰阴性杆菌。在自然界分布广泛，对外界环境的抵抗力较其他细菌强，在潮湿环境能长期生存，对干燥也有较强的抵抗力。资料表明，水与铜绿假单胞菌的存在联系紧密。医院内长期潮湿的地方及湿的物品是铜绿假单胞菌贮存的场所。水源污染主要来自人或动物排泄物、人肠道铜绿假单胞菌两个途径。铜绿假单胞菌在污染的水中可较长时间的存留，各种液体药剂，包括眼药水长期放置有可能被铜绿假单胞菌污染，消毒剂、手术器械浸泡液都可能成为铜绿假单胞菌的贮存场所。呼吸机湿化装置及导管可作为传播的直接媒介。铜绿假单胞菌因其生物学特点，营养要求低，潮湿处易生长。大量资料表明医院内病人带菌率很高。人体本身是一个主要的铜绿假单胞菌贮存所，细菌主要存在人体较为潮湿的部位如腋下、会阴部、呼吸道和肠道等。本菌是医院内感染的主要病原菌之一，气管切开和插管、大面积烧伤、恶性肿瘤、免疫力低下、静脉插管及各种侵入性操作的患者易感染本菌，近年来住院患者感染的该细菌多为多重耐药菌，治疗上难度较大。预防措施 1、铜绿假单胞菌感染的患者应实行接触隔离，住隔离病室，隔离标志明确、醒目，在隔离病房或者区域的入口处应配备手套、手消毒凝胶、隔离衣及外科口罩； 2、医务人员接触患者前，戴好口罩、帽子，穿隔离衣； 3、加强医务人员手卫生，接触患者血液、体液、污物后均应洗手。洗手提倡采用流动水洗手，如果手没有明显污染时，可以用消毒凝胶消毒双手；医务人员如手皮肤有破损，不宜护理此类感染性疾病的患者； 4、护士对患者导管的各项操作，应先从清洁的部位开始再到污染的部位，避免交叉污染，如进行可能产生气溶胶的操作（吸痰或雾化治疗、纤维支气管镜等）时必须戴标准外科口罩，必要时带保护性眼罩； 5、进行床旁检查（如便携式照片、心电图、B超）的仪器在检查完成后用消毒剂进行擦拭消毒； 6、如患者需离开隔离病室到医技科室做检查，主管医生应先电话通知该诊疗科室或在检查单上标注患者感染情况，检查完毕患者接触过的物体表面要及时进行消毒处理； 7、隔离病室患者接触过的一切物品，如被单、衣物、各类医疗器械、导管等应先行消毒处理，然后再清洁（洗）、消毒、灭菌； 8、严格医疗废物管理，患者用过的所有敷料、导管等废物须置入专用黄色医疗废物袋内、封口，锐利器具用后及时放入专用利器盒内,集中焚毁。铜绿假单胞菌和不动杆菌属都是医院感染的重要病原菌。近年来临床上出现了两者对所有β内酰胺类及喹诺酮类抗菌药耐药的多重耐药株,造成治疗的极大困难。2004 年5 月美国匹兹

铜绿假单胞菌检查

铜绿假单胞菌检查 1 简述铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa），习称绿脓杆菌，为假单胞菌属菌种，广泛分布在土壤，水及空气中，人和动物的皮肤、肠道、呼吸道均有存在，故可通过环境和生产的各个环节污染药品，本菌是常见的化脓性感染菌、在烧伤、烫伤、眼科及其他外科疾患中长引起继发感染，由于本菌对许多抗菌药物具有天然的耐药性，增加了治疗的难度。国内外药典均将铜绿假单胞菌列为检查项目之一。铜绿假单胞菌按增菌，分离、纯培养、革兰染色、镜检及生化试验等步骤进行检验。 2 仪器、设备和用具（见大肠埃希菌2）。 3 试液、指示液 3.1 0.9%无菌氯化钠溶液或磷酸盐缓冲液[附录3.1，3.3]。 3.2 pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液[附录3.2]。 3.3 1%盐酸二甲基对苯二胺试液[附录2.1]。 3.4 盐酸试液[附录2.12]。 3.5 氯仿[附录1.57]。 4 培养基 4.1 营养肉汤培养基[附录 5.1]。 4.2 胆盐乳糖（BL）培养基[附录 5.6]。 4.3 营养琼脂培养基[附录 5.2]。 4.4 溴代十六烷基三甲胺[附录 5.14]。

4.5 绿脓菌素测定用培养基（POP琼脂）[附录 5.26]。 4.6 明胶培养基[附录3.27]。 4.7 硝酸盐胨水培养基[附录 5.28]。 5 对照用菌液铜绿假单胞菌[CMCC（B）10104]营养琼脂斜面培养物少许，接种至5ml营养肉汤培养基内，于36±1℃培养18～24h后，用0.9%无菌氯化钠溶液稀释至1:106，使对照菌加入量含10～100cfu（一般用量为0.1ml），菌数测定在做阳性对照实验用营养琼脂浇碟或平板涂布经培养后计数确定。 6 操作方法 6.1 供试品的取样量（见细菌、霉菌和酵母菌计数5.3）。 6.2 供试液的制备（见细菌、霉菌和酵母菌计数7）；（大肠埃希菌6.2）。 6.3 增菌培养取胆盐乳糖培养基2份，每份100ml，1份加入1:10供试液10ml（相当于供试品1g或1ml）。另1份加入与供试液等量的稀释剂作阴性对照。于36℃±1℃培养18～24h（必要时可延至48h）。阴性对照菌应无军生长。 6.4 分离培养轻轻摇动上述增菌培养液，以接种环取1～2环培养液（如有菌膜应挑取之），划线接种于溴代十六烷基三甲胺琼脂平板，于36℃±1℃培养18～24h。铜绿假单胞菌在该培养基平板上的典型菌落为扁平、

多重耐药铜绿假单胞菌的感染因素及耐药分析

多重耐药铜绿假单胞菌的感染因素及耐药分析目的探讨我院多重耐药铜绿假单胞菌的感染情况和特点，为临床感染控制提供依据。方法采用梅里埃VITEC2-Compact全自动微生物分析系统进行鉴定和药敏试验，对2013年1月～2015年1月临床各种标本分离出的95株多重耐药铜绿假单胞菌的耐药性及临床资料进行分析。结果95例多重耐药铜绿假单胞菌中，来自患者的痰液标本占78.9%（75/95），其次是伤口表面分泌物，占10.5%（10/95）。感染因素与气管插管、深静脉插管、外伤创面等因素有关。药敏结果分析显示，PA对头孢曲松的耐药率已达95.00%以上，对头孢他定的耐药率也已达到36.30%。结论多重耐药铜绿假单胞菌感染与各种侵入性的导管和器械检查有关，因此，临床进行创伤治疗时，必须制定有效的感染控制措施，并对铜绿假单胞菌感染患者进行连续的耐药监测和患者隔离，控制多重耐药铜绿假单胞菌的扩散和流行。 [Abstract]Objective To explore the infection situation and features of multi-drug resistant Pseudomonas aeruginosa in our hospital and to provided basis for clinical infection control.Methods BioMerieux VITEC2-Compact automatic microbiology analysis system was applied to identify and to conduct the drug sensitive test.The drug resistance and clinical materials of 95 strains of multi-drug resistant Pseudomonas aeruginosa separated from clinical samples from January 2013 to January 2015 were analyzed.Results 78.9% （75/95）of the 95 strains of multi-drug resistant Pseudomonas aeruginosa were separated from sputum samples，followed by secretion of wounds （10.5%，10/95）.Trachea intubation，deep venous cannula，and trauma wound were significant infection factors.Drug sensitivity results showed that the drug resistance of ceftriaxone was over 95.00%，and the resistance rate of ceftazidime was 36.30%.Conclusion Infection of multi-drug resistant Pseudomonas aeruginosa is related to various invasive catheters and instrumental examinations.Therefore，in the treatment of trauma，effective infection control measures should be formulated to conduct continuous drug resistance monitoring and isolation of those infected with Pseudomonas aeruginosa and to control the spread and prevalence of multi-drug resistant Pseudomonas aeruginosa. [Key words]Multi-drug resistant；Pseudomonas aeruginosa；Infection control 铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa，PA）俗称绿脓杆菌，广泛存在于自然界、各种医疗器械及导管表面，是院内感染的常见病原菌[1]。由于抗菌药物的不合理应用，使得PA产生多种耐药机制，出现大量的多重耐药菌株，治疗效果很不理想，因此，有效预防多重耐药菌的出现是控制感染的关键。 1资料与方法 1.1一般资料

铜绿假单胞菌对碳青霉烯类耐药的机制及临床研究

铜绿假单胞菌对碳青霉烯类耐药的机制及临床研究[关键词] 铜绿假单胞菌；耐药性；美罗培南；亚胺培南各种抗假单胞菌药物在治疗铜绿假单胞菌感染过程中或治疗后可出现不同程度的耐药导致治疗失败，但各种药物诱导耐药的相对危险性可有差异。了解铜绿假单胞菌对碳青霉烯类耐药的机制，及时掌握新的耐药动向及其相关因素，有助于制定切合实际的控制耐药方案。 1铜绿假单胞菌对碳青霉烯类耐药的机制 OprD为铜绿假单胞菌外膜孔道蛋白，可被动性摄取碱性氨基酸，亦可渗透碳青霉烯类药物。对亚胺培南的渗透率为736nm／s，对美罗培南为73nm／s，表明亚胺培南透入铜绿假单胞菌比美罗培南快10倍。OprD丢失后，两者的渗透率分别为6nm／s及5.5nm／s，对亚胺培南的MIC从1-2mg／L上升到8-32mg ／L，对美罗培南的MIC从0.12～0.5mg／L上升到2~4mg／L。铜绿假单胞菌OprD丢失或下降是介导对亚胺培南耐药的主要机制，对美罗培南的影响较少可能与通过尚未确定的通道进入菌体有关。因单纯OprD丢失不影响对非碳青霉烯类药物的敏感性，属窄谱耐药机制。亚胺培南为强力β-内酰胺酶诱导剂，诱导铜绿假单胞菌产生Bush IB-内酰胺酶，Bush I酶可快速水解抗假单胞菌头孢菌素类及青霉素类药物，但对亚胺培南只具缓慢水解作用。铜绿假单胞菌外膜孔道蛋白(OprD)丢失可引起对亚胺培南耐药，但若单纯OprD丢失而无β一内酰胺酶参入，则对亚胺培南的MIC只由0.25mg ／L增至0.5mg／L，若OprD丢失同时伴口一内酰胺酶的作用，则可使其MIC 增至16mg／L，表明β-内酰胺酶与渗透性改变介导对亚胺培南耐药具协同作用。美罗培南比亚胺培南对β-内酰胺酶更稳定，OprD丢失伴β-内酰胺酶作用仅使铜绿假单胞菌对美罗培南的MIC增至2-4mg／L。产金属β-内酰胺酶的菌株亦可能需要OprD丢失才对碳青霉烯类耐药，虽然产金属酶类药物仍属少见，但正在成为铜绿假单胞菌对亚胺培南及美罗培南高度耐药的原因，并可能成为今后严重的问题。 MexB蛋白为广谱泵，位于胞浆膜中，OprM为孔道蛋白通过外膜的出口，MexA为连接蛋白。在mexR位nalB突变导致MexAB-OprM上调最为常见。MexAB—OprM具天然清除双歧性分子(对胞浆膜有损害作用)的功能，并演变具特殊性。因亚胺培南无嗜脂苯或杂环侧链，故MexB不能识别亚胺培南，亦不能外排，但美罗培南具有2’杂环侧链，可被MexB识别，并被外排。MexAB-OprM 上调是介导对美罗培南耐药的主要机制，可使美罗培南的MIC从0.12～0.5mg ／L上升到2-4mg／L。MexAB-OprM高表达能影响对美罗培南的抗菌活性，而对亚胺培南则无影响。还有MexXY-OprM及MexCD—OprJ上调都可引起对美罗培南敏感性降低，亦不影响对亚胺培南的敏感性，且与MexAB-OprM一样都可引起对喹诺酮类及其他β-内酰胺酶类耐药，MexXY-OprM上调还可引起对氨基苷类耐药。另一泵出系统MexEF-OprN是由nfxc突变上调，不常见，对美罗

铜绿假单胞菌的传播途径

（一）铜绿假单胞菌的传播途径： 1、水源：水与铜绿假单胞菌的存在联系紧密。水源污染主要来自人或动物排泄物、人肠道铜绿假单胞菌两个途径。铜绿假单胞菌在污染的水中可较长时间的存留，各种液体药剂，包括眼药水长期放置有可能被铜绿假单胞菌污染，消毒剂、手术器械浸泡液都可能成为铜绿假单胞菌的贮存场所。呼吸机湿化装置及导管可作为传播的直接媒介。 2、环境：医院内长期潮湿的地方及湿的物品是铜绿假单胞菌贮存的场所。洗涤槽，防腐溶液和贮尿容器中常可发现这种细菌。 3、医护人员：通过医护人员（手）可将病菌传给病人，特别在灼伤和新生儿重症监护室。 4、特殊的病人：人体本身是一个主要的铜绿假单胞菌贮存所，细菌主要存在人体较为潮湿的部位如腋下、会阴部、呼吸道和肠道等。HIV感染、气管切开和插管、大面积烧伤、恶性肿瘤、免疫力低下、静脉插管、留置导尿及各种侵入性操作的患者易感染本菌。（二）铜绿假单胞菌的预防措施： 1、铜绿假单胞菌感染的患者应实行接触隔离，住隔离病室，隔离标志明确、醒目，在隔离病房或者区域的

入口处应配备手套、手消毒凝胶、隔离衣及外科口罩； 2、医务人员接触患者前，戴好口罩、帽子，穿隔离衣； 3、加强医务人员手卫生，接触患者血液、体液、污物后均应洗手。洗手提倡采用流动水洗手，如果手没有明显污染时，可以用消毒凝胶消毒双手；医务人员如手皮肤有破损，不宜护理此类感染性疾病的患者； 4、护士对患者导管的各项操作，应先从清洁的部位开始再到污染的部位，避免交叉污染，如进行可能产生气溶胶的操作（吸痰或雾化治疗、纤维支气管镜等）时必须戴标准外科口罩，必要时带保护性眼罩； 5、进行床旁检查（如便携式照片、心电图、B超）的仪器在检查完成后用消毒剂进行擦拭消毒； 6、如患者需离开隔离病室到医技科室做检查，主管医生应先电话通知该诊疗科室或在检查单上标注患者感染情况，检查完毕患者接触过的物体表面要及时进行消毒处理； 7、隔离病室患者接触过的一切物品，如被单、衣物、各类医疗器械、导管等应先行消毒处理，然后再清洁（洗）、消毒、灭菌； 8、严格医疗废物管理，患者用过的所有敷料、导管等废物须置入专用黄色医疗废物袋内、封口，锐利器具用后及时放入专用利器盒内,集中焚毁。

铜绿假单胞菌治疗策略

铜绿假单胞菌感染治疗策略铜绿假单胞菌作为一种条件致病菌常定植于正常人的呼吸道,皮肤粘膜以及医疗设备等处。当患者免疫力低下,长期使用广谱抗生素,糖皮质激素及接受吸氧、气管插管机械通气时,铜绿假单胞菌大量繁殖,往往导致严重下呼吸道感染。因为铜绿假单胞菌的耐药及复发率高,故临床治疗较为困难。为更好地预防和控制医院感染，建议应采取以预防为主，加强对铜绿假单胞菌的耐药性监测，及早进行菌株鉴定和药敏检测，避免大量和长期使用同一类型的抗菌药物，并规范抗菌药物的应用，具体措施如下：一、阻断病原菌播散医院加强对高危患者的病原菌监测，尤其将下列患者列为目标监测的重点：住在ICU、接受过广谱抗菌药物治疗或抗菌药物治疗效果不佳的患者，留置各种导管以及合并慢性基础疾病的患者。对目标监测患者进行主动筛查和定期监测，及时发现、早期诊断铜绿假单胞菌感染与定植患者。如：患者的呼吸道长期定植铜绿假单胞菌，到多家医院就诊导致其克隆传播，致使不同医院间存在同一克隆株的PA,因此，加强对铜绿假单胞菌定植患者的监控，是控制克隆株播散的关键。有文献报导PA克隆朱主要在ICU病房流行，原因可能为ICU住院患者病情重、自身免疫力低下，多接受过侵入性治疗，因此，加强病区（尤其是重点科室）的消毒、隔离和监控工作，阻断外源性传播媒介，是有效控耐药PA在医院感染发生和流行的重要途径。二、加强监测抗铜绿假单胞菌的药物及其敏感性

目前可用于治疗铜绿假单胞菌感染的药物基本有六类：青霉素类、头孢菌素类、碳青霉烯类、单环β-内酰胺类，氨基糖苷类和喹诺酮类，另外多黏菌素类(如黏菌素，多黏菌素B)以及磺胺类(甲磺灭脓、磺胺嘧啶银)主要用于铜绿假单胞菌的局部感染的治疗。多黏菌素B也用于难治性的铜绿假单胞菌感染的全身治疗。2011年中国C H IN E T铜绿假单胞菌耐药性监测显示铜绿假单胞菌对阿米卡星的耐药率最低，为14．3%，对头孢哌酮和氨曲南的耐药率最高，分别为31.7%和38.9%，对其他抗菌药物的耐药率为19～30%，耐药率从低到高依次为：阿米卡星<头孢吡肟<头孢他啶<头孢哌酮一舒巴坦<环丙沙星<哌拉西林一他唑巴坦<庆大霉素<美罗培南<亚胺培南<哌拉西林<头孢哌酮<氨曲南。（1）青霉素类药物包括哌拉西林、哌拉西林/他唑巴坦、美洛西林、替卡西林、替卡西林／克拉维酸，其中以哌拉西林最常用于铜绿假单胞菌导致的肺部感染。（2）头孢菌素类药物包括头孢他啶、头孢吡肟、头孢哌酮、头孢匹胺是铜绿假单胞菌的敏感药物。头孢他啶是目前针对铜绿假单胞菌作用最强的药物，头孢吡肟对铜绿假单胞菌的作用与头孢他啶相似，头孢哌酮对铜绿假单胞菌有良好的抗菌作用，可用于铜绿假单胞菌感染的联合治疗用药，头孢匹胺对铜绿假单胞菌的作用与头孢哌酮和哌拉西林相似或略优。（3）碳毒霉烯类药物该类药物抗菌谱特别广，抗菌活性强。治疗PA感染应首选敏感药物碳青霉烯类，并且初始剂量宜大，以增强其

铜绿假单胞菌产生耐药性的机制

综述中国生化药物杂志2016年第12期总第36卷D O I：10.3969/j.issn. 1005-1678. 2016. 12.058 铜绿假单胞菌产生耐药性的机制孟鑫，尚德静& (辽宁师范大学生命科学学院，辽宁大连116081) [摘要]铜绿假单胞菌鳳s aeru扣而a，_P.aeru扣而a)与其它革兰氏阴性菌相比，其外膜渗透性低，并且多种耐药机制协同作用，更容易表现出对大多数抗生素极低的易感性，从而加入了 “超级细菌”的行列。最近使用突变体库筛选，微阵列技术和突变频率分析已经证实在体内生长条件或复杂的适应条件下（如b io film生长或群体迁移），抗生素本身也能够诱发非常大的基因团簇突变从而导致耐药性以及新的适应性抗性。 [关键词]铜绿假单胞菌耐药性适应性抗性 [中图分类号]R453.2 [文献标识码]A Mechanism of drug resistance of P seudom onas aeruginosa MENG Xin, SHANG De-jingA (Faculty of Life Science,Liaoning Normal University,Dalian 116081 ,China) [A b s t r a c t]Pseudomonas aeruginosa exhibits an inherently reduced susceptibility to most antibiotics compared with most other Gram-negative bacterial species because its low outer membrane permeability and the multiple ways in which P. aeruginosa can become drug-resistant. Pseudomonas has joined the “super bacteria”. Recent researches, using mutant library screening, microarray technology, and mutation frequency analysis have demonstrated that antibiotics themselves can induce very large groups of genes in vivo growth conditions or complex adaptation conditions ( for example, biofilm growth or swarming motility) , resulting in resistance as well as new forms of adaptive resistance. [K e y w o r d s] Pseudomonas aeruginosa；resistance ；adaptive resistance 自临床引人抗生素并滥用抗生素以来，细菌具有越来越复杂的耐药性，导致“超级细菌”的出现和扩散，几乎对市场上所有可用的抗菌药物都有一定的抗性。铜绿假单胞菌 aeru扣而a)是革兰氏阴性细菌，可以广泛感染动植物宿主[1]，常见的医院感染中有10 ~ 15%是由其引起的[2]，主要引起了囊性纤维化(cystic fibrosis，CF)患者的慢性肺部感染[33]。此夕卜，P.aerugi/WMa是呼吸机相关性肺炎（ventilator associated pneumonia,VAP)最常见的致病菌之一[5_6]，_P.引起的肺炎，常常导致急性肺损伤和继发性脓毒症，造成高死亡率[7_11]。与其他病原体相比，对多种抗生素（包括氨基糖苷类，氟喹诺酮类和P-内酰胺类）显示出较强的内源性抗性。例如:对羧苄青霉素的内源性抗性使得大多数P-内酰胺类（包括美罗培南而非亚胺培南）抗生素的最小抑菌浓度（minimum inhibitory concentmtion，MIC)增加4 倍；对非p-内酰胺抗生素如喹诺酮，甲氧苄氨嘧啶，四环素和氯霉素也有一定的内源性抗作者筒介:孟鑫，女，硕士在读，研究方向:分子遗传学,E-m ail: 1317302082@ https://www.360docs.net/doc/9314585522.html,;尚德静，通信作者，女，博士，教授，博士生导师，研究方向：生物化学与分子生物学，E-mail :djshang@ lnnu. edu. cn。性。这种内源性抗性主要源于其极低的外膜渗透性或外排系统被激活产生的去抑制作用。f*.外膜中存在大量无效的成孔蛋白，限制了抗生素分子穿人细胞的速度[12]，使得次级适应性抗性机制能更有效地运行，如增加外排功能和酶对抗生素的修饰。这些内在机制是遗传组成的一部分，可以通过突变来稳定或增强，有些突变影响耐药性基因的表达及产物的活性从而导致M IC变大，使许多常见的抗生素对P. aeragimwa没有效果，其他突变可能轻微地增加耐药性，使P. aeragmosa在大多数抗生素作用下的易感性逐渐降低，此外，一些菌株还可以通过水平转移（即菌株之间）抗性基因决定簇增加耐药性。除了内源性抗性这种比较传统的耐药机制，近年来发现P. aeragiraosa对不断变化的环境条件和胁迫有很强的适应性，也可以引起对抗生素的适应性抗性，如接触抗生素，改变培养基条件或改变生长状态等[13]，这种适应性抗性的现象早就报道过，然而，最近才研究其对临床问题的广泛适用性。虽然抗生素对多数由aeragimwa引起的感染有效，但是其仍可以通过多种方式产生耐药性，导致耐药率不断增加，加之 —200—

铜绿假单胞菌分布及耐药性分析

铜绿假单胞菌分布及耐药性分析发表时间：2011-08-03T16:04:13.653Z 来源：《中国健康月刊（学术版）》2011年第6期供稿作者：樊剑吴稷高咏梅李敬梅刘云秀陈艳玲 [导读] 铜绿假单胞菌广泛分布于自然界、正常皮肤、肠道、呼吸道、医院病房及医疗器械等樊剑吴稷高咏梅李敬梅刘云秀陈艳玲【摘要】目的:了解本地区铜绿假单胞菌的耐药性，为临床合理选用抗菌药物提供依自动微生物鉴定/药敏分析仪进行培养、分离、鉴定及药敏试验。对分离80株铜绿假单胞菌的分布及细菌耐药性进行回顾性分析。结果细菌检出最高分别为大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞菌。铜绿假单胞菌在痰液标本中分布最高为86.25%。铜绿假单胞菌对头孢哌酮、头孢曲松、哌拉西林、耐药率分别为50.00%、46.15%、45.45%，耐药率低的是左氧氟沙星、亚胺培南、氨曲南、头孢吡肟、头孢他啶，耐药性分别是为18.42%、21.79%、21.79%、23.1%、25.79%。结论铜绿假单胞菌为医院呼吸道感染的常见致病菌，对多种抗菌药物呈不同程度耐药，应加强其耐药性的监测，合理使用抗菌药物。【关键词】铜绿假单胞菌；耐药性；感染；抗菌药物【中图分类号】R886【文献标识码】B【文章编号】1005-0515(2011)06-0159-02 铜绿假单胞菌广泛分布于自然界、正常皮肤、肠道、呼吸道、医院病房及医疗器械等，是临床上常见的条件致病菌，因其易定植、易变异、以及多重耐药性的特征，已逐渐成为医院感染的主要致病菌之一。特别是呼吸道感染感染多见，由于该菌属有多重耐药性，给治疗带来很多困难。王以光等报道[1]铜绿假单胞菌对目前临床应用的100种抗生素均显示有抗药性，是新世纪对人类生命造成威胁的3种细菌之一。为探讨铜绿假单胞菌感染分布及耐药现状，我们对本地区2008年1月~12月本院临床送检标本中分离的80株铜绿假单胞菌在标本中的分布及常用抗菌药物的耐药性进行统计分析，为合理选用抗菌药物提供依据。 1资料与方法 1.1标本来源来自我院2009年1月~ 12月临床送检标本，包括血、尿、痰及各种分泌物。 1.2菌株的培养、分离、鉴定、药敏试验采用英国Aris 全自动微生物鉴定/药敏分析仪，配套鉴定及药敏板，药敏板完全符合NCCLS 标准。 1.3质控菌株铜绿假单胞菌ATCC27853，大肠埃希菌ATCC25922，肺炎克雷伯菌ATCC700603 1.4采用回顾性统计分析。 2结果 2.1细菌检出情况:共送检标本1985份，阳性标本703份，检出率为35.41%。在检出的703株检出率排在前3位的是：大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞菌。 2.2检出的铜绿假单胞菌在送检标本中的分布情况见表1

铜绿假单胞菌治疗策略完整版

铜绿假单胞菌治疗策略 HEN system office room 【HEN16H-HENS2AHENS8Q8-HENH1688】

目前可用于治疗铜绿假单胞菌感染的药物基本有六类：青霉素类、头孢菌素类、碳青霉烯类、单环β-内酰胺类，氨基糖苷类和喹诺酮类，另外多黏菌素类(如黏菌素，多黏菌素B)以及磺胺类(甲磺灭脓、磺胺嘧啶银)主要用于铜绿假单胞菌的局部感染的治疗。多黏菌素B也用于难治性的铜绿假单胞菌感染的全身治疗。2011年中国C H IN E T 铜绿假单胞菌耐药性监测显示铜绿假单胞菌对阿米卡星的耐药率最低，为14．3%，对头孢哌酮和氨曲南的耐药率最高，分别为%和%，对其他抗菌药物的耐药率为19～30%，耐药率从低到高依次为：阿米卡星<头孢吡肟<头孢他啶<头孢哌酮一舒巴坦<环丙沙星<哌拉西林一他唑巴坦<庆大霉素<美罗培南<亚胺培南<哌拉西林<头孢哌酮<氨曲南。（1）青霉素类药物包括哌拉西林、哌拉西林/他唑巴坦、美洛西林、替卡西林、替卡西林／克拉维酸，其中以哌拉西林最常用于铜绿假单胞菌导致的肺部感染。（2）头孢菌素类药物包括头孢他啶、头孢吡肟、头孢哌酮、头孢匹胺是铜绿假单胞菌的敏感药物。头孢他啶是目前针对铜绿假单胞菌作用最强的药物，头孢吡肟对铜绿假单胞菌的作用与头孢他啶相似，头孢哌酮对铜绿假单胞菌有良好的抗菌作用，可用于铜绿假单胞菌感染的联合治疗用药，头孢匹胺对铜绿假单胞菌的作用与头孢哌酮和哌拉西林相似或略优。（3）碳毒霉烯类药物该类药物抗菌谱特别广，抗菌活性强。治疗PA 感染应首选敏感药物碳青霉烯类，并且初始剂量宜大，以增强其迅速的杀菌能力和延长药物浓度依赖性的药物后效应。

铜绿假单胞菌下呼吸道感染诊治专家共识汇总

铜绿假单胞菌下呼吸道感染诊治专家共识中华医学会呼吸病学分会感染学组）是一种革兰阴性杆菌，也是临床最常PA，P.aeruginosa，铜绿假单胞菌（Pseudomonasaeruginosa见的非发酵菌，在自然界广泛分布，可作为正常菌群在人体皮肤表面分离到，还可污染医疗器械甚至消毒是医院获得性感染重要的条件致病菌，具有易定植、易变异和多耐药的特点。液，从而导致医源性感染.下呼吸道是医院内细菌感染最常见的发生部位，感染种类主要包括支气管扩张合并感染、慢性阻塞性）MDR-PA Paeruginosa，肺疾病（简称慢阻肺）合并感染和肺炎等，由多重耐药PA（multidrug resistant下呼吸道感染的诊断和治疗具有特别重要的意义。因此规范PA引起的下呼吸道感染病死率高，治疗困难，一、微生物学特点假单胞菌属为需氧、有鞭毛、无芽孢及无荚膜的革兰阴性杆菌和不动杆菌属、黄杆菌属、嗜麦芽窄食单胞菌及洋葱伯克霍尔德菌等共同构成非发酵糖革兰阴性杆菌，是常见的条件致病菌，尤其是医院感染的主要病原之一。0.5~1.0呈球杆状或长丝状，宽约以上。PAPA是假单胞菌的代表菌株，占所有假单胞菌感染的70%能产生多种色素，如绿脓素和荧PA.成双或短链排列。xm，—端有单鞭毛，无芽孢（xm，长约1.5~3.0（光素等，专性需氧，部分菌株能在兼性厌氧条件下生长。二、流行病学（一）流行状况感染的流行病学特点突出地表现在两个方面，一是院内感染，尤其是肺部感染的发病率PA近年来，CHINET中国感染的严重性，其中最具代表性的“不断增加。国内已有多项大型流行病学调查显示我国PA年—2012的分离率占所有分离菌的第5位，2005资料显示，细菌耐药性监测”2012年综合性教学医院PA，和14.0%、14.8%、14.2%，14.1%，16.9%、16.4%、15.8%PA的分离率分别占革兰阴性菌的11.6%2~5位。居第20112009年和家教学医院参与的中国医院院内获得性细菌耐药性分析（CARES）结果显示，有1312.7%。且MDR-PA的比例高达4位，分离率分别为10.8%和12.6%m，年PA在所有分离细菌中也是居第肺炎）的全国医院感染研究数据显示，PA这一点在呼吸系统感染更为突出，美国疾病预防控制中心（CDC，几乎翻18.1%比例从9.6%上升至—19752003年医院获得性肺炎（HAP）中PA的发生率在逐年升高，倍。了123%是最常见的革兰阴性需氧菌，占ICU感染病原学的流行病学调查结果显示，PA一项大规模）。8244/35790），也是最常见的从呼吸道分离出的细菌（31.6%（。即便得到有效的9.3%）的回顾性研究结果显示.PA分离率达美国一项关于呼吸机相关性肺炎（VAP。，直接病死率为32.0%~42.8%治疗，PA导致的感染总病死率仍髙达42.1%~87.0%家大型教13位；我国近期进行的18.6%，列第1PA2005年胡必杰等报道562例HAP中的分离率为2位。，居第的临床调查结果显示，PA的分离率为20.9%学医院HAP 的耐药率居高不下，位。二是PA的分离率为22.9%，居第22011年CARES研究也证实HAP中PA致病原中居前几位，同时对常用抗菌药物的耐药率逐在HAPSENTRY）显示，PA全球细菌耐药监测数据（年升高。对常用抗菌药物的耐药率保持在较高水平，但略年连续监测资料显示，PACHINET2005—2012中国29.1%，30.5%、30.8%42.8%、35.8%、30.5%、呈下降趋势。如亚胺培南的年度耐药率分别为31.0%、25.0%，，25.8%28.5%，24.5%、25.2%和29.1%，对美罗培南的年度耐药率分别为32.0%、34.1%， 1.5%。2012年分别达到1.8%和和27.1%，但其中全耐药（PDR）菌株数量显著增多，在2011年和，这一点在呼吸系22.1%对亚胺培南和美罗培南的耐药率达29.3%和CARES2011年研究也证实PA和70.7%PA对亚胺培南和美罗培南的耐药率分别高达统感染中更为突出，我国HAP临床调查结果显示，PA对碳青霉烯类的耐药率。，远高于48.8%CHINET监测中各种标本分离菌中对PA年的中国CHINET资料显示2012PA 对于其他具有抗假单胞菌活性的药物敏感度也不容乐观，，19.8%，舒巴坦、头孢他啶、环丙沙星和哌拉西林--他唑巴坦的耐药率分别为13.5%阿米卡星、头孢哌酮。和、19.6%17.9%17.5% 1